结合人p53线性表位的抗体及其诊断应用的制作方法

本发明属于免疫诊断领域。

更具体地，本发明涉及一种抗体、试剂盒以及体外诊断阿尔茨海默氏病和/或主体在衰老过程中患阿尔茨海默氏病或认知障碍的倾向。

人p53蛋白的dna结合结构域(dnabindingdomain，dbd)(aa101-306)的特征在于高级构象的柔性以及含有一个由三个半胱氨酸(残基176、238和242)和一个组氨酸(残基179)配位的zn²⁺离子。在人p53蛋白的野生型异构体中，aa282-297线性表位被隐蔽，因此并不能被表位特异性的抗体识别。

然而，由于dbd结构域的高度柔性，p53蛋白能呈现多种构象，这也说明了其生物学活性特点。

p53处于野生型构象时，能结合dna共有序列，并转录/抑制靶基因的表达。在这种构象时，蛋白暴露的表位可以被市售的构象特异性的抗体，即pab1620识别。

p53的构象变化情况有几种，对应于不同的构象改变的异构体。p53基因中的有些突变引起蛋白构象的改变，其对应于可由市售的构象特异性抗体识别的构象改变的异构体。

其他构象改变的异构体还可能源于改变蛋白野生型三级结构的翻译后修饰，如氧化和/或硝化反应。

buizzal.等(“p53构象改变作为阿尔茨海默氏病中氧化应激的一个早期标志”，plosone,7(1):e29789)和ubertid等(“鉴定来自散发性阿尔茨海默氏病患者的成纤维细胞中的p53突变体样构象”，衰老神经生物学，27(2006):1193-1201)都利用抗-p53的抗体pab240确定了在阿尔茨海默氏病患者中突变的p53蛋白的表达，该抗体结合p53蛋白氨基酸残基213-217处隐性表位，该表位在野生型p53中不能被检测到。

本发明的发明人意外发现了一个抗人p53的抗体，已证明该抗体能够特异性和选择性地识别由翻译后修饰产生的构象改变的p53异构体，该异构体中aa282-297线性表位被暴露。

本发明人还意外地发现，由本发明的抗体识别的p53蛋白的异构体在阿尔茨海默氏病患者中特异性表达。特别是，本发明的抗体识别的构象改变的异构体在阿尔茨海默氏病患者的生物样品(尤其是血细胞、神经元细胞或其他细胞类型)以及生物液体样品(像例如血、血浆、血清、唾液、尿液)中被更大量地表达。

本发明人还观察到，由本发明的抗体识别的这种构象改变的异构体也在轻度认知障碍(mildcognitiveimpairment，mci)患者的生物样品中表达。

因此，本发明的抗体对诊断阿尔茨海默氏病和确定轻度认知障碍(mci)的受试者患阿尔茨海默氏病的倾向是有用的诊断和预测工具。

最后，本发明人发现，对本发明的抗体呈阳性的p53蛋白异构体的表达与被研究的受试者的年龄和认知障碍在统计学上显著相关。

因此，本发明的抗体对于确定在衰老过程中受试者患认知障碍的倾向也有用处。

所以，本发明的第一个目的是提供一种抗人p53抗体，特征在于其能识别人p53的dna结合结构域(dbd)中的线性表位序列rrteeenlrkkgephh(seqidno:1)，所述线性表位位于人p53氨基酸序列的第282-297位。

本发明的抗体的制备在下面的实验部分中介绍。

在一个优选的实施例中，本发明的抗体是单克隆抗体。

可以通过制备多克隆或单克隆抗体的任何公知的方法获得本发明的抗体。在下面的实验部分，将以实施例的形式介绍通过由序列crteeenlrkkgephh(seqidno:2)组成的肽抗原偶联作为载体的牛血清白蛋白进行动物免疫(小鼠)和利用杂交瘤技术制备所述的抗体。

如前所述，本发明的抗体特异性识别显示与阿尔茨海默氏病和衰老期间患认知障碍有关的人p53蛋白的一种异构体。因此，该抗体代表了一种有用的诊断和预测工具。

确定阿尔茨海默氏病特有的、通过翻译后修饰而构象改变的p53蛋白异构体的体外方法和如在所附权利要求中定义的构成本发明说明书的一个组成部分的诊断及预测方法都是本发明的一部分。

如在所附权利要求书中定义的免疫诊断试剂盒也是本发明的一部分。

可以使用任何公知的免疫测定方法实现本发明的方法和试剂盒，像例如免疫沉淀检测、elisa或ria、免疫荧光、western印迹、facs分析、免疫细胞化学/免疫组化。

提供以下实施例来说明由所附权利要求限定的本发明的范围，但这些实施例并不于限制本发明的范围。

实施例1

1a.免疫

6/8周的健康无病小鼠被用于免疫。用作抗体制备抗原的肽具有以下特征：

序列：“n-末端”crteeenlrkkgephh“c-末端”(seqidno:2)

长度：16个氨基酸

分子量：1960.94

纯度：96.4％

形式：冻干粉

偶联：通过戊二醛法与bsa共轭偶联

p53蛋白的序列(seqidno:3)如图1所示，其中dna结合结构域(dbd)以灰色高亮显示，2d3a8抗体识别的线性表位以下划线标出。

以弗氏完全佐剂(fac)乳化的抗原(50μg)进行第一次注射。动物在2-3点进行皮下注射。用弗氏不完全佐剂(fia)乳化的50μg抗原于3周后再次注射。使用elisa评价抗体效价。

用上述肽第三次注射后，对5只小鼠血清的抗体效价使用elisa检测进行了评估。通过尾静脉采集被免疫小鼠的血。分光光度计读数后得到的吸光度值提供了关于各小鼠中抗体效价的重要信息。对动物进行再次注射，以使抗体效价达到足够高的水平。选择具有最佳抗体效价的小鼠用于首次融合。

1b.制备杂交瘤

将动物的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞(sp2/o细胞系)融合。筛选抗抗原的融合产物用以选择产生抗体的克隆。继续培养这些克隆。用elisa方法进行第一次筛选。阳性克隆标记为“亲本克隆”，培养3代后冻存。利用抗原包被elisa平板，随后加入融合产物的上清。免疫动物的血清作为elisa的阳性对照。

实施例2

具有最佳抗体效价的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后，进行elisa检测，评估融合结果。制备抗原包被的96孔elisa平板，将来自不同克隆的系列稀释上清加入每个孔中，通过分光光度计读数评估克隆的抗体产量。将450nm(od450nm)具有最高光密度的克隆转至24孔平板，培养后再次进行elisa检测，产抗体量最高的克隆转至6孔平板，培养并再次进行elisa检测。对于转移到培养瓶的克隆也重复上述步骤和过程。这些连续的检测可以鉴定由最后一次elisa测定的最佳克隆，利用有限稀释法以确保阳性克隆显示的是实际的抗体应答。

从具有最高od450nm值也因此具有最好的抗体效价的克隆上清中纯化经验证的抗体。为了简洁，将该抗体命名为“克隆2d3a8”。

实施例3

对散发性和家族性的阿尔茨海默氏病患者以及mci患者中2d3a8抗体识别的p53蛋白构象改变的异构体的表达情况的研究

在诊断为散发性阿尔茨海默氏病(sporadicalzheimer，sad)和家族性阿尔茨海默氏病(familialalzheimer，fad)的患者的永生化b淋巴细胞中，利用识别蛋白的野生型异构体(pab1620)和构象改变的异构体(2d3a8)的两种构象特异性的抗体，通过免疫沉淀法评估p53的构象状态。然后，用抗p53的多克隆抗体(cm1)通过western印迹显示免疫沉淀物。实验数据以同一样品对2d3a8抗体和pab1620呈阳性的条带间强度的比值表示。

与无痴呆症的对照患者的淋巴细胞相比，sad和fad的样品中2d3a8/1620的比值明显更高(图2)。

因此，2d3a8抗体能区分特异表达于慢性的(sad)和家族性的(fad)阿尔茨海默氏病患者的永生化淋巴细胞中的构形改变的p53异构体。

实施例4

在诊断为阿尔茨海默氏病的患者和诊断为mci的轻度认知障碍的患者的新鲜血液样品中，利用elisa评估了由2d3a8抗体识别的构象改变的p53的异构体(2d3a8阳性p53)。还对同样年龄的健康的、无痴呆症的受试者进行了评估。

对相同患者或受试者的血细胞(pbmc)和血清中的2d3a8-阳性p53都进行了检测。2d3a8抗体能高度特异性识别患阿尔茨海默氏病的患者。有趣的是，患轻度认知障碍的受试者血清中2d3a8阳性p53的表达水平显著高于对照受试者。与对照相比，阿尔茨海默氏病患者的pbmcs和血清中的2d3a8阳性p53异构体显著增加(图3)。

实施例5

2d3a8-阳性p53异构体与年龄相关。

在衰老过程中，血细胞(pbmc)中2d3a8-阳性p53的表达以统计学显著的方式增加(图4)。

此外，通过公知的神经心理学测试mmse检测，2d3a8-阳性p53的表达与认知状态相关。2d3a8-阳性p53异构体随mmse测试中得分的降低而增加，即，其随着认知障碍的进展而增加(图5)。

序列表

<110>布雷西亚大学

<120>结合人p53线性表位的抗体及其诊断应用

<130>p53

<150>itto20140776

<151>2014-09-30

<160>3

<170>专利版本3.5

<210>1

<211>16

<212>prt

<213>智人

<400>1

argargthrgluglugluasnleuarglyslysglygluprohishis

151015

<210>2

<211>16

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<213>智人

<400>2

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151015

<210>3

<211>392

<212>prt

<213>智人

<400>3

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151015

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