免疫刺激剂的制作方法

本发明涉及具有良好的免疫刺激作用和用作免疫刺激剂(尤其是佐剂)的化合物、含有该化合物的组合物和含有该化合物和抗原的疫苗。

背景技术：

疫苗包括活疫苗，其中病原体毒性减弱；全颗粒疫苗(whole particle vaccine)，其中病原体是灭活的；和裂解疫苗，其中病原体被分解且只有特定的成分被提取和纯化。其中，裂解疫苗需要添加称为佐剂的化合物或组合物以增强其免疫刺激能力。此外，近年来研究和开发渐增的粘膜疫苗、癌症疫苗和用于一些过敏的疫苗也需要添加用于其效果表达的佐剂。目前在国内批准的佐剂的实例包括作为沉淀佐剂的铝盐(氢氧化铝凝胶等)、作为油性佐剂的角鲨烷、为脂多糖LPS变体的MPL，其为本质上具有免疫原性的革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的组成成分。针对衍生自CpG和Poly I:C等的核酸、活化Toll样受体(TLR)的细菌组成成分的变体、刺激免疫系统等的细胞因子的变体等，在全球范围内佐剂的研究和开发也越来越多。但是，包括在国内已经批准的那些现有佐剂以及正在研究和开发的那些佐剂均具有以下问题。

对于为沉淀佐剂的铝盐而言，所述佐剂的作用在一些疫苗中，例如流感HA疫苗、口蹄疫疫苗等中遭到质疑。此外，从安全方面考虑，已知铝盐通常在接种部位显示肉芽形成、造成高免疫球蛋白E血症等。对于油性佐剂，例如角鲨烯等，由于乳化使粘度增加，因此接种有时可能是疼痛的，并且，由于其在体内具有抗分散的性质并滞留在接种部位，因此接种部位有时会硬化。另一方面，由于MPL是具有免疫原性的LPS的变体，因此同时接种疫苗有时会引起剧烈的炎性反应并有时伴有疼痛和发烧。此外，正在研究的佐剂也仍然具有安全问题，例如诱导过敏、剧烈的炎性反应、引起发烧等。对于核酸佐剂，正在面临新的问题，例如作为药物产物合成的问题，例如，难以化学合成达到被认为提供有效的佐剂作用的链长度等等。尽管佐剂被要求要同时表现有效性和安全性，但是国内已经批准的常规佐剂和正在研究和开发中的那些佐剂均无法完全满足这种情况下的要求。

与此同时，国立变态反应与传染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID)针对疫苗佐剂的安全性指出以下12点。1)不会诱导自身免疫反应，2)无与人抗原具有交叉反应性的抗原，3)不会诱导变应性过敏反应，4)应是化学合成纯的，5)无致癌性，6)不会诱导除目标免疫应答之外的应答，7)应为在体内被快速代谢的物质，8)无论何种接种方法，应为安全的，9)应无致畸性和生殖毒性，10)应具有至少一年的储存稳定性，11)应根据对象进行选择，12)应耐受低频率产生的副作用。此外，在EMEA(欧洲医药局)的准则中，所述EMEA是负责欧洲疫苗检测的组织，列举了1)接种点的组织损伤和肉芽肿形成，2)过敏(hypersensitivity)和过敏性反应(anaphylaxis)，3)致热原性，4)全身毒性，5)生殖毒性，6)遗传毒性(只就合成性佐剂而言)作为单独佐剂的非临床毒性试验。尽管一些部分是共同的或者在美国和欧洲之间不是共同的，但是至少从现在开始所研发的疫苗佐剂应满足这些要求。

对于具有免疫调节作用的化合物而言，例如，专利文献1-7和非专利文献1–4中所述的化合物，在之前已经被报道。尽管专利文献1的实施例25描述了一种化合物，其中对应于下式(I)中的R³和R⁴的基团为十一基(C₁₁烷基)，但是该化合物不同于式(I)代表的化合物且其佐剂活性不足。尽管专利文献2的实施例3描述了一种化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为不饱和烃基(C₁₇链烯基)，但是该化合物也不同于式(I)代表的化合物且其佐剂活性不足。尽管专利文献3的表1和2公开了一种化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为被酮基或羟基取代的长链烷基(C₃₅烷基)，但是该化合物也不同于式(I)代表的化合物，且该化合物在盐水等中的分散性根本没有进行研究，且没有任何报道关于通过将所述化合物与α-环糊精结合来提高分散性从而增强其效果。

专利文献7公开了N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二叔丁酯(化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₅烷基)，其为可用于疫苗佐剂的化合物的合成中间体；但是，其免疫调节作用并未报道，且没有报道指明其作为免疫刺激剂或佐剂的用途。尽管N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₅烷基，CAS登记号：73793-92-7，描述于非专利文献1)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基，CAS登记号：121074-91-7和896442-54-9，描述于非专利文献2)是已知的化合物；但是，它们的免疫调节作用并未被报道，且没有任何报道指出其作为免疫刺激剂或佐剂的用途。

另一方面，非专利文献4报道了评估叶绿醇及其衍生物的佐剂活性的结果。该文献描述β-环糊精用于在细胞增殖抑制测试中溶解叶绿醇；但是，未使用β-环糊精来评估抗原特异性抗体的产生。此外，在非专利文献4中未描述或暗示α-环糊精。

文献列表

专利文献

专利文献1：JP-A-4-230359

专利文献2：JP-A-59-219262

专利文献3：JP-A-63-264444

专利文献4：JP-A-62-63600

专利文献5：JP-A-5-507705

专利文献6：JP-A-11-302250

专利文献7：JP-A-5-186419

非专利文献

非专利文献1：Cybulla，J.等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 1980，92(4)，1389-96

非专利文献2：Zeelen，F.J.等人，Recueil des Travaux Chemiques des Pays-Bas et de la Belgique 1958，77(3)，267-72

非专利文献3：Roth，A.等人，Bioconjugate Chem.，2004，15，541-553

非专利文献4：Y.Aachoui等人，Cellular Immunology 271(2011)308-318

技术实现要素：

本发明所解决的问题

本发明的目的是提供具有免疫刺激作用并用作免疫刺激剂，尤其是用作佐剂的化合物和含有该化合物的组合物，和含有所述化合物和抗原的疫苗。

解决问题的方式

为了解决上述问题，本发明人已进行了深入研究并发现下式(I)所代表的化合物(下文有时称为本发明化合物或化合物(I))具有良好的免疫刺激作用，其可增强抗原-特异性IgG1亚类抗体的产生而不会诱导IgE抗体的产生。

此外，本发明人已经对化合物(I)进行了进一步研究，并发现其在盐水中的溶解性和分散性随着酰基链长度的增加有下降的趋势。本发明人已经进行了深入研究，以改善下降的分散性，并发现通过加入α-环糊精，该分散性可被显著提高，并且，令人意料不到的是，甚至其增强抗原特异性IgG1亚类抗体产生的作用(免疫刺激作用)也可得到提高。

本发明人基于这些发现进行了进一步研究并完成了本发明。

因此，本发明提供了以下内容。

[1]免疫刺激剂，其包括至少一种式(I)代表的化合物：

其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-6烷基；

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基；

X¹为-O-、-NR⁵-或-S-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基；和

X²为-O-、-NR⁶-或-S-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

[2]根据[1]的免疫刺激剂，其中R¹和R²各自为甲基。

[3]根据[1]或[2]的免疫刺激剂，其中X¹和X²各自为-NH-。

[4]根据[1]-[3]中任一项的免疫刺激剂，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-35烷基。

[5]根据[1]-[4]中任一项的免疫刺激剂，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-30烷基。

[6]根据[1]-[3]中任一项的免疫刺激剂，其中所述式(I)代表的化合物选自由以下组成的群组：

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[7]根据[1]-[6]中任一项的免疫刺激剂，其中所述式(I)代表的化合物选自由以下组成的群组：

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[8]根据[1]-[7]中任一项的免疫刺激剂，进一步包含α-环糊精。

[9]根据[1]-[3]中任一项的免疫刺激剂，其进一步包含α-环糊精，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基。

[10]根据[1]-[9]中任一项的免疫刺激剂，其中所述免疫刺激剂是佐剂。

[11]一种疫苗，其包含根据[1]-[10]中任一项的试剂和抗原。

[12]一种药物组合物，其包含至少一种式(I)代表的化合物和α-环糊精：

其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-6烷基；

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基；

X¹为-O-、-NR⁵-或-S-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基；和

X²为-O-、-NR⁶-或-S-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

[13]根据[12]的药物组合物，其中R¹和R²各自为甲基。

[14]根据[12]或[13]的药物组合物，其中X¹和X²各自为-NH-。

[15]根据[12]-[14]中任一项的药物组合物，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基。

[16]根据[12]-[14]中任一项的药物组合物，其中所述式(I)代表的化合物选自由以下组成的群组：

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[17]式(I)代表的化合物：

其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-6烷基；

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基；

X¹为-O-、-NR⁵-或-S-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基；和

X²为-O-、-NR⁶-或-S-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基

(不包括N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二叔丁酯和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯)。

[18]根据[17]的化合物，其中R¹和R²各自为甲基。

[19]根据[17]或[18]的化合物，其中X¹和X²各自为-NH-。

[20]根据[17]-[19]中任一项的化合物，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-35烷基。

[21]根据[17]-[20]中任一项的化合物，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-30烷基。

[22]根据[17]-[19]中任一项的化合物，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基。

[23]化合物，其选自由以下组成的群组：

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[24]化合物，其选自由以下组成的群组：

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[25]一种疫苗，其包含至少一种式(I)代表的化合物和抗原：

其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-6烷基；

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基；

X¹为-O-、-NR⁵-或-S-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基；和

X²为-O-、-NR⁶-或-S-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

[26]根据[25]的疫苗，其中R¹和R²各自为甲基。

[27]根据[25]或[26]的疫苗，其中X¹和X²各自为-NH-。

[28]根据[25]-[27]中任一项的疫苗，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-35烷基。

[29]根据[25]-[28]中任一项的疫苗，其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-30烷基。

[30]根据[25]-[27]中任一项的疫苗，其中所述式(I)代表的化合物选自由以下组成的群组：

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[31]根据[25]-[29]中任一项的疫苗，其中所述式(I)代表的化合物选自由以下组成的群组：

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

[32]根据[25]-[31]中任一项的疫苗，其通过选自以下的途径进行给药：皮下给药和鼻内给药。

发明效果

由于化合物(I)具有增强抗原特异性IgG1亚类抗体生成的作用(免疫刺激作用)，因此其用作免疫刺激剂。特别地，由于化合物(I)具有与常规铝凝胶佐剂相同或不低于常规铝凝胶佐剂的免疫刺激作用、不会诱导IgE抗体的产生以及几乎不显示常规铝凝胶佐剂引起问题地诱导过敏反应的活性，因此其可为有效且安全的佐剂。

此外，根据本发明，可提供含有化合物(I)的药物组合物，其可容易地溶于或分散于盐水中。所述药物组合物在增强抗原特异性IgG1亚类抗体生成的作用(免疫刺激作用)中是良好的，且可用作免疫刺激剂。

附图说明

图1是显示实施例1中的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的佐剂活性的评估测试结果的图，其中“OVA”表示单独给药OVA的组，“SZ23”表示加入SZ23的组，“(CyssOMe)₂”表示加入胱氨酸二甲酯的组，“ISA”表示加入异硬脂酸的组，且“ISA+(CyssOMe)₂”表示加入胱氨酸二甲酯-异硬脂酸的混合物的组。

图2是显示实施例2中的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的佐剂活性的评估测试结果的图，其中“对照”表示单独给药盐水的组，“OVA”表示单独给药OVA的组，“ALUM”表示加入氢氧化铝凝胶佐剂的组，“2.56”表示加入SZ23；2.56μmol的组，“0.256”表示加入SZ23；0.256μmol的组和“0.0256”表示加入SZ23；0.0256μmol的组。

图3是显示实施例3中N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的诱导过敏反应活性的评估测试结果的图，其中”对照”表示单独给药盐水的组，”OVA”表示单独给药OVA的组，“ALUM”表示加入氢氧化铝凝胶佐剂的组，“2.56”表示加入SZ23；2.56μmol的组，“0.256”表示加入SZ23；0.256μmol的组，和“0.0256”表示加入SZ23；0.0256μmol的组。

图4是显示实施例4中N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)和N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₁烷基)之间的佐剂活性的比较测试结果的图，其中”对照”表示单独给药盐水的组，”OVA”表示单独给药OVA的组，“SZ23”表示加入SZ23的组，和“SZ24”表示加入SZ24的组。

图5是显示实施例5中N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)对人单核细胞系的免疫刺激作用的评估测试结果的图。

图6是显示实施例6中N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)对小鼠巨噬细胞样细胞系(RAW)的免疫刺激作用的评估测试结果的图。

图7是显示实施例7中N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₅烷基)的佐剂活性的评估测试结果的图，其中”对照”表示单独给药盐水的组，”OVA”表示单独给药OVA的组，“SZ22”表示加入SZ22的组，和“SZ23”表示加入SZ23的组。

图8是显示实施例8中N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₂烷基)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₂₉烷基)的佐剂活性的评估测试结果的图，其中”OVA”表示单独给药OVA的组，“SZ34”表示加入SZ34的组，“SZ35”表示加入SZ35的组，“SZ36”表示加入SZ36的组，和“SZ23”表示加入SZ23的组。

图9是显示实施例9中N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯(SZ23’：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的佐剂活性的评估测试结果的图，其中”OVA”表示单独给药OVA的组，“SZ23”表示加入SZ23的组，和“SZ23’”表示加入SZ23’的组。

图10是显示实施例10中N,N’-双(亚油酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ28：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇链烯基)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的佐剂活性的评估测试结果的图，其中“对照”表示单独给药OVA的组。

图11是显示实施例11中N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₂₉烷基)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₃₇烷基)分散性研究测试结果的图。

图12是实施例11中制备的各搅拌样品的照片。

图13显示实施例12中N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₂₉烷基)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₃₇烷基)的分散溶剂(添加了1％βCD的盐水，添加了5％αCD的盐水)的研究测试结果的图。

图14是显示实施例13中N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₂₉烷基)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₃₇烷基)的佐剂活性(盐水，添加了5％αCD的盐水)的评估测试结果的图，其中”对照”表示单独给药OVA的组。

图15是显示实施例14中N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₅烷基)、N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₂烷基)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₂₉烷基)的佐剂活性(添加了5％αCD的盐水)的评估测试结果的图，其中”对照”表示单独给药OVA的组。

图16是显示实施例15中N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的佐剂活性(添加了5％αCD的盐水)的评估测试结果的图，其中”对照”表示单独给药OVA的组。

图17是显示实施例16中N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)和N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ66：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₂₁烷基)的佐剂活性(添加了5％αCD的盐水)的评估测试结果的图，其中”对照”表示单独给药OVA的组。

图18是显示实施例17中向小鼠鼻内给药流感疫苗的血清样品中，由N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)产生的IgG1亚类抗体的评估测试结果的图，其中“FluVac(-)”、“FluVac(+)”分别表示未给药流感疫苗的组和给药流感疫苗的组。

图19是显示在实施例17中向小鼠鼻内给药流感疫苗中，N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)的HI(血细胞凝集素抑制)滴定度评估测试(血凝抑制试验)结果的图，其中“FluVac(-)”、“FluVac(+)”分别表示未给药流感疫苗的组和给药流感疫苗的组。

图20是显示在实施例17中向小鼠鼻内给药流感疫苗中，在鼻腔洗剂中由N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)导致的IgA抗体产生的评估测试结果的图，其中“FluVac(-)”、“FluVac(+)”分别表示未给药的流感疫苗组和给药流感疫苗的组。

图21是显示实施例17中向小鼠鼻内给药流感疫苗中，在鼻腔洗剂中由N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35：化合物，其中对应于式(I)中的R³和R⁴的基团为C₁₇烷基)导致的IgA抗体产生的评估测试结果的图，其中“FluVac(-)”、“FluVac(+)”分别表示未给药流感疫苗的组和给药流感疫苗的组。

实施方案描述

本发明的免疫刺激剂含有至少一种下式(I)代表的化合物。

式(I)：

其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-6烷基；

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基；

X¹为-O-、-NR⁵-或-S-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基；和

X²为-O-、-NR⁶-或-S-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

式(I)的各基团按下文所解释。

式(I)中的R¹和R²相同或不同且各自为C_1-6烷基。

R¹或R²的“C_1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，且其实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基等。在这些中，从易于获得和低成本方面考虑，C_1-3烷基是优选的，且甲基是特别优选的。

尽管R¹和R²可为相同或不同的，但是优选是相同的。

在优选的实施方案中，R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)。

式(I)中的R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基。

针对R³或R⁴提到的“C_12-37烷基”是指具有12-37个碳原子的直链或支链烷基，且其实例包括十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、2-庚基癸基、4,6,6-三甲基-1-(1,3,3-三甲基丁基)庚基、十八烷基、十九烷基、二十基(icosyl)、二十烷基(eicosyl)、二十一基(henicosyl)、二十一烷基(heneicosyl)、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、2-十四烷基十五烷基、三十烷基、三十一烷基、三十二烷基、三十三烷基、三十四烷基(tetratriacontyl)、三十五烷基(pentatriacontyl)、三十六烷基(hexatriacontyl)、三十七烷基(heptatriacontyl)、2-十八烷基十九烷基等。

在一个实施方案中，R³和R⁴相同或不同且各自可为C_12-35烷基。特别地，C_12-32烷基是优选的，且C_12-30烷基是更优选的。具体地，C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基、C₁₈烷基、C₁₉烷基、C₂₀烷基、C₂₁烷基、C₂₂烷基、C₂₃烷基、C₂₄烷基、C₂₅烷基、C₂₆烷基、C₂₇烷基、C₂₈烷基、C₂₉烷基或C₃₀烷基是更优选的。由于其在增强IgG1亚类抗体生成的作用中是特别良好的，因此C_12-21烷基或C_28-30烷基是特别优选的。例如，C₁₂烷基、C₁₅烷基、C₁₇烷基、C₂₁烷基或C₂₉烷基是特别优选的。

当如下文所述本发明试剂除了化合物(I)之外还含有α-环糊精时，R³和R⁴相同或不同且各自可为C_12-37烷基(例如，C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基、C₁₈烷基、C₁₉烷基、C₂₀烷基、C₂₁烷基、C₂₂烷基、C₂₃烷基、C₂₄烷基、C₂₅烷基、C₂₆烷基、C₂₇烷基、C₂₈烷基、C₂₉烷基、C₃₀烷基、C₃₁烷基、C₃₂烷基、C₃₃烷基、C₃₄烷基、C₃₅烷基、C₃₆烷基或C₃₇烷基)，且C_29-37烷基是更有效和更优选的。具体地，C₂₉烷基、C₃₀烷基、C₃₁烷基、C₃₂烷基、C₃₃烷基、C₃₄烷基、C₃₅烷基、C₃₆烷基或C₃₇烷基是更有效且更优选的。

尽管R³和R⁴可为相同或不同的，但是它们优选是相同的。

在R³和R⁴的一个优选实施方案中，它们相同或不同且各自为C_12-35烷基。

在R³和R⁴的另一优选实施方案中，它们相同或不同且各自为C_12-32烷基(更优选C_12-30烷基，特别更优选C_12-21烷基或C_28-30烷基)。具体地，C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基、C₁₈烷基、C₁₉烷基、C₂₀烷基、C₂₁烷基、C₂₂烷基、C₂₃烷基、C₂₄烷基、C₂₅烷基、C₂₆烷基、C₂₇烷基、C₂₈烷基、C₂₉烷基或C₃₀烷基是更优选的。

当本发明的试剂除了化合物(I)之外还含有α-环糊精时，在R³和R⁴的一个优选实施方案中，它们各自为C_29-37烷基。

式(I)中的X¹为-O-、-NR⁵-或-S-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基。

针对R⁵所述的“C_1-6烷基”按上述R¹或R²的“C_1-6烷基”进行限定，且其具体实例和优选实施方案也相同。

X¹的优选实施方案为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基。

X¹的更优选的实施方案为-NH-。

式(I)的X²为-O-、-NR⁶-或-S-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

针对R⁶所述的“C_1-6烷基”按上述R¹或R²的“C_1-6烷基”进行限定，且其具体实例和优选实施方案也相同。

在优选的实施方案中，X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

在更优选的实施方案中，X²为-NH-。

优选的化合物(I)的一个实施方案是如下化合物(I)，其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基(更优选C_12-35烷基)，

X¹为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基，和

X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基，

更优选地，为如下化合物(I)，其中

R¹和R²各自为甲基，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基(更优选C_12-35烷基)，和

X¹和X²各自为-NH-。

优选的化合物(I)的其他实施方案是如下化合物(I)，其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-32烷基(更优选C_12-30烷基，特别优选C_12-21烷基或C_28-30烷基)，

X¹为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基，和

X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

更优选的化合物(I)是如下化合物(I)，其中

R¹和R²各自为甲基，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-32烷基(更优选C_12-30烷基，特别优选C_12-21烷基或C_28-30烷基)，和

X¹和X²各自为-NH-。

优选的化合物(I)的具体实例包括：

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯等。

化合物(I)更优选为N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯或N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，和特别优选为N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯或N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯。

除了N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二叔丁酯和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(例如，N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯、N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯和N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯等)之外的化合物(I)是新的化合物。

(化合物(I)的合成)

化合物(I)的制造方法按如下说明。

尽管代表性的制造方法在下文作为化合物(I)的制造方法的实例进行描述，但是该制造方法并不限于此。

在化合物(I)中，其中R³和R⁴相同的化合物(Ia)可通过，例如，以下反应式A或与其类似的方法进行制备。

其中R^3a如R³或R⁴所定义，和其他符号按如上所定义。

化合物(Ia)可通过以下制备：将化合物(a)与化合物(b)在缩合剂的存在下进行反应。

相对于1当量的化合物(a)，所用的化合物(b)的量通常为1.5-10当量，优选2-4当量。

所述缩合剂的实例包括碳化二亚胺，例如1,3-二环己基碳二亚胺、1-环己基-3-吗啉代乙基碳二亚胺、1-环己基-3-(4-二乙基氨基环己基)碳二亚胺、1,3-二乙基碳二亚胺、1,3-二异丙基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等或其盐等。

相对于1当量的化合物(a)，所用缩合剂的量通常为1.5-10当量，优选2-4当量。

当需要时，该反应可在碱的存在下进行。

该碱的实例包括碱金属氢氧化物(例如，氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等)、碱土金属氢氧化物(例如，氢氧化镁、氢氧化钙等)、碱金属碳酸盐(例如，碳酸钠、碳酸钾等)、碱金属碳酸氢盐(例如，碳酸氢钠、碳酸氢钾等)、有机碱(例如，三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、甲基吡啶、N-甲基吡咯烷、N-甲基吗啉、N,N-二甲基苯胺、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、四甲基胍等)、有机锂(例如，甲基锂、正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂等)、氨基化锂(例如，二异丙基氨基锂等)等。

相对于1当量的化合物(a)，所用的碱的量通常为1.5-10当量，优选2-6当量。

此外，当需要时，该反应可在缩合促进剂的存在下进行。

所述缩合促进剂的实例包括1-羟基苯并三唑(HOBt)、其水合物等。

相对于1当量的化合物(a)，所用的缩合促进剂的量通常为0.01-10当量，优选为1-4当量。

此外，在该反应中，可使用化合物(b)的混合酸酐来代替化合物(b)。所述混合酸酐可通过以下获得，例如，首先使化合物(b)与氯甲酸烷基酯(例如，氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯)等在碱的存在下反应。

该反应优选在对所述反应惰性的溶剂中进行。这种溶剂并没有特别地限制，只要该反应进行即可，其实例包括醚(例如，1,4-二噁烷、四氢呋喃、二乙醚、叔丁基甲醚、二异丙基醚、乙二醇二乙醚)、酯(例如，甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯)、卤代烃(例如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、三氯乙烯)、烃类(例如，己烷、苯、甲苯)、酰胺(例如，N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺)、亚砜(例如，二甲基亚砜)等。可将两种或多种这样的溶剂混合并以适当的比例使用。

反应温度通常为-80-150℃，优选10–100℃。

反应时间通常为0.5-48小时，优选10–30小时。

在化合物(I)中，获得其中R³和R⁴不同的化合物(Ib)的方法的实例：

其中R^3b如R³所定义，R^4b如R⁴所定义，和其他符号如上所定义，

包括通过与上述反应式A类似的方法将化合物(a)与R^3bCOOH和R^4bCOOH的混合物反应以得到其中R³和R⁴相同的化合物的混合物的方法、通过以下步骤(1)-(3)获得它们的方法，等等。

(1)通过与上述反应式A类似的方法使为化合物(a)的化合物与R^3bCOOH反应的步骤，其中保护基被引入到X²中；

(2)将所得化合物脱保护的步骤；和

(3)通过与上述反应式A类似的方法将所得化合物与R^4bCOOH反应的步骤。

对于保护基，可使用在肽化学等中常用的那些并且，对于保护基的引入或脱除的方法，可使用本身已知的方法且，例如，可进行描述于Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons(1980)等中的方法。

对于化合物(a)，市售可得的产品可容易地获得或可根据本身已知的方法或其类似的方法进行制备。例如，其中X¹或X²为-NH-的化合物(a)可通过以下制备：使半胱氨酸烷基酯在氧化剂等的存在下进行反应，使得这些硫醇基团将形成二硫键。可使用本身已知的方法，例如，描述于J.Org.Chem.，60(11)，第3266-3267页(1995)中的方法。所述半胱氨酸二烷基酯可作为市售可得的产品容易地获得，例如，其中烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基等。例如，其中X¹或X²为-O-的化合物(a)可通过以下制备：在上述方法中使用3-巯基乳酸烷基酯代替所述半胱氨酸烷基酯。所述3-巯基乳酸烷基酯可作为市售可得产品容易地获得，例如，其中烷基是甲基、乙基等。

获得其中R³和R⁴不同的化合物(Ib)的其他方法的实例包括1)方法，其包括将具有不同酰基的两种酰基半胱氨酸在氧化剂等的存在下反应，使得这些硫醇基团将形成二硫键，2)方法，其包括将其中能够与硫醇形成二硫键的官能团(例如，吡啶硫基等)引入到酰基半胱氨酸的硫醇基团中的化合物与具有不同酰基的酰基半胱氨酸反应，3)方法，其包括通过使用不同的酰化剂等将不同的酰基引入半胱氨酸的两个氨基中，等等。

可进行上述1)的方法，例如，根据在WO 2009/143299等中所述的方法。在上述2)的方法中，可进行将能够与硫醇基团形成二硫键的官能团(例如，吡啶硫基等)引入酰基半胱氨酸的硫醇基团中的步骤，例如，根据在ACS Chemical Biology，8(6)，第1283-1290页(2013)中所述的方法，且可进行将通过该步骤获得的化合物与酰基半胱氨酸反应的步骤，例如，根据WO 2010/147831等中所述的方法。可进行上述3)的方法，例如，根据Heterocycles，52(1)，第425-442页(2000)等中所述的方法。

可通过，例如，一般的分离方法(例如柱色谱、重结晶、溶剂洗涤等)，将通过例如上述方法制备的化合物(I)分离和纯化。

当化合物(I)含有旋光异构体、立体异构体、位置异构体或旋转异构体时，这些也作为化合物(I)被包括在内，和各自可作为单一产物通过本身已知的合成方法和分离方法(浓缩、溶剂萃取、柱色谱、重结晶、溶剂洗涤等)获得。例如，当在化合物(I)中存在光学异构体时，从该化合物中拆分的光学异构体也涵盖在化合物(I)中。

光学异构体可通过本身已知的方法制备。具体地，通过使用光学活性合成中间体或根据常规方法光学拆分最终的外消旋体产物获得光学异构体。

化合物(I)可为晶体，且无论该晶体形式是单一的还是晶体混合物，均包含在化合物(I)中。晶体可通过施用本身已知的结晶方法进行结晶来制备。

化合物(I)可为水合物、非水合物、溶剂合物和非溶剂合物中的任一种。

被同位素(例如，²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S)等标记的化合物(I)也包含在本发明化合物中。

由于化合物(I)具有增强抗原特异性IgG1亚类抗体生成的作用(免疫刺激作用)，因此其用作免疫刺激剂。本发明的免疫刺激剂(下文有时被简称为“本发明的试剂”)可为化合物(I)本身，或可通过使用药理学上可接受的载体等配制化合物(I)而获得。

对于本发明试剂可含有的药理学上可接受的载体，可使用各种常规的有机或无机载体物质作为制备材料，其作为赋形剂、润滑剂、粘合剂或崩解剂加至固体制剂中；作为液体制剂等中的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂或安抚剂。当必要时，也可使用制剂添加剂，例如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等。

本发明的试剂除了化合物(I)之外还可含有α-环糊精。当本发明的试剂还含有α-环糊精时，化合物(I)的分散性被提高，且令人惊讶的是，甚至是增强所述抗原特异性IgG1亚类抗体生成的作用(免疫刺激作用)也被进一步提高。在化合物(I)中，针对R³或R⁴的烷基的碳原子数可不小于12且不大于37(例如，C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基、C₁₈烷基、C₁₉烷基、C₂₀烷基、C₂₁烷基、C₂₂烷基、C₂₃烷基、C₂₄烷基、C₂₅烷基、C₂₆烷基、C₂₇烷基、C₂₈烷基、C₂₉烷基、C₃₀烷基、C₃₁烷基、C₃₂烷基、C₃₃烷基、C₃₄烷基、C₃₅烷基、C₃₆烷基或C₃₇烷基)。特别地，当将其中针对R³或R⁴的烷基碳原子数不小于29的化合物(I)的分散性与针对R³或R⁴的烷基碳原子数小于29的化合物(I)的分散性相比较时，前者比后者在盐水等中倾向于呈现更弱的分散性。因此，对于含有其中R³和R⁴相同或不同且各为C_29-37烷基的化合物(I)的本发明试剂而言，除了化合物(I)之外还含有α-环糊精是更有效且更优选的。然而，由于加入α-环糊精得到更好的结果，即使是本发明的试剂除了R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基，优选C_12-35烷基的化合物(I)之外还可含有α-环糊精。特别地，C_12-32烷基是优选的，且C_12-30烷基是更优选的。具体地，C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基、C₁₈烷基、C₁₉烷基、C₂₀烷基、C₂₁烷基、C₂₂烷基、C₂₃烷基、C₂₄烷基、C₂₅烷基、C₂₆烷基、C₂₇烷基、C₂₈烷基、C₂₉烷基或C₃₀烷基是更优选的。因为其在增强IgG1亚类抗体生成的作用中是特别好的，因此C_12-21烷基或C_28-30烷基是特别优选的。例如，C₁₂烷基、C₁₅烷基、C₁₇烷基、C₂₁烷基或C₂₉烷基是特别优选的。

当本发明的试剂除了化合物(I)之外还含有α-环糊精时，优选地化合物(I)为以下化合物(I)，其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基，

X¹为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基，和

X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基，

更优选的是以下化合物(I)，其中

R¹和R²各自为甲基，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基，和

X¹和X²各自为-NH-。

当本发明的试剂除了化合物(I)之外还含有α-环糊精以实现更高的效力时，更优选地化合物(I)为以下化合物(I)，其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基，

X¹为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基，和

X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基，

更优选是以下化合物(I)，其中

R¹和R²各自为甲基，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基，和

X¹和X²各自为-NH-。

当本发明的试剂除了化合物(I)之外还含有α-环糊精时，优选的化合物(I)的具体实例包括

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，等，

且为了具有更高的效力还包括：

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，等等。

在本发明中，α-环糊精是指环状低聚糖，其中6个D-葡萄糖形成具有α1→4键的环状结构。

本发明中所用的α-环糊精可为衍生物的形式。对这种衍生物没有特别的限制，只要它具有α-环糊精的骨架，其实例包括其中α-环糊精被甲基化等化学修饰的衍生物或被麦芽糖基化等酶修饰的衍生物等。

尽管本方面所用的α-环糊精可例如，通过由环糊精葡聚糖转移酶将淀粉进行酶转化等进行制备，但该制备方法并不限于此且其可通过本身已知的方法进行制备。此外，可使用市售可得的产品，且其是方便和优选的。

尽管在本发明的试剂中化合物(I)和α-环糊精(化合物(I):α-环糊精)的重量比没有特别限制，但是优选是1:0.0002-2.0000，更优选1:0.002-0.2。

本发明试剂的剂型的实例包括口服制剂，例如片剂(包括糖衣片剂、薄膜包衣片剂、舌下片剂、口服崩解片剂)、胶囊(包括软胶囊、微胶囊)、颗粒、粉末、锭剂、糖浆、乳液、混悬液等；和胃肠外制剂，例如注射剂(例如，皮下注射剂、静脉注射剂、肌内注射剂、腹膜内注射剂、点滴注射剂)、外用制剂(例如，表皮制剂、软膏剂)、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)、丸剂、点滴注射、滴眼剂、肺部制剂(吸入剂)等。这些制剂可为控释制剂(例如，持续释放微胶囊)，例如即释制剂、持续释放制剂等。

当本发明的试剂是口服制剂时，可在必要时进行包衣，目的在于掩蔽味道、肠特性或持续性。用于包衣的所述包衣基质的实例包括各种已知的包衣基质。

本发明的试剂可通过制备制剂技术领域常用的方法进行制备，例如，在Japanese Pharmacopoeia，第16版等中描述的方法。

本发明的试剂除了被加工成成人用制剂之外，可被加工成儿童用制剂。

对被给药本发明试剂的对象没有特别限制，只要其是具有免疫系统的动物。其实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴等)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅等)等。本发明的试剂可安全地经口服或胃肠外给药(例如，局部给药、直肠给药、静脉内给药)至它们。

尽管化合物(I)增强抗原特异性IgG1亚类抗体产生的作用(免疫刺激作用)的机理并不清楚，但是如下述实施例所示，认为抗原特异性IgG1抗体的产生是由于作用于抗原呈递细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等)以促进其细胞增殖而得到增强的。因此，本发明的试剂用作针对抗原呈递细胞的生长促进剂。

由于化合物(I)如下述实施例所示具有良好的佐剂活性，因此将本发明试剂用作佐剂。

本发明的“佐剂”是当与抗原结合时增加抗体产生并提高免疫应答的物质的通用术语。

当本发明的试剂用作佐剂时，其剂型可为，例如，水性或非水性(例如，油性等)溶液、混悬液、乳液等。这些可通过以下制备：将化合物(I)与药理学上可接受的载体(例如，溶剂、悬浮剂等)混合并进行例如以下方法：手动振荡、机械振荡、超声分散、用均匀混合器分散、自乳化、膜乳化、D-相乳化方法、真空乳化方法、超高压乳化方法等。

本发明的试剂可与其他佐剂组合使用。其他佐剂的实例包括弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、颗粒(例如，尿酸盐晶体、二氧化硅、氢氧化铝凝胶、聚苯乙烯、石棉、二氧化钛、黑色氧化镍等)、脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A(MPLA)、鞭毛蛋白、霍乱毒素B亚单元(CTB)、β-葡聚糖、壳聚糖、皂苷、角鲨烯、α-GalCer、脂肽(例如，Pam2CSK4、Pam3CSK4等)、脂质体、核酸(例如，ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、CpG、聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)等)、益生菌乳酸菌(例如，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌等)、细胞因子(例如，白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18、TNF-α、GM-CSF、IFN-α等)等。

本发明还提供含有本发明试剂(或化合物)和抗原的疫苗。本发明疫苗中所含的化合物可为与本发明试剂所含的化合物(I)类似的化合物。本发明疫苗可能含有的化合物的实例包括作为本发明试剂中所含化合物的实例中所列举的那些。

对本发明所用的抗原没有特别限制，只要其是能够诱导免疫反应的物质，且其实例包括变应原、病原体抗原、生物体内的自体抗原、肿瘤抗原等。

本发明中所用的变应原可为花粉变应原、食物变应原或室尘变应原。对所述花粉变应原没有特别限制，且其实例包括雪松花粉变应原、日本丝柏花粉变应原、豚草变应原、鸭茅变应原等。对所述食物变应原没有特别限制，且其实例包括酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白、卵类粘蛋白、卵白蛋白、伴清蛋白等。对所述室尘变应原没有特别限制，且其实例包括螨变应原、猫变应原等。

本发明所用的病原体抗原可为病原性病毒抗原、病原性微生物抗原或病原性原生动物抗原。所述病原性病毒抗原没有特别限制，且其实例包括病毒的抗原，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(例如，A型、B型、C型、D型和E型肝炎病毒等)、流感病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河热病毒、人乳头瘤病毒、马脑炎病毒、人T细胞白血病病毒(例如，HTLV-I等)、脊髓灰质炎病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、诺如病毒、RS病毒、麻疹病毒、埃勃拉病毒等，且流感病毒的抗原是特别优选使用的。所述病原性微生物抗原没有特别限制，且其实例包括表达于病原菌(例如，流感嗜血杆菌B型(Hib)、肺炎球菌、破伤风杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳博氏杆菌、霍乱、沙门氏菌、伤寒杆菌、衣原体、分支杆菌、军团杆菌(legionella)等)、病原性酵母(例如，曲霉菌、念珠菌等)等中的抗原。对病原性原生动物抗原没有特别限制，且其实例包括表达于疟疾、血吸虫等中的抗原。

对用于本发明的生物体中的自体抗原没有特别限制，且其实例包括神经系统疾病(例如阿尔茨海默氏病、克雅氏病等)中的β淀粉样蛋白、朊病毒；循环系统疾病(例如动脉硬化、高血压等)中的ApoB100、血管紧张素I、血管紧张素II；自身免疫/过敏性疾病(例如I型糖尿病、支气管哮喘等)中的胰岛素、IL-5；类风湿性关节炎中的IL-6、TNF-α，等等。

本发明所用的肿瘤抗原可为实体瘤(例如上皮肿瘤和非上皮肿瘤)的抗原或造血组织中的肿瘤的抗原。所述实体瘤抗原没有特别限制，且其实例包括MART-1/Melan-A、Mage-1、Mage-3、gp100、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白2(trp2)、CEA、PSA、CA-125、erb-2、Muc-1、Muc-2、TAG-72、AES、FBP、C-凝集素、NY-ESO-1、半乳凝素-4/NY-CO-27、Pec60、HER-2/erbB-2/neu、端粒末端转移酶、G250、Hsp105、点突变ras致癌基因、点突变p53致癌基因、癌胚抗原等。对造血组织中的肿瘤(例如，白血病)的抗原没有特别限制，且其实例包括蛋白酶3、WT-1、hTERT、PRAME、PML/RAR-a、DEK/CAN、亲环素B、TEL-MAL1、BCR-ABL、OFA-iLRP、存活素、个体遗传型、精子蛋白17、SPAN-Xb、CT-27、MUC1等。

本发明的疫苗可通过选自以下的途径进行给药：口服、肌内、透皮、皮内、皮下、腹膜内、气管内、鼻内(经鼻)、眼内、阴道、直肠、静脉内、肠内和吸入给药，特别优选皮下或鼻内(经鼻)给药。

本发明疫苗中的抗原的含量可为作为疫苗起作用的有效量，且该量可通过本领域技术人员基于，例如，使用实验动物等的测试进行确定，而无需过度实验。具体地，本发明疫苗中的抗原的含量通常是1-100μg。

尽管对本发明的免疫刺激剂在本发明疫苗中的含量没有特别限制且可根据例如抗原的类型、所给药的对象、给药形式、给药途径等进行适当调整，但对于口服、肌内、透皮、皮内、皮下或腹膜内给药，其通常为2μg-20mg，优选20μg-200μg，和对于气管内、鼻内(经鼻)、眼内、阴道、直肠、静脉内、肠内或吸入给药，其通常为0.01μg–1mg，优选0.1μg–100μg。

本发明的疫苗除了本发明的免疫刺激剂和抗原之外可含有药理学上可接受的载体。本发明疫苗可含有的药理学上可接受的载体的实例包括作为本发明的试剂可含有的药理学上可接受的载体的实例所列举的那些。

本发明的疫苗还可含有其他佐剂。其他佐剂的实例包括作为可与本发明的试剂组合使用的佐剂的实例所列举的那些。

本发明疫苗的剂型的实例包括作为本发明试剂的剂型的实例所列举的那些。

本发明的疫苗可通过在制备制剂的技术领域中所用的方法进行制备，例如在Japanese Pharmacopoeia，第16版等中所描述的方法。例如，其可通过以下制备：将本发明的试剂和所需抗原混合，并且如果必要的话，乳化或分散所述混合物，或将本发明的试剂加至含有所需抗原的疫苗中，并且如果必要的话，乳化或分散所述混合物等。

本发明的疫苗的给药对象没有特别限制，只要其为具有免疫系统的动物，且其实例包括作为本发明的试剂的给药对象的实例所列举的那些。

本发明的疫苗可通过单次给药或多次连续给药进行给药。当连续给药本发明的疫苗时，给药期限没有特别限制且可根据例如抗原种类、给药对象、给药形式、给药途径等进行适当设定。其通常在1-90天，优选1-30天的范围内。

通过向靶点给药本发明的疫苗，可预防或治疗过敏、感染、肿瘤等。

本发明还提供了含有化合物(I)和α-环糊精的药物组合物(下文有时被简称为“本发明组合物”)。

本发明组合物中所含的化合物(I)可与本发明的试剂中所含的化合物(I)类似。由于α-环糊精更显著地呈现出提高分散性和使增强抗原特异性IgG1亚类抗体生成的作用提高，因此其中R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基的化合物(I)是优选的。但是，既然加入α-环糊精得到更好的结果，因此本发明组合物含有化合物(I)和α-环糊精，所述化合物中R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基，优选C_12-35烷基。特别地，C_12-32烷基是优选的，且C_12-30烷基是更优选的。具体地，C₁₂烷基、C₁₃烷基、C₁₄烷基、C₁₅烷基、C₁₆烷基、C₁₇烷基、C₁₈烷基、C₁₉烷基、C₂₀烷基、C₂₁烷基、C₂₂烷基、C₂₃烷基、C₂₄烷基、C₂₅烷基、C₂₆烷基、C₂₇烷基、C₂₈烷基、C₂₉烷基或C₃₀烷基是更优选的。由于其在增强IgG1亚类抗体产生的作用中是特别良好的，因此C_12-21烷基或C_28-30烷基是特别优选的。例如，C₁₂烷基、C₁₅烷基、C₁₇烷基、C₂₁烷基或C₂₉烷基是特别优选的。

在本发明组合物中所含的优选的化合物(I)是以下化合物(I)，其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基，

X¹为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基，和

X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基，

更优选化合物(I)，其中

R¹和R²各自为甲基，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_12-37烷基，和

X¹和X²各自为-NH-。

在本发明组合物中所含的以实现更高效力的更优选的化合物(I)是以下化合物(I)，其中

R¹和R²相同或不同且各自为C_1-3烷基(例如，甲基等)，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基，

X¹为-NR⁵-，其中R⁵为氢原子或C_1-6烷基，和

X²为-NR⁶-，其中R⁶为氢原子或C_1-6烷基。

在本发明组合物中所含的更优选的化合物(I)是以下化合物(I)，其中

R¹和R²各自为甲基，

R³和R⁴相同或不同且各自为C_29-37烷基，和

X¹和X²各自为-NH-。

在本发明组合物中所含的优选的化合物(I)的具体实例包括

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯等，

以及为了更高的效力还包括，

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯，等等。

对于在本发明组合物中所含的α-环糊精，可使用与可包含在本发明的试剂中α-环糊精类似的那些。

尽管化合物(I)在本发明组合物中的含量没有特别限制，但其优选为0.1-99.9wt％，更优选为1-99wt％。

尽管α-环糊精在本发明组合物中的含量没有特别限制，但其优选为0.005-20wt％，更优选0.05-5wt％。

尽管在本发明组合物中的化合物(I)的含量和α-环糊精的含量的重量比(化合物(I):α-环糊精)没有特别限制，但其优选为1:0.0002-2.0000，更优选1:0.002-0.2。

本发明组合物除了化合物(I)和α-环糊精之外可含有药理学上可接受的载体。所述本发明组合物可含有的药理学上可接受的载体的实例包括与如本发明的试剂可含有的药理学上可接受的载体所列举的那些类似的载体。

本发明组合物的剂型的实例包括与如本发明的试剂的剂型所列举的那些类似的剂型。

本发明的组合物可通过制备制剂技术领域常用的方法，例如，描述于Japanese Pharmacopoeia，第16版等中的方法进行制备。

本发明组合物的给药对象的实例包括如本发明的试剂的给药对象的实例所列举的那些。

本发明组合物也可以试剂盒的形式提供，其中将化合物(I)和α-环糊精分开包装。

由于本发明组合物具有增强抗原特异性IgG1亚类抗体产生的作用(免疫刺激作用)，因此其可用作，例如，免疫刺激剂等。

实施例

本发明通过参考合成实施例和实施例(其并不限制本发明)在下文中更详尽地进行解释。本发明在不脱离本发明范围的情况下可以进行修改。除非特别提及，否则本发明所用的试剂、装置和材料均是市售可得的。

[合成实施例1]

N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)的合成

在室温，向棕榈酸(900mg，3.51mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(7.4mL)和L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(673mg，3.51mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(538mg，3.51mmol)和三乙胺(0.82ml，5.9mmol)，将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌。自搅拌开始起第1小时和第2小时加入N,N-二甲基甲酰胺(3.7mL)，并将该混合物在室温再搅拌19小时。加入10％柠檬酸水溶液(40ml)以停止该反应，并将该混合物用甲苯(200ml)萃取两次。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40ml)和15％盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩并将所得粗产物用己烷(20ml)进行浆液洗涤(slurry-washed)，得到N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(874mg，1.17mmol，产率80％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(t，3H，J＝6.8Hz)，1.25-1.30(m，24H)，1.64(m，2H)，2.25(t，2H，J＝7.3Hz)，3.19(dd，1H，J＝5.1Hz，14.2Hz)，3.22(dd，1H，J＝5.1Hz，14.2Hz)，3.77(s，3H)，4.88(dt，1H，J＝7.4Hz，5.1Hz)，6.40(d，1H，J＝7.4Hz)。

ESIMS(m/z)：745.6([M+H]⁺)，767.5([M+Na]⁺)，783.5([M+K]⁺)。

[合成实施例2]

N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)的合成

在室温，向异硬脂酸(999mg，3.51mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)和L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(673mg，3.51mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(538mg，3.51mmol)和三乙胺(0.82ml，5.9mmol)，将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌20小时。加入10％柠檬酸水溶液(30ml)以停止所述反应，并将该混合物用乙酸乙酯(100ml，50ml)萃取。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)和15％盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩，并将所得粗产物用己烷(50ml)进行浆液洗涤，得到N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(738mg，0.92mmol，产率63％)，其为淡黄色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.87(m，6H)，1.25-1.30(m，24H)，1.43(m，2H)，1.58(m，2H)，2.12(m，1H)，3.18(dd，1H，J＝5.2Hz，14.1Hz)，3.23(dd，1H，J＝5.4Hz，14.1Hz)，3.77(s，3H)，4.87(dt，1H，J＝7.4Hz，5.3Hz)，6.40(d，1H，J＝7.4Hz)。

ESIMS(m/z)：801.6([M+H]⁺)，823.6([M+Na]⁺)。

[合成实施例3]

N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯(SZ23’)的合成

在室温，向5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酸(1.14ml，3.52mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)和L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(673mg，3.52mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(538mg，3.52mmol)和三乙胺(0.82ml，5.9mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌18小时。加入10％柠檬酸水溶液(50ml)以停止该反应，并将该混合物用乙酸乙酯(50ml)萃取两次。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)、水(50ml)和15％盐水(50ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩和将所得粗产物用己烷浆液洗涤，得到N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯(541mg，0.68mmol，产率46％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.87-0.92(m，24H)，0.96-1.92(m，11H)，3.13-3.24(m，2H)，3.76(s，3H)，4.85-4.87(m，1H)，6.36-6.41(m，1H)。

ESIMS(m/z)：801.8([M+H]⁺)，823.9([M+Na]⁺)，835.8([M+Cl]^-)。

[合成实施例4]

N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)的合成

在室温，向月桂酸(705mg，3.52mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)和L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(675mg，3.52mmol)、1-羟基苯并三唑(476mg，3.52mmol)和三乙胺(0.82ml，5.9mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌18小时。加入10％柠檬酸水溶液(30ml)以停止该反应，并将该混合物用乙酸乙酯(100ml)萃取两次。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40ml)和15％盐水(20ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩并将所得粗产物用乙酸乙酯(20ml)进行浆液洗涤，得到N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(365mg，0.58mmol，产率39％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(t，3H，J＝6.9Hz)，1.26-1.32(m，16H)，1.60-1.68(m，2H)，2.26(t，2H，J＝7.6Hz)，3.18(dd，1H，J＝5.2Hz，14.2Hz)，3.23(dd，1H，J＝5.1Hz，14.2Hz)，3.77(s，3H)，4.88(dt，1H，J＝7.5Hz，5.1Hz)，6.44(d，1H，J＝7.4Hz)。

ESIMS(m/z)：633.2([M+H]⁺)，655.3([M+Na]⁺)。

[合成实施例5]

N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)的合成

在室温，向十三烷酸(755mg，3.52mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)和L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(675mg，3.52mmol)、1-羟基苯并三唑(476mg，3.52mmol)和三乙胺(0.82ml，5.9mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌17小时。加入10％柠檬酸水溶液(30ml)以停止该反应，并将该混合物用乙酸乙酯(100ml)萃取。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)洗涤两次并用15％盐水(20ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩和将所得粗产物用乙酸乙酯(20ml)进行浆液洗涤，得到N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(630mg，0.95mmol，产率65％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(t，3H，J＝6.9Hz)，1.25-1.32(m，18H)，1.60-1.68(m，2H)，2.26(t，2H，J＝7.6Hz)，3.18(dd，1H，J＝5.2Hz，14.2Hz)，3.23(dd，1H，J＝5.1Hz，14.2Hz)，3.77(s，3H)，4.88(dt，1H，J＝7.5Hz，5.1Hz)，6.44(d，1H，J＝7.4Hz)。

ESIMS(m/z)：661.5([M+H]⁺)，683.5([M+Na]⁺)。

[合成实施例6]

N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)的合成

在室温，向硬脂酸(1.00g，3.52mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)和L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(675mg，3.52mmol)、1-羟基苯并三唑(476mg，3.52mmol)和三乙胺(0.82ml，5.9mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌23小时。加入10％柠檬酸水溶液(30ml)以停止所述反应，然后加入乙酸乙酯(1000ml)。将所述沉淀物过滤收集。将所滤过的固体用乙酸乙酯(30ml)洗涤，得到N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(543mg，0.68mmol，产率46％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(t，3H，J＝6.9Hz)，1.25-1.34(m，28H)，1.60-1.68(m，2H)，2.26(t，2H，J＝7.6Hz)，3.17(dd，1H，J＝5.1Hz，14.2Hz)，3.23(dd，1H，J＝5.1Hz，14.2Hz)，3.82(s，3H)，4.87(dt，1H，J＝7.4Hz，5.1Hz)，6.42(d，1H，J＝7.7Hz)。

ESIMS(m/z)：801.6([M+H]⁺)，835.5([M+Cl]^-)。

[合成实施例7]

N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)的合成

在室温，向L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(100mg，0.29mmol)中加入1,2-二氯乙烷(2.9mL)和三十酸(319mg，0.70mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(135mg，0.70mmol)、1-羟基苯并三唑(95mg，0.70mmol)和三乙胺(0.16ml，1.2mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在75℃搅拌19.5小时。将该反应混合物过滤，并将所滤过的固体用己烷/乙酸乙酯(1/3)、10％柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤，得到N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(229mg，0.20mmol，产率69％)，其为淡黄色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(t，3H，J＝6.9Hz)，1.25-1.38(m，52H)，1.59-1.64(m，2H)，2.37(t，2H，J＝7.7Hz)，3.17(dd，1H，J＝5.5Hz，14.5Hz)，3.24(dd，1H，J＝5.1Hz，14.4Hz)，3.82(s，3H)，4.92(dt，1H，J＝7.4Hz，5.4Hz)，6.94(d，1H，J＝7.7Hz)。

ESIMS(m/z)：1138.3([M+H]⁺)。

[合成实施例8]

N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)的合成

在室温，向L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(250.0mg，0.74mmol)中加入二氯甲烷(4.9mL)和2-十四烷基十六烷酸(796.9mg，1.76mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(337.4mg，1.76mmol)、1-羟基苯并三唑(237.8mg，1.76mmol)和三乙胺(0.41ml，2.94mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌22小时。加入10％柠檬酸水溶液(30ml)以停止所述反应，并将该混合物用二氯甲烷(100ml，50ml)萃取。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40ml)洗涤两次，然后用水(30ml)和15％盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩并将所得粗产物用二乙醚(20ml)进行浆液洗涤，得到N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(546.1mg，0.48mmol，产率65％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.88(m，6H)，1.25(m，48H)，1.40(m，2H)，1.60(m，2H)，2.11(m，1H)，3.16(dd，1H，J＝5.2Hz，14.2Hz)，3.24(dd，1H，J＝5.5Hz，14.4Hz)，3.77(s，3H)，4.86(dt，1H，J＝5.4Hz，7.4Hz)，6.40(d，1H，J＝7.5Hz)。

ESIMS(m/z)：1138.2([M+H]+)

[合成实施例9]

N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)的合成

在室温，向L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(100.0mg，0.29mmol)中加入二氯甲烷(2.0mL)和2-十八烷基二十酸(397.8mg，0.69mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(135.0mg，0.69mmol)、1-羟基苯并三唑(95.1mg，0.69mmol)和三乙胺(0.16ml，1.16mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌17小时。加入10％柠檬酸水溶液(10ml)以停止所述反应，并将该混合物用二氯甲烷(60ml)萃取三次。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(60ml)洗涤两次，然后用水(60ml)和15％盐水(60ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩并将所得粗产物用己烷(20ml，50ml)进行浆液洗涤，得到N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(262.0mg，0.19mmol，产率66％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(m，6H)，1.25(m，64H)，1.42(m，2H)，1.63(m，2H)，2.12(m，1H)，3.16(dd，1H，J＝5.2Hz，14.1Hz)，3.24(dd，1H，J＝5.4Hz，14.1Hz)，3.76(s，3H)，4.86(dt，1H，J＝7.4Hz，5.3Hz)，6.40(d，1H，J＝7.4Hz)。

ESIMS(m/z)：1362.4([M+H]+)

[合成实施例10]

N,N’-双(亚油酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ28)的合成

在室温，向L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(500mg，1.47mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(9.8mL)和亚油酸(1.12g，3.51mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。按顺序加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(673mg，3.51mmol)、1-羟基苯并三唑(538mg，3.51mmol)和三甲胺(0.82ml，5.86mmol)，并将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌20小时。加入10％柠檬酸水溶液(30ml)以停止所述反应，并将该混合物用乙酸乙酯(30ml)萃取两次。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40ml)和15％盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。将该滤液减压浓缩并将所得粗产物用硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯)纯化，并从己烷中重结晶，得到N,N’-双(亚油酰基)-L-胱氨酸二甲酯(450.4mg，0.57mmol，产率39％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.89(t，3H，J＝6.9Hz)，1.27-1.37(m，14H)，1.64(m，2H)，2.05(m，4H)，2.26(t，2H，J＝7.6Hz)，2.77(t，2H，J＝6.7Hz)，3.18(dd，1H，J＝5.2Hz，14.2Hz)，3.23(dd，1H，J＝5.0Hz，14.2Hz)，3.77(s，3H)，4.88(dt，1H，J＝7.4Hz，5.1Hz)，5.28-5.42(m，4H)，6.39(d，1H，J＝7.4Hz)。

ESIMS(m/z)：793.5([M+H]⁺)，815.5([M+Na]⁺)。

[合成实施例11]

N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ66)的合成

在室温，向L-胱氨酸二甲酯盐酸盐(250mg，0.73mmol)中加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL)和山嵛酸(597mg，1.75mmol)，并将该混合物在冰浴中冷却。向所得混合物中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(336mg，1.75mmol)、1-羟基苯并三唑(237mg，1.75mmol)和三乙胺(0.41ml，2.92mmol)，将该混合物从冰浴中移出并在室温搅拌20.5小时。向该反应混合物中加入乙酸乙酯(50ml)并将该混合物过滤，并将所滤过的固体用乙酸乙酯/己烷(1/1，50ml)进行浆液洗涤。之后，将所得固体溶于乙酸乙酯(100ml)中，用10％柠檬酸水溶液(50ml)和水洗涤，并将有机层浓缩。将所得固体再次用乙酸乙酯/己烷(3/2，40ml)进行浆液洗涤，得到N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(307mg，0.34mmol，产率46％)，其为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：0.88(t，3H，J＝6.8Hz)，1.25(m，36H)，1.62(m，2H)，2.25(t，2H，J＝7.6Hz)，3.18(dd，1H，J＝5.2Hz，14.4Hz)，3.23(dd，1H，J＝5.2Hz，14.2Hz)，3.77(s，3H)，4.87(dt，1H，J＝5.2Hz，7.5Hz)，6.40(d，1H，J＝7.2Hz)。

ESIMS(m/z)：913.7([M+H]⁺)。

(2)佐剂活性测试

[实施例1]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)的佐剂活性的评估测试

将8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于盐水中的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(单独给药OVA的组)，(2)溶于盐水中的OVA(10μg)和作为佐剂的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)(2.56μmol)(基于氢氧化铝凝胶佐剂，相当于0.2mg)(加入SZ23的组)，(3)溶于盐水中的OVA(10μg)和胱氨酸二甲酯((CyssOMe)₂)(2.56μmol)(加入胱氨酸二甲酯的组)，(4)溶于盐水中的OVA(10μg)和异硬脂酸(ISA)(5.12μmol)(加入异硬脂酸的组)，和(5)溶于盐水中的OVA(10μg)、(CyssOMe)₂(2.56μmol)和ISA(5.12μmol)(加入胱氨酸二甲酯-异硬脂酸混合物的组)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(5)中类似的溶液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取全血和脾脏，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。测量实施例1和以下实施例2、4、7-10和13-16中的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的方法如下。

[抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的测量方法]

以100μl/孔向96孔板中加入5μg/ml OVA，并将该混合物在4℃培养过夜。培养后，将该混合物用每孔200μl的PBS-T(PBS(磷酸缓冲盐溶液)+0.05％(v/v)Tween 20)洗涤三次，并在室温用每孔100μl的5％FCS(胎牛血清)/PBS溶液封闭1–2小时。此后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤三次，加入稀释的血清样品(100μl/孔)或作为对照的相同量的5％FCS/PBS溶液，并将该混合物在37℃培养1小时。此后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤五次，加入稀释的生物素化的抗小鼠IgG1抗体(100μl/孔)，并将该混合物在37℃培养45min。此后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤五次，加入稀释的抗-生物素-HRP抗体(100μl/孔)，并将该混合物在37℃再培养30min。此后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤五次，加入TMB底物溶液(100μl/孔)，并将该混合物在室温培养10-15min。此后，加入反应淬灭液(2N硫酸溶液)(50μl/孔)以停止显色反应，并通过微孔板读数仪(microplate reader)测量吸光度(OD值＝450nm)。

结果如图1所示。

从图1所示的结果清楚地看出，在加入SZ23的组(在图：SZ23中)中的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生比单独给药OVA的组(在图：OVA中)显著增加。该结果证实，N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)具有佐剂活性。在加入胱氨酸二甲酯的组(在图:(CyssOMe)₂中)、加入异硬脂酸的组(在图：ISA中)和在加入胱氨酸二甲酯-异硬脂酸混合物的组(在图：ISA+(CyssOMe)₂中)中的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生与单独给药OVA的组没有显著差异。该结果表明，通过缩合胱氨酸二甲酯和异硬脂酸得到的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)具有佐剂活性。

[实施例2]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)的佐剂活性的评估测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于盐水中的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(单独给药OVA的组)，(2)溶于盐水中的OVA(10μg)和作为佐剂的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)(2.56μmol)(基于氢氧化铝凝胶佐剂，相当于0.2mg)(加入SZ23；2.56μmol的组)，(3)溶于盐水中的OVA(10μg)和SZ23；0.256μmol(加入SZ23；0.256μmol的组)，(4)溶于盐水中的OVA(10μg)和SZ23；0.0256μmol(加入SZ23；0.0256μmol的组)，(5)溶于盐水中的OVA(10μg)和氢氧化铝凝胶佐剂(2.56μmol)(0.2mg)(加入ALUM的组，阳性对照)，和(6)盐水(盐水单独给药组)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(6)中类似的溶液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取全血和脾脏，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。结果如图2所示。

从图2所示的结果清楚地看出，在加入SZ23；2.56μmol、0.256μmol和0.0256μmol的全部组中(在图：2.56、0.256和0.0256中)抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生比单独给药OVA的组(在图：OVA中)显著增加，且与加入ALUM的组(在图：ALUM中)的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生水平相同。这些结果证实，N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)具有与氢氧化铝凝胶佐剂相同水平的佐剂活性。

[实施例3]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)的诱导过敏活性的评估测试

测量实施例2中获得的血清样品的抗OVA-特异性IgE抗体。抗OVA-特异性IgE抗体的测量方法如下。

[抗OVA-特异性IgE抗体的测量方法]

使用由DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.制造的DS小鼠IgE ELISA(OVA)试剂盒。该实验方案如下简要示出。

将用于绘制分析曲线的血清样品和标准试剂用缓冲液稀释并在搅拌后，在室温下静置10min。将该样品和标准溶液加至预先结合有IgE捕获抗体的板中并在搅拌后，将该混合物在室温下静置60min。将该混合物用洗液洗涤三次，加入HRP标记的OVA，并将该混合物在室温下静置30min。将该混合物用洗液洗涤三次，加入底物溶液，并将该混合物在室温避光下静置30min。加入反应淬灭液，将该混合物搅拌，并立即测量吸光度(OD值＝450nm)。

该结果如图3所示。

从图3所示的结果清楚地看出，加入ALUM的组(在图：ALUM中)的抗OVA-特异性IgE抗体的产生比之前报道的单独给药OVA的组(在图：OVA)显著增加。相反地，在加入SZ23；2.56μmol、0.256μmol和0.0256μmol的全部组(在图：2.56、0.256和0.0256中)中未观察到抗OVA-特异性IgE抗体产生的增加。该结果已表明，相比于由于接种引起问题地诱导过敏的氢氧化铝凝胶佐剂而言，N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)显示出更低的诱导过敏活性。

[实施例4]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)和N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)的佐剂活性的比较测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于盐水中的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(单独给药OVA的组)，(2)溶于盐水中的OVA(10μg)和作为佐剂的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)(2.56μmol)(加入SZ23的组)，(3)溶于盐水的OVA(10μg)和N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)(2.56μmol)(加入SZ24的组)，和(4)盐水(盐水单独给药组)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(4)中类似的溶液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取全血，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。SZ24公开于JP-A-4-230359。结果如图4所示。

从图4所示的结果清楚地看出，加入SZ23的组(在图：SZ23中)的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生比单独给药OVA的组(在图：OVA中)显著增加。另一方面，在加入SZ24的组(在图：SZ24中)中抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生与单独给药OVA的组没有显示出显著差异。该结果表明，本发明的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)比已知的N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)具有更高的佐剂活性。

[实施例5]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)对人单核细胞系的免疫刺激作用的评估测试

将人单核细胞系THP-1以3.0x10⁵细胞/ml的浓度接种到96孔板，并在37℃、5％CO₂的条件下培养3小时。加入N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)成最终浓度为4nM、400nM或4μM，将该混合物培养24小时。对于THP-1的培养，使用添加有FBS(最终浓度10％)、青霉素(最终浓度100U/ml)、链霉素(最终浓度100μg/ml)的RPMI-1640作为维持培养基。将该细胞每3天传代一次。培养24小时后，向各孔中加入10μl的CCK-8试剂(细胞计数试剂盒-8，由DOJINDO LABORATORIES制造)，并将该混合物在37℃、5％CO₂的条件下培养2小时，之后通过微孔板读数仪测量吸光度(OD值＝450nm)。将各孔的吸光度除以仅加入培养基的孔的吸光度，这被定义为刺激指数(SI)，并使用SI评估细胞增殖。结果如图5所示。

从图5所示的结果清楚地看出，相比于仅加入培养基的孔(在图：培养基中)，在加入N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯成最终浓度为400nM、4μM(在图：SZ23 400nM、SZ23 4μM中)的孔中可见显著的细胞增殖。该结果表明，N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)具有促进单核细胞生长并活化单核细胞的作用。

[实施例6]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)对小鼠巨噬细胞样细胞系(RAW)的免疫刺激作用的评估测试

将小鼠巨噬细胞样细胞系RAW以3.0x10⁵细胞/ml的浓度接种到96孔板，并在37℃、5％CO₂的条件下培养3小时。以4nM、400nM或4μM的最终浓度加入N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)，并将该混合物培养24小时。对于RAW的培养，使用添加有FBS(最终浓度10％)、青霉素(最终浓度100U/ml)、链霉素(最终浓度100μg/ml)的DMEM(高糖)作为维持培养基。将该细胞每3天传代一次。培养24小时后，向各孔中加入10μl的CCK-8试剂(细胞计数试剂盒-8，由DOJINDO LABORATORIES制造)，并将该混合物在37℃、5％CO₂的条件下培养2小时，之后用微孔板读数仪测量吸光度(450nm)。如实施例5中所述，将各孔的吸光度除以仅加入培养基的孔的吸光度，这被定义为刺激指数(SI)，并使用SI评估细胞增殖。结果如图6所示。

从图6所示的结果清楚地看出，相比于仅加入培养基的孔(在图：培养基中)，在加入N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯成最终浓度为4nM、400nM、4μM(在图：4nM、400nM、4μM中)的孔中可见显著的细胞增殖。该结果表明，N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)具有促进巨噬细胞生长并活化巨噬细胞的作用。

[实施例7]N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)的佐剂活性的评估测试

这个测试是以与实施例4相同的方式进行的，除了使用N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)代替N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)。结果如图7所示。

从图7所示的结果清楚地看出，相比于单独给药OVA的组(在图：OVA中)，在加入SZ23的组(在图：SZ23中)和加入SZ22的组(在图：SZ22中)中抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加。该结果表明，N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)如N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)一样，也具有佐剂活性。

[实施例8]N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)的佐剂活性的评估测试

这个测试以与实施例4相同的方法进行，除了使用N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)代替N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)。结果如图8所示。

从图8所示的结果清楚地看出，在加入SZ34的组(在图：SZ34中)、加入SZ35的组(在图：SZ35中)和加入SZ36的组(在图：SZ36中)中的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生比单独给药OVA的组(在图：OVA中)显著增加。该结果表明，N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)正如N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)一样，也具有佐剂活性。

[实施例9]N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯(SZ23’)的佐剂活性的评估测试

这个测试以与实施例4相同的方式进行，除了使用N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯(SZ23’)代替N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)。结果如图9所示。

从图9所示的结果清楚地看出，相比于单独给药OVA的组(在图：OVA中)，在加入SZ23’的组中抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加。该结果表明，N,N’-双[5,7,7-三甲基-2-(1,3,3-三甲基丁基)辛酰基]-L-胱氨酸二甲酯(SZ23’)与N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)一样也具有佐剂活性。

[实施例10]N,N’-双(亚油酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ28)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)的佐剂活性的评估测试

该测试以与实施例4相同的方式进行，除了使用N,N’-双(亚油酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ28)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)代替N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)和N,N’-双(十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ24)。结果如图10所示。

从图10所示的结果清楚地看出，相比于单独给药OVA的组(在图：对照中)，在加入SZ35的组(在图：SZ35中)中的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加，但是相比于单独给药OVA的组(在图：对照中)，在加入SZ28的组中的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生并没有显著增加。该结果表明，N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)比N,N’-双(亚油酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ28)具有更高的佐剂活性。

(3)分散性研究试验

[实施例11]N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)的分散性研究试验

将N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)(0.256μmol)各自分配至含有二氧化锆珠子的2mL管中，加入盐水或添加了5％α-环糊精(下文也简称为αCD)的盐水(1mL)，并将该混合物搅拌。通过微孔板读数仪测量吸光度(OD值＝650nm)，且所述浊度被计算为分散性的指数。所述浊度的测量方法如下。

[浊度的测量方法]

将SZ37和SZ38(0.256μmol)各分配至含有二氧化锆珠子的2mL管中，加入盐水或添加了5％αCD的盐水(1mL)，并将该混合物在6000rpm每次3.15秒的条件下剧烈搅拌三次。将200μL的该混合物分配至96孔板上，并通过微孔板读数仪测量吸光度(OD值＝650nm)。作为对照，将高岭土(1mg)溶于蒸馏水(1L)中，并通过微孔板读数仪测量吸光度(OD值＝650nm)。将其吸光度(OD值＝650nm)定义为浊度：1，且通过与高岭土的测量值的比率计算各样品的浊度。

结果如图11所示。此外，搅拌后各样品的照片如图12所示。

从图11所示的结果清楚地看出，分配于添加了5％αCD的盐水中的SZ37和SZ38的浊度显著高于分配于盐水中的SZ37和SZ38的浊度。从图12的照片中清楚地看出，可以确认，无法分散在盐水中的SZ37和SZ38可均匀分散于添加有5％αCD的盐水中。

[实施例12]N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)的分散溶剂的研究性试验

研究了当SZ37和SZ38被分散时，其分散状态是否随分散溶剂而变化。以与实施例10相同的方式，将SZ37和SZ38加至添加了1％β-环糊精(下文也简称为βCD)的盐水或添加了5％αCD的盐水中，并将该混合物搅拌。通过微孔板读数仪测量吸光度(OD值＝650nm)，且所述浊度被计算为分散性的指数。浊度的测量方法如实施例11中所述。结果如图13所示。

从图13所示的结果清楚地看出，分散于添加了5％αCD的盐水中的SZ37和SZ38的浊度显著高于分散于添加了1％βCD的盐水中的SZ37和SZ38的浊度。其结果表明，当使用添加了5％αCD的盐水而不是添加了1％βCD的盐水时，其分散性更高。

(4)佐剂活性测试

[实施例13]N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)的佐剂活性的评估测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于盐水中的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(单独给药OVA的组)，(2)添加至盐水中的OVA(10μg)和作为佐剂的N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)(0.256μmol)，(3)添加至盐水中的OVA(10μg)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)(0.256μmol)，(4)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和SZ37(0.256μmol)，和(5)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和SZ38(0.256μmol)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(5)中类似的溶液或分散液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取血液，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。结果如图14所示。

从图14所示的结果清楚地看出，相比于单独给药OVA的组(在图：对照中)，在给药分散于添加了5％αCD的盐水中的SZ37和SZ38的组中抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加。另一方面，相比于单独给药OVA的组(在图：对照中)，在给药分散于盐水中的SZ37和SZ38的组中抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生并没有显著增加。该结果证实，N,N’-双(2-十四烷基十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ37)和N,N’-双(2-十八烷基二十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ38)优选分散于添加了5％αCD的盐水中而不是盐水中，以使用它们作为佐剂。

[实施例14]N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)、N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)的佐剂活性的评估测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于添加了5％αCD的盐水中的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(单独给药OVA的组)，(2)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)(0.256μmol)，(3)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)(0.256μmol)，(4)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)(0.256μmol)，和(5)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)(0.256μmol)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(5)中类似的溶液或分散液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取血液，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。结果如图15所示。

从图15所示的结果清楚地看出，相比于单独给药OVA的组(在图：对照中)，分散于5％添加了αCD的盐水中的SZ22、SZ34、SZ35、SZ36的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加。该结果证实，分散于5％添加了αCD的盐水中的N,N’-双(十六烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ22)、N,N’-双(十三烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ34)、N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)和N,N’-双(三十烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ36)也具有佐剂活性。

[实施例15]N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)和N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)的佐剂活性的评估测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于添加了5％αCD的盐水中的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(对照组)，(2)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和SZ23(0.256μmol)，和(3)溶于或分散于添加了5％αCD的盐水中的OVA(10μg)和SZ35(0.256μmol)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(3)中类似的溶液或分散液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取血液，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。结果如图16所示。

从图16所示的结果清楚地看出，相比于对照组(在图：对照中)，分散于添加了5％αCD的盐水中的SZ23、SZ35的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加。该结果证实，分散于添加了5％αCD的盐水中的N,N’-双(2-庚基十一烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ23)与N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)一样也具有佐剂活性。

[实施例16]N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)和N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ66)的佐剂活性的评估测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过背部皮下给药以下一种进行初次免疫：(1)溶于添加了5％αCD盐水的作为抗原的卵白蛋白(OVA)(10μg)(对照组)，(2)溶于或分散于添加了5％αCD盐水的OVA(10μg)和SZ35(0.256μmol)，和(3)溶于或分散于添加了5％αCD盐水OVA(10μg)和SZ66(0.256μmol)，每种小鼠给予一种。一周后，通过再次背部皮下给药与上述(1)-(3)中类似的溶液或分散液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取血液，并测量所得血清样品的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体。结果如所示图17。

从图17所示的结果清楚地看出，相比于对照组(在图：对照中)，分散于添加了5％αCD的盐水中的SZ35、SZ66的抗OVA-特异性IgG1亚类抗体的产生显著增加。该结果证实，分散于添加了5％αCD盐水的N,N’-双(二十二烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ66)也具有佐剂活性。

(5)作为鼻内流感疫苗佐剂的评估测试

[实施例17]N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)的鼻内流感疫苗的佐剂活性的评估测试

8周龄雌性BALB/c小鼠分成组(N＝6)，并将各组的小鼠通过鼻内给药以下一种进行初次免疫：(1)盐水，(2)用盐水稀释的作为抗原的流感疫苗(流感H疫苗“SEIKEN”，由Denka Seiken Co.Ltd.制造)(20μl)(流感疫苗单独给药组)，(3)用盐水稀释的流感疫苗(20μl)和作为佐剂的N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)(0.55μg)，(4)用盐水稀释的流感疫苗(20μl)和作为佐剂的N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)(1.64μg)，(5)用盐水稀释的流感疫苗(20μl)和作为佐剂的N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)(4.92μg)，每种小鼠给予一种。两周后，通过再次鼻内给药与上述(1)-(5)中类似的溶液进行二级免疫。自二级免疫起两周后，在麻醉下提取全血，并进行鼻腔洗涤。测量所得血清样品的抗流感IgG1亚类抗体并进行HI滴定度测试(血凝抑制试验)。作为鼻腔洗涤，打开小鼠的胸部以暴露气管，切开气管，插入带有支管(clause)的Atom静脉导管并注射1mL盐水。将从鼻子排出的液体以10000g离心3min，回收上清液并用作鼻腔洗液样品。对鼻腔洗液样品进行抗-流感IgA抗体和IgG抗体的测量。所述测量方法如下。

[抗-流感IgG1亚类抗体、抗-流感IgA抗体和IgG抗体的测量方法]

将0.5μg/ml流感疫苗(流感HA疫苗“SEIKEN”，由Denka Seiken Co.Ltd.制造)加至96孔板，每孔100μl，并将该混合物在4℃培养过夜。培养后，将该混合物用每孔200μl PBS-T(PBS+0.05％(v/v)Tween 20)洗涤三次，并在室温下用每孔100μl的5％FCS/PBS溶液封闭1–2小时。此后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤三次，加入稀释的血清样品(100μl/孔)、鼻腔洗液样品和作为对照的相同量的5％的FCS/PBS溶液，并将该混合物在37℃培养1小时。然后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤五次，加入稀释的生物素化的抗小鼠IgG1抗体、IgA抗体和IgG抗体(100μl/孔)，并将该混合物在37℃培养45min。然后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤五次，加入稀释的抗-生物素-HRP抗体(100μl/孔)，并将该混合物在37℃再培养30min。此后，将该混合物用PBS-T(200μl/孔)洗涤五次，加入TMB底物溶液(100μl/孔)，并将该混合物在室温反应10-15min。此后，加入反应淬灭液(2N硫酸溶液)(50μl/孔)以停止显色反应，并用微孔板读数仪测量吸光度(OD值＝450nm)。

[HI滴定度测试]

该测试根据“流感病毒HI试剂“SEIKEN””的方案进行。为了除去血清样品中的非特异性抑制剂，向血清样品(300μl)和HI抗血清(A/California/7/2009(H1N1)，血清对照)(100μl)中加入RDE(受体破坏酶，由Denka Seiken Co.Ltd.制造)，并将该混合物在37℃培养过夜。将该混合物在56℃加热60min以淬灭RDE的反应，并加入PBS(600μl)。向其中加入稀释成50％的鸡红细胞混悬液(50μl)并在充分混合之后，将该混合物在环境温度(15℃-25℃)静置60min。将其以900g离心5min，并回收上清液并用作HI样品。然后，为了测定用于HI测试中的所述HA抗原的量，将HA抗原(A/California/7/2009(H1N1))和鸡红细胞按如下混合。首先，将50μl用PBS稀释5倍的HA抗原(A/California/7/2009(H1N1))加至96孔圆底板上，并将PBS(50μl)加入其中，得到10倍稀释液。将该10倍稀释液用PBS连续稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍，向所有这些孔中加入用PBS稀释成0.5％的50μl鸡红细胞混悬液，并观察红血细胞不沉淀的最高稀释倍数。此时，在80倍稀释观察沉淀，且HA值为1:80(80HA/50μl)。由于在该HI滴定度测试中使用4HA/25μl抗原溶液，因此将该抗原溶液稀释10倍并使用。

将按上述调节并用PBS稀释10倍的HI样品(25μl)加至96孔圆底板，并用作10倍稀释的溶液。将该10倍稀释溶液用PBS连续稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍，将25μl的HA抗原(A/California/7/2009(H1N1))加至全部这些孔中，并将该混合物在室温(15℃-25℃)培养30min。然后，观察红细胞的沉淀。当在高达80倍观察到红细胞的沉淀时，所述HI抗体值为80。

血清样品中IgG1亚类抗体的产生的评估结果如图18所示，血清样品中的HI滴定度评估测试的结果如图19所示，鼻腔洗液中的IgA抗体产生的评估结果如图20所示，和鼻腔洗液中的IgG抗体产生的评估结果如图21所示。

从图18所示的结果清楚地看出，在加入SZ35的组的血清中抗流感IgG1亚类抗体的产生(在图：SZ35 0.55μg、1.64μg、4.92μg中)相比于流感疫苗单独给药组显著增加。该结果证实，N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)对流感疫苗具有佐剂活性。

从图19所示的结果清楚地看出，在加入SZ35的组的血清中的HI抗体值(在图：SZ35 0.55μg、1.64μg、4.92μg)相比于流感疫苗单独给药组显著提高。该结果证实，通过加入N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)使针对A/California/7/2009(H1N1)(包含在流感疫苗中的抗原)的抗体的产生增加。

从图20所示的结果清楚地看出，在加入SZ35组的鼻腔洗液中的抗流感IgA抗体的产生(在图：SZ35 4.92μg中)相比于流感疫苗单独给药组显著增加。该结果证实，N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)是在给药部位的鼻粘膜处诱导IgA至流感疫苗的佐剂。

从图21所示的结果清楚地看出，在加入SZ35组的鼻腔洗液中的抗流感IgG抗体的产生(在图：SZ35 4.92μg中)相比于流感疫苗单独给药组显著增加。该结果证实，N,N’-双(十八烷酰基)-L-胱氨酸二甲酯(SZ35)是在给药部位的鼻粘膜处诱导IgG至流感疫苗的佐剂。

工业实用性

由于本发明化合物具有增强抗原特异性IgG1抗体产生的作用(免疫刺激作用)，因此其被用作免疫刺激剂。特别地，由于本发明化合物具有与常规铝凝胶佐剂相当或不低于常规铝凝胶佐剂的免疫刺激作用、不诱导IgE抗体的产生且几乎不显示常规铝凝胶佐剂的引起问题地诱导过敏反应的活性，因此其可为有效且安全的佐剂。此外，由于本发明化合物在粘膜上诱导IgA抗体的产生并增强血液IgG抗体的产生，因此其可为目前正在研究和开发的粘膜疫苗的佐剂。

本申请基于于2014年4月25日在日本提交的专利申请No.2014-091142和于2015年2月27日在日本提交的专利申请No.2015-039593，将这些申请的全部内容引入本文。