癌症检测套组的制作方法

本发明关于一种用于癌症检测的套组；更明确地，是关于一种具有引物组或探针以标定v384d突变的套组。

背景技术：

在人类的历史上，癌症很长一段时间被列为主要死亡原因。已有无数的研究聚焦于癌症的检测与治疗。可惜的是，绝大多数现今于临床上使用的癌症治疗方法仍不足以消除癌症的威胁。尽管如此，研究及临床上的经验已显示越早期治疗，越可提高癌症患者的存活率。这些证据支持了癌症检测的重要性，尤其是在癌变的早期阶段。

一般来说，癌变的检测是藉由测定特定存在于癌症患者体内的生物标志(biomarker)。该些生物标记物可能是特定由癌细胞释出的物质、特定由癌细胞表达的细胞表面标志(cellsurfacemarker)、特定于癌细胞中沉默或过度表达的基因、或特定存在于癌细胞中的基因突变。

在最近的报导中提到，dna错配修复基因(hmlh1)的错义突变于多种癌症中可作为生物标志。hmlh1的v384d错义突变最早是在大肠直肠癌中被观察到，且经比对德国患者与华人患者，该错义突变是特定出现于华人患者(yapingwang,etal,1997)。后续的研究已证实前述发现，而由张等人于公元2004年进行的研究中更明确指出hmlh1的v384d错义突变发生于四种癌症，包括大肠直肠癌、胃癌、乳癌、及食道癌。另一个由xianzheshi等人于2003年的研究则显示v384d错义突变发生于肺癌。

前述研究指出hmlh1的v384d错义突变有潜力成为癌症检测的候选标的。此外，本发明团队所做研究亦进一步证实hmlh1的v384d错义突变与肺癌的egfr-tkis疗法的抗药性相关(该实验数据记载于后续段落)。

有鉴于此，经完善设计以供标定前述v384d突变的检测工具对于医药产业及临床上使用而言将有很大的帮助与价值。虽然目前已有部分研究揭露一些用于前揭目的的引物及探针，本发明的目标是提供专一性及敏感度更胜常规技术的引物组及/或探针。

技术实现要素：

于是，本发明的一个目的为提供一种癌症检测套组，其使用可信赖的生物标志。

本发明的另一个目的是提供一种套组，其用于评估egfr-tkis疗法的效果及/或个体经该疗法后的无恶化期存活率(progression-freesurvival)，从而可于进行egfr-tkis疗法后尽早规画后续的治疗。

为了达到上述目的，本发明提供一种用于检测个体的mlh1基因编码蛋白质的v384突变的套组，其包含：

第一引物，其包含seqidno06所示序列；及第二引物，其包含seqidno07所示序列；及/或

第一引物，其包含seqidno08所示序列；及第二引物，其包含seqidno09所示序列。

较佳地，前述套组进一步包含第三引物，其中前述第三引物包含seqidno05所示序列。

较佳地，权利要求1的前述套组，进一步包含dna聚合酶。

较佳地，前述套组进一步包含双链dna结合染剂。

较佳地，前述双链dna结合染剂为greeni、greenii、gold、oxazoleyellow、thiazoleorange、picogreen、其组合。

本发明又提供一种用于检测个体的mlh1基因编码蛋白质的v384突变的套组，其包含：第一引物，其包含seqidno08所示序列；及第二引物，其包含seqidno09所示序列。

本发明另提供一种用于检测个体的mlh1基因编码蛋白质的v384突变的套组，其包含：至少一突变探针，其包含cagatggatc序列(seqidno10)；其中该探针与一荧光体共轭；及/或至少一野生型探针，其包含cagatggttc序列(seqidno11)；其中该探针与一荧光体共轭。

较佳地，前述至少一突变探针及/或前述至少一野生型探针系进一步与一淬灭体(quencher)共轭。较佳地，前述荧光体共轭于前述探针的5’端，且前述淬灭体共轭于前述探针的3’端。较佳地，前述至少一突变探针包含seqidno17所示序列。较佳地，前述至少一野生型探针包含seqidno16所示序列。

较佳地，前述至少一突变探针及/或前述至少一野生型探针中的至少一个核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。较佳地，前述突变探针包含seqidno19所示序列：

5’-caccagatggatcgtaca-3’。

较佳地，前述突变探针自5’端数至3’端的第5、第8、第11、及第14个核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。

较佳地，前述野生型探针包含seqidno18所示序列：5’-caccagatggttcgtaca-3’。

较佳地，前述野生型探针自5’端数至3’端的第5、第8、第11、及第14个核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。

较佳地，前述套组进一步包含锚探针，其中该锚探针与一荧光体供体共轭。较佳地，前述至少一突变探针包含seqidno21所示序列，且与一荧光体受体共轭。较佳地，前述至少一野生型探针包含seqidno20所示序列，且与一荧光体受体共轭。较佳地，前述锚探针包含seqidno22所示序列。

较佳地，前述套组进一步包含引物组，其中前述引物组用于放大前述mlh1基因的至少一部分以取得复制体；其中前述复制体包含相应于前述v384突变的位置。

较佳地，前述引物组为：

顺向引物，其包含seqidno12所示序列，及逆向引物，其包含seqidno13所示序列；及/或

顺向引物，其包含seqidno14所示序列，及逆向引物，其包含seqidno15所示序列。

较佳地，前述套组进一步包含dna聚合酶。

总结来说，本发明提供一种新颖的引物组或探针，以供检测mlh1基因的v384突变。本发明亦提供包含该引物组或探针的套组。透过使用本发明的套组，对于v384突变的检测可以较常规技术更具专一性及敏感度。

附图说明

图1显示实施例一的即时同步聚合酶链式反应的实验结果(n＝2)；其中seqidno07/seqidno05引物组的实验结果标示为曲线(1)，seqidno07/seqidno06引物组的实验结果标示为曲线(2)，及阴性对照组的实验结果系标示为曲线(3)。(a)不具有v384d突变的个体的基因组dna。(b)具有v384d突变的个体的基因组dna(异型合子)。(c)人造质粒，其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)。(d)人造质粒，其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。

图2显示实施例二的hrm试验法的实验结果(n＝2)。(a)标准阶段；(b)熔离曲线阶段。曲线1：人造质粒，其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)。曲线2：人造质粒，其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。

图3显示实施例三的taqman试验法的实验结果(n＝2)。(a)人造质粒，其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)。(b)人造质粒，其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。曲线(1)：野生型探针(负探针，ml-tp-wt，seqidno16)；曲线(2)：突变探针(正探针，ml-tp-mt，seqidno17)；曲线(3)：对照组(未添加模板)。

图4显示实施例四的lna试验法的实验结果(n＝3)。(a)：人造质粒，其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)。(b)人造质粒，其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。曲线(1)：野生型探针(负探针，ml-tp-wt，seqidno18)；曲线(2)：突变探针(正探针，ml-tp-mt，seqidno19)；曲线(3)：对照组(未添加模板)。

图5显示实施例五的fret试验法的实验结果(n＝2)。(a)(b)：使用ml-sensor-wt(seqidno20)探针及ml-anchor(seqidno22)探针。(c)(d)：使用ml-sensor-mt(seqidno21)探针及ml-anchor(seqidno22)探针。曲线(1)：人造质粒，其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)。曲线(2)：人造质粒，其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。曲线(3)：对照组(未添加模板)。曲线(4)：vp13_0052(异型合子)。曲线(5)：vp13_0055(野生型；同型合子)。

具体实施方式

本研究提供合适于分析mlh1的dna序列、mlh1的mrna序列、及/或mlh1的cdna序列(其是衍生自前述mlh1的mrna序列)的引物组及/或探针，以测定个体的mlh1基因编码的蛋白质是否带有v384突变。

前述突变的测定可以提供可信的该经检测的个体已患有癌症的可能性，如大肠直肠癌、胃癌、乳癌、食道癌、肺癌、或其组合。此外，在肺癌的治疗中，于个体中测定出前述突变可提供资讯以供评估egfr-tkis疗法的效果及/或评估该个体经egfr-tkis疗法治疗后的无恶化期存活率。

本文中所述“egfr-tki疗法”是指一种标靶治疗，其是基于许多非小细胞肺癌患者的肿瘤细胞的表皮生长因子受体的酪氨酸激酶结构域皆带有一体突变。更明确的说，“egfr-tki疗法”是藉由使用egfr酪氨酸激酶抑制剂以标靶于肿瘤细胞的表皮生长因子受体的酪氨酸激酶结构域的体突变来进行。

本文中所述“egfr-tki疗法的效果”是指egfr-tki疗法对于肿瘤的恶化的影响。如果在egfr-tki疗法开始后的3个月内肿瘤仍持续恶化，该疗法则被视为在临床上是没有效果的。反过来说，如果该肿瘤至少在尺寸上有30％的缩小，该疗法则被认定对于该个体有效果。

本文中所述“无恶化期存活率”是指从治疗的起始日起算至观察中的肿瘤又开始恶化的时间点之间的时期。换句话说，该名词是指肿瘤没有恶化或尺寸缩小的该时期的历时长度。

本文中所述“分析”是指以至少一技术手段评估或检视个体的性质。所述技术手段包括但不限于聚合酶链式反应、南方墨点法(southernblot)、或西方墨点法(westernblot)。

本文中所述“mlh1基因编码的蛋白质的v384突变”是指，存在于mlh1基因序列中的突变，其导致mlh1基因编码的蛋白质的v384位置氨基酸产生突变。在本发明的一个可行实施态样中，前述v384突变是指mlh1基因编码的蛋白质的v384d突变。在一可行实施态样中，前述v384d突变可被辨识于前述mlh1基因的cdna的t1151a突变或前述mlh1基因的mrna的t1349a突变。本文中所述“野生型”为相对性的词汇，意指没有前述突变的基因及/或蛋白质。

本文中所述“v384”是指mlh1蛋白质(即，mlh1基因编码的蛋白质)的氨基酸序列中的第384个氨基酸；其中“v”是缬氨酸(valine；val)的缩写。本文中所述“v384突变”是指该位于第384个氨基酸的缬胺酸经改变为另一个非缬胺酸的氨基酸。本文中所述“v384d突变”是指该位于第384个氨基酸的缬胺酸经改变为天门冬胺酸；其中“d”是天门冬胺酸(asparticacid；asp)的缩写。请参考seqidno01所示具有前述突变的氨基酸序列，以及seqidno02所示具有前述突变的dna序列。

本文中所述“u1349”是指编码为mlh1蛋白质的mrna的核苷酸序列的第1349个核苷酸；其中“u”是尿嘧啶的缩写。本文中所述“u1349突变”是指该位于第1349个核苷酸的尿嘧啶突变为另一个非尿嘧啶的核苷酸。本文中所述“u1349a突变”是指该位于第1349个核苷酸的尿嘧啶突变为腺嘌呤；其中“a”是腺嘌呤的缩写。请参考seqidno03所示具有前述突变的mrna序列。

本文中所述“t1151”是指编码为cdna的核苷酸序列的第1151个核苷酸；其中该cdna是源自前述mlh1基因的mrna；“t”是胸腺嘧啶的缩写。本文中所述“t1151突变”是指该位于第1151个核苷酸的胸腺嘧啶突变为另一个非胸腺嘧啶的核苷酸。本文中所述“t1151a突变”是指该位于第1151个核苷酸的胸腺嘧啶突变为腺嘌呤；其中“a”是腺嘌呤的缩写。请参考seqidno04所示具有前述突变的cdna序列。

引物组、探针、及使用该引物组、探针的套组

第一面向

在本发明的第一个面向中，使用引物组检测mlh1基因编码的蛋白质的v384突变。前述“mlh1基因编码的蛋白质的v384突变”如前述段落中所定义。较佳地，前述检测是藉由使用前述引物组的即时同步聚合酶链式反应(real-timepcr)来进行。

在本发明的第一个面向中，提供用于测定mlh1基因编码的蛋白质的v384突变的套组。前述套组包含引物组，而前述引物组是经设计以供分析mlh1的dna序列、mlh1的mrna序列、及/或mlh1的cdna序列(其是衍生自前述mlh1的mrna序列)，以测定个体的mlh1基因编码的蛋白质是否带有v384突变。

在一较佳实施态样中，前述引物组包含第一引物及第二引物。前述第一引物是经设计以包含一序列，该序列可与带有前述v384突变的mlh1基因于v384位置杂合。前述第二引物是经设计以包含一序列，该序列可与mlh1基因的序列保留区域(conservedregion)杂合。若检测到前述第一引物与前述第二引物的聚合酶链式反应产物的存在，即代表存在前述v384突变。

本文中所述“可与带有前述v384突变的mlh1基因于v384位置杂合”意指前述序列可与前述mlh1基因中编码为前述v384突变的密码子的至少一个核苷酸形成碱基配对(base-pairing)。领域中公知密码子包含三个核苷酸。在一较佳实施态样中，前述序列可与前述mlh1基因中编码为前述v384突变的密码子的至少两个核苷酸形成碱基配对。

本文中所述“mlh1基因的序列保留区域”意指前述mlh1基因的一段序列，其于野生型mlh1基因与带有前述v384突变的mlh1基因之间保留或没有改变。本文中所述“野生型”为相对性的词汇，意指没有前述突变的基因及/或蛋白质。

在一可行实施态样中，前述套组进一步包含第三引物。前述第三引物是经设计以包含一序列，该序列可与野生型mlh1基因于v384位置杂合。所述“可与…杂合”如前述段落中所定义。

在一较佳实施态样中，前述套组包含如seqidno06所示的第一引物，如seqidno07所示的第二引物，以及如seqidno05所示的第三引物。此实施态样是供sybr-green试验法使用。检测到前述第一引物及前述第二引物的聚合酶链式反应产物的存在即表示存在前述v384突变，而在这个实施态样中，前述第三引物与前述第二引物的产物为对照组。

在另一实际的实施态样中，前述套组包含如seqidno08所示的第一引物，以及如seqidno09所示的第二引物。此实施态样是供高解析熔离试验法(highresolutionmelting；hrm)使用。在hrm试验法中，当处于标准阶段时，所使用的dna结合染剂会结合至所取得的聚合酶链式反应产物，从而侦测到荧光。当处于熔离曲线阶段，该聚合酶链式反应产物将被熔离(melted)从而可侦测到该dna结合染剂的荧光的衰退。藉由比较野生型对照组或突变型对照组的样本的衰退型态，即可辨识出该v384突变。

在一较佳实施态样中，前述套组进一步包含dna聚合酶及/或dna结合染剂。较佳地，前述dna聚合酶为，但不限于，pfudna聚合酶、taqdna聚合酶、或其组合。较佳地，前述dna结合染剂为，但不限于，greeni、greenii、gold、oxazoleyellow、thiazoleorange、picogreen、或其组合。第二面向

在本发明的第二面向中，使用探针检测mlh1基因编码的蛋白质的v384突变。前述“mlh1基因编码的蛋白质的v384突变”如前述段落中所定义。

在本发明的第二个面向中，提供用于测定mlh1基因编码的蛋白质的v384突变的套组。

在一较佳实施态样中，前述套组包含探针，其是经设计以供分析mlh1的dna序列、mlh1的mrna序列、及/或mlh1的cdna序列(其是衍生自前述mlh1的mrna序列)，以正向测定或负向测定个体的mlh1基因编码的蛋白质是否带有v384突变。

在以正向测定的情况下测定v384突变时，前述探针(即，突变探针)是经设计以杂合于前述mlh1基因的基因组dna、mrna、及/或cdna的片段；其中前述片段含有相应于mlh1基因编码的蛋白质的前述v384突变的序列。举例来说，前述片段可含有前述mrna的t1349a突变，或前述cdna的t1151a突变。透过检视杂合的结果，可测定前述v384突变的存在。在此正向测定的情况中，检测到前述探针与该标的位置的杂合讯号即表示存在v384突变。在一较佳实施态样中，前述突变探针包含cagatggatc序列(seqidno10)。

在以负向测定的情况下测定v384突变时，前述探针(即，野生型探针)是经设计以杂合于野生型mlh1基因的基因组dna、mrna、及/或cdna的片段。在此负向测定的情况下，无法检测到前述探针与该标的位置的杂合讯号即表示不存在野生型mlh1基因，即表示可能存在v384突变。在一较佳实施态样中，前述野生型探针包含cagatggttc序列(seqidno11)。

尽管如此，该所属领域技术人员可理解受测个体可能带有异型合子的mlh1基因型。也就是说该个体的mlh1基因的其中一个对偶基因(allele)为野生型，而另一对偶基因则具有v384突变。在这样的情况下，最好是使用突变探针，或一并使用突变探针及野生型探针以进行检测。

较佳地，前述探针(突变探针或野生型探针)是经修饰的以达成前述标的前述mlh1基因的v384突变的目的。在本发明的一个实施态样中，前述探针是与一荧光体及/或一同位素共轭。在一较佳实施态样中，前述探针是与一荧光体及一淬灭体共轭(taqman方法)。在一较佳实施态样中，前述探针是进一步经修饰以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接(此法为lna方法)。在一较佳实施态样中，前述套组包含突变探针及/或野生型探针，及锚探针(anchor探针)(此法为fret方法)。

较佳地，前述荧光体共轭于前述探针的5’端，且前述淬灭体共轭于前述探针的3’端。前述荧光体包括但不限于：6-羧基荧光体、四氯荧光体(tetrachlorofluorescein)、fam、vic、lc640、或其组合。前述淬灭体包括但不限于：四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、bhq1、或其组合。

在本发明的一个较佳实施态样中，前述套组是经设计以供用于以聚合酶链式反应技术为基础的taqman试验法。前述套组包含突变探针，其包含seqidno.17所示序列，及/或野生型探针，其包含seqidno.16所示序列。前述两种探针分别皆于其两端与一荧光体及一淬灭体共轭。

在一较佳实施态样中，前述套组是经设计以供用于以聚合酶链式反应技术为基础的lna(lockednucleicacid)试验法。前述套组包含突变探针，其包含seqidno.19所示序列，及/或野生型探针，其包含seqidno.18所示序列。前述两种探针皆于其两端分别与一荧光体及一淬灭体共轭。

较佳地，包含seqidno.19或seqidno.18所示序列的前述探针具有至少一核苷酸是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接，从而形成闭锁核酸(lockednucleicacid)。举例来说，前述探针的第5、8、11、及14个核苷酸(从5’端起算至3’端)是经修饰的以于其2’位置的氧原子及4’位置的碳原子之间形成桥接。

在一较佳实施态样中，前述套组是经设计以供用于以聚合酶链式反应技术为基础的fret(fluorescenceresonanceenergytransfer)试验法。在一实际的实施态样中，前述套组包含突变探针及/或野生型探针，及锚探针(anchor探针)。前述突变探针或野生型探针与第一荧光体共轭以作为受体，且前述锚探针与第二荧光体共轭以作为供体。较佳地，前述突变探针包含seqidno.21所示序列，前述野生型探针包含seqidno.20所示序列，且前述锚探针包含seqidno.22所示序列。在一较佳实施态样中，前述套组包含前述突变探针、前述野生型探针、及前述锚探针。

在一较佳实施态样中，前述第一荧光体是fam、hex、lcred640、cy5、或其组合。在一较佳实施态样中，前述第二荧光体是荧光素(fluorescein)。

在一可行实施态样中，前述套组进一步包含dna聚合酶。较佳地，前述dna聚合酶具有核酸外切酶的活性。

在一较佳实施态样中，前述套组进一步包含引物组以供放大前述mlh1基因的至少一部分，从而取得复制体(amplicon)；其中前述复制体包含相应于前述v384的位置。前述引物组可为：

-顺向引物，其包含seqidno12所示序列，及逆向引物，其包含seqidno13所示序列；及/或

-顺向引物，其包含seqidno14所示序列，及逆向引物，其包含seqidno15所示序列。

下表1列出前述揭段落中所提到的本发明的引物组及探针，并一并列出其所应用的技术。

表1：对应列出本发明之引物组及探针与其应用的技术。

实施例一：验证本发明所设计的引物组(sybrgreen试验法)。

在此实施例中，使用引物sb-mt-sf3(seqidno06)、sb-sr3(seqidno07)、及sb-wt-sf3(seqidno05)进行即时同步聚合酶链式反应，以验证前述引物用于标定v384d突变的能力。

这些实验中使用了4种模板(template)，包括：纯化自不带有v384d突变的个体的总dna、纯化自带有v384d突变的个体的总dna(异型合子)、一种人造质粒其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)、及一种人造质粒其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。本实施例中所用模板及引物组列于下表2中。

表2

这些实验是参考eztime^tmrealtimepcrpremix(yeasternbiotechco.,ltd.)的产品说明书来进行。实验中所准备的聚合酶链式反应反应混合物包含：1.0μl的模板(若使用总dna作为模板，则添加2.5μg/μl的浓度；若使用质粒模板，则添加1μg/μl的浓度)、12.5μl的2xeztimereal-timepcrpremix、1.0μl的顺向引物(5μm)、1.0μl的逆向引物(5μm)、及9.5μl的ddh2o。反应条件为：95℃下变性10分钟、95℃下变性20秒、66℃下黏合/延伸1分钟、并重复40个循环；接着，在熔离曲线阶段：95℃下15秒、60℃下1分钟、95℃下30秒、60℃下15秒。本实验中所使用的即时同步聚合酶链式反应设备为7500fast(appliedbiosystem)，并搭载open7500softwarev2.0.6。

实验结果显示于图1(a)至(d)；其中引物组seqidno05/seqidno07的实验结果标示为曲线(1)、引物组seqidno06/seqidno07的实验结果是示为曲线(2)、阴性对照组的实验结果标示为曲线(3)。

根据该些实验结果，该野生型引物组(seqidno05/seqidno07)仅能放大野生型mlh1的序列(图1a、1b、及1c)，而该突变型引物组(seqidno06/seqidno07)仅能放大带有v384d突变的mlh1的序列(图1b及1d)。图1a中所示放大图谱仅有显示曲线(1)，代表实验中的样本确实为同型合子的野生型样本。另一方面，图1b中所示放大图谱显示有曲线(1)及曲线(2)，代表实验中的样本确实为异型合子。使用人造质粒的图1c及1d则分别仅有显示曲线(1)及曲线(2)，表示该二图式的实验中的样本确实为同型合子。

这些实验数据显示本发明的突变型引物组可以专一地标定mlh1基因的v384d突变，且本发明的野生型可以专一地标定不带有v384d突变的mlh1基因。这样的结果证实本发明的引物组可清楚地标定出样本的v384d突变，并具有优异的专一性及敏感度。

实施例二：验证本发明所设计的引物组(hrm试验法)。

在此实施例中，使用引物hr-1-f(seqidno08)及hr-1-r(seqidno09)进行即时同步聚合酶链式反应，以验证前述引物用于标定v384d突变的能力。

这些实验中使用了2种模板，包括：一种人造质粒其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)、及一种人造质粒其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。

该些实验是参考产品说明书来进行。简单地说，实验中所准备的聚合酶链式反应反应混合物包含：20ng的模板、brillianthrmultra-fastlocimastermix、0.5μm的顺向引物(hr-1-f)、0.5μm的逆向引物(hr-1-r)。反应条件为：95℃下预反应3分钟、95℃下变性5秒钟60℃下黏合/延伸10秒钟、并重复40个循环；接着，在熔离曲线阶段：95℃下30秒、65℃下30秒、95℃下30秒。本实验中所使用的即时同步聚合酶链式反应设备为agilentmx3000p(appliedbiosystem)，搭载openappliedbiosystemsoftware，并依据前述所记载的条件设定各项参数。

图2显示本实施例的hrm试验法的实验结果。值得注意的是引物组(hr-1-f/hr-1-r)能放大野生型mlh1基因序列及带有v384d突变的mlh1基因(图2(a))。在熔离阶段，由于突变型具有核苷酸的错误配对，因此其具有不同于野生型的分离曲线(dissociatedcurve)。曲线(2)的讯号的衰退型态显示突变的存在(图2(b))，这样的结果证实了本发明的引物组的确可以辨识出v384突变。

实施例三：验证本发明所设计的探针(taqman试验法)。

在此实施例中，使用引物tp-2-f(seqidno12)及tp-1-r(seqidno13)进行即时同步聚合酶链式反应。并且，使用突变探针(ml-tp-mt；seqidno17；经vic及tamra标签)及野生型探针(ml-tp-wt；seqidno16；经fam及tamra标签)以验证其辨识该v384d突变的能力。

这些实验中使用了2种模板，包括：一种人造质粒其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)、及一种人造质粒其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。

该些实验是参考产品说明书来进行。简单地说，实验中所准备的聚合酶链式反应反应混合物包含：2.0μl(25ng/μl)的模板、10μl的2xbrilliantiiiultra-fastqpcrmastermix(其含有lowrox)、1.0μl的顺向引物(10μm)、1.0μl的逆向引物(10μm)、0.5μl的ml-tp-wt(10μm)、0.5μl的ml-tp-mt(10μm)、5.0μl的ddh2o。反应条件为：95℃下变性3分钟、95℃下变性12秒、55℃下黏合30秒、72℃下延伸1分钟，并重复40个循环。本实验中所使用的即时同步聚合酶链式反应设备为7500fast(appliedbiosystem)，搭载open7500softwarev2.0.6，并依据前述所记载的条件设定各项参数。

实验结果显示于图3。ml-tp-wt探针可专一地检测出野生型mlh1基因序列(图3(a))，而ml-tp-mt探针可专一地检测出突变型mlh1基因序列(图3(b))。这些实验结果验证了本发明的探针于侦测该v384突变上具有优异的专一性。

实施例四：验证本发明所设计的探针(lna试验法)。

在此实施例中，使用引物tp-2-f(seqidno12)及tp-2-r(seqidno13)进行即时同步聚合酶链式反应。并且，使用突变探针(ml-lna-mt；seqidno19；经vic及bhq1标签)及野生型探针(ml-lns-wt；seqidno18；经fam及bhq1标签)以验证其辨识该v384d突变的能力。

这些实验中使用了2种模板，包括：一种人造质粒其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)、及一种人造质粒其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。

该些实验是参考产品说明书来进行。简单地说，实验中所准备的聚合酶链式反应反应混合物包含：5.0μl(2.5ng/μl)的模板或做为对照组的质粒dna、12.5μl的2xeztimereal-timepcrpremix、1.0μl的顺向引物(10μm)、1.0μl的逆向引物(10μm)、0.5μl的ml-lna-wt(10μm)、0.5μl的ml-lna-mt(10μm)、4.5μl的ddh2o。反应条件为：95℃下变性10分钟、95℃下变性15秒、50℃下黏合、72℃下延伸1分钟，并重复40个循环；且于熔离曲线阶段下：95℃下15秒、60℃下1分钟、95℃下30秒、60℃下15秒。本实验中所使用的即时同步聚合酶链式反应设备为7500fast(appliedbiosystem)，搭载open7500softwarev2.0.6，并依据前述所记载的条件设定各项参数。

实验结果系显示于图4。ml-lna-wt探针可专一地检测出野生型mlh1基因序列(图4(a))，而ml-lna-mt探针可专一地检测出突变型mlh1基因序列(图4(b))。这些实验结果验证了本发明的探针于侦测该v384突变上具有优异的专一性。

实施例五：验证本发明所设计的探针(fret试验法)。

在此实施例中，使用引物fr-1-f(seqidno14)及fr-1-r(seqidno15)进行即时同步聚合酶链式反应。并且，使用突变探针(ml-sensor-mt；seqidno21；经lc640标签)、野生型探针(ml-sensor-wt；seqidno20；经lc640标签)、及锚探针(ml-anchor；seqidno22；经荧光素标签)以验证其辨识该v384d突变的能力。

这些实验中使用了2种模板，包括：一种人造质粒其经建立有野生型mlh1基因的部分序列(同型合子)、及一种人造质粒其经建立有带t1151a突变的mlh1基因的部分序列(同型合子)。此外，于本实验中并使用两个临床采集的样本(vp13_0055及vp13_0052)。vp13_0055是野生型的同型合子，而vp13_0052是突变的异型合子(此是经本研究先前采用次世代定序法(ionpgmsystem)的实验验证，但此数据并未揭露于此)。

这些实验是参考产品说明书来进行。简单地说，实验中所准备的聚合酶链式反应反应混合物包含：5.0μl(2.5ng/μl)的模板、2.0μl的10xlightcyclerfaststartdnamasterhyb探针、1.0μl的顺向引物(10μm；seqidno14)、1.0μl的逆向引物(10μm；seqidno15)、0.4μl的ml-sensor-wt(10μm)、0.4μl的ml-sensor-mt(10μm)、0.4μl的ml-anchor(10μm)、8.6μl的ddh2o。反应条件为：95℃下变性10分钟、95℃下变性10秒、55℃下黏合10秒、72℃下延伸30秒，并重复45个循环；且于熔离曲线阶段下：95℃下1分钟、40℃下2分钟、95℃下1分钟。本实验中所使用的即时同步聚合酶链式反应设备为lightcycler480real-timepcrsystem(roche)，搭载openlightcycler480software1.5，并依据前述所记载的条件设定各项参数。

实验结果显示于图5。ml-sensor-wt探针及ml-anchor探针可专一地检测出野生型mlh1基因序列，而ml-sensor-mt探针及ml-anchor探针可专一地检测出突变型mlh1基因序列。当使用ml-sensor-wt探针及ml-anchor探针时，可观察到野生型质粒(曲线1)及vp13_0055(曲线5)皆表现出熔离曲线(图5(a)及(b))。当使用ml-sensor-mt探针及ml-anchor探针时，可观察到突变型质粒(曲线2)表现出熔离曲线(图5(c)及(d))。此外，vp13_0052(曲线4)由于是异型合子，所以不论使用ml-sensor-wt探针及ml-anchor探针、或ml-sensor-mt探针及ml-anchor探针，皆表现出融离曲线(图5(a)及(c))。这些实验结果验证了本发明的探针于侦测该v384突变上具有优异的专一性。

序列表

<110>丽宝生医股份有限公司

<120>癌症检测套组

<130>wpi15tw0430-cn

<160>22

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<213>智人

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151015

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