3型金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP‑3)的变体、组合物及方法与流程

相关申请的交叉引用及以引用方式并入

本申请要求2014年8月27日提交的62/042,574的优先权益，其在此通过引入并入。

以引用方式全部并入的是与此同时提交并鉴定如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：名为“49907_seqlisting.txt”，154,208个字节，于2015年8月10日创建的ascii文本文件。

发明领域

本发明通常涉及金属蛋白酶抑制剂。具体而言，本发明涉及金属蛋白酶组织抑制剂3(“timp-3”)及其新型有用变体、突变蛋白和衍生物。

发明背景

结缔组织和关节软骨通过胞外基质合成和降解的相反作用而维持动态平衡。基质降解主要通过金属蛋白酶的酶促作用引起，所述金属蛋白酶包括基质金属蛋白酶(mmp)和具有血小板反应蛋白基序的解离素-金属蛋白酶(adamts)。尽管这些酶在许多天然过程(包括发育、形态发生、骨骼重建、伤口愈合及血管生成)中很重要，但认为这些酶导致其水平升高的调节异常在结缔组织的降解性疾病(包括类风湿性关节炎和骨关节炎)以及癌症和心血管疾患中起有害作用。

金属蛋白酶的内源性抑制剂包括血浆α2-巨球蛋白和金属蛋白酶的组织抑制剂(timp)，其中有四种已知在人类基因组中编码。timp-3抑制所有主要软骨降解性金属蛋白酶，且多条证据表明其保护软骨。将该蛋白质添加至软骨-外植体防止细胞因子诱导的降解，并且关节内注射在大鼠内侧半月板撕裂骨关节炎模型中减少软骨损伤。

mmp的调节异常也发生在充血性心力衰竭中，并且被认为其在多种促炎性过程中起作用。然而，开发timp-3作为mmp活性的治疗性抑制剂已因重组蛋白产生和重组形式的timp-3的短半衰期方面的挑战而受阻。具体而言，在大鼠中静脉内施用后，timp-3的血清半衰期少于60分钟，并且此短停留时间不利地影响在疾病部位维持治疗上有用的浓度的能力。因此，本领域需要展现出有利产生、纯化及药物代谢动力学/药效动力学特性的timp-3形式。

发明概述

本发明提供具有有利特性的timp-3多肽，所述有利特性例如增强的药物代谢动力学或药效动力学特性(诸如半衰期)、与天然timp-3相比提高的表达水平、减少的对非靶标(例如清除受体)的亲和力，和/或对于产生而言减少的对肝素的依赖性。

在一些实施方案中，本发明提供timp-3多肽，其融合至一个或多个半衰期延长部分，或经一个或多个半衰期延长部分化学修饰。例如，在一些方面，本发明提供融合蛋白，其包含在timp-3的n末端或c末端处融合至经分离抗体的fc结构域的timp-3(或其片段)。fc结构域可经由fc部分的n末端或c末端融合至timp-3(或其片段)。fc结构域可为单体型或异二聚体型。本发明也涵盖timp-3多肽(或其片段)，其融合至人类血清白蛋白或全抗体(在重链或轻链的n末端或c末端处)。在一些方面，对timp-3(或其片段)的用以延长半衰期的化学修饰包括缀合至聚乙二醇(peg)。

在某些实施方案中，timp-3蛋白在天然序列中携带突变，导致半衰期提高；此类timp-3突变在本文中被描述为例如“timp-3突变蛋白”。在各个方面，timp-3蛋白在氨基酸序列上与seqidno：2中所列出的timp-3的成熟区域具有至少90％同一性，其中突变蛋白具有引入至少一个n-连接的糖基化位点的至少一种突变。在另一个实施方案中，timp-3突变蛋白具有两个、三个或四个新n-连接的糖基化位点；在另一个实施方案中，所引入的n-连接的糖基化位点的数量为五个、六个、七个、八个、九个、十个、十个、十一个或十二个。在各突变蛋白中，还考虑了一个或多个新n-连接的糖基化位点的添加基本上不削弱天然分子的金属蛋白酶抑制活性。

本发明内也呈现timp-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列上与seqidno：2中所列出的timp-3的成熟区域具有至少90％同一性的成熟区域，具有至少一种突变，该突变选自由以下各项组成的组：k45n、v47t、k50n、v52t、p56n、f57n、g58t、h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t及g173t。另外的实施方案包括具有两对或更多对的突变的timp-3突变蛋白，所述突变选自由以下各项组成的组：k45n/v47t、k50n/v52t、p56n/g58t、h78n/q80t、k94n/e96t及d110n/k112t；和具有一对或多对突变的timp-3突变蛋白，所述突变选自由以下各项组成的组：k45n/v47t、k50n/v52t、p56n/g58t、h78n/q80t、k94n/e96t及d110n/k112t，及选自由以下各项组成的组的另一突变：r138t、g173t及r138t与g173t。另外的实施方案包括突变蛋白，其具有任何上述突变组合及另外的突变f57n。

在本发明的一个实施方案中，在timp-3氨基酸序列的选自由以下各项组成的组的区域中引入至少一个n-连接的糖基化位点：由氨基酸44-59组成的区域；由氨基酸77-81组成的区域；由氨基酸93-97组成的区域；由氨基酸109-112组成的区域；由氨基酸137-139组成的区域；由氨基酸172-174组成的区域；及其组合。在另一个实施方案中，timp-3突变蛋白具有两个、三个、四个或五个新n-连接的糖基化位点；在另一个实施方案中，所引入的n-连接的糖基化位点的数量为四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十个、十一个或十二个。

本发明的一个实施方案提供timp-3突变蛋白k45n、v47t、p56n、g58t、q126n、r138t(seqidno：3)；k45n、v47t、p56n、g58t、k94n、e96t、r138t(seqidno：4)；k45n、v47t、p56n、g58t、r138t、g173t(seqidno：5)；k45n、v47t、f57n、k94n、e96t、d110n、k112t(seqidno：6)；k45n、v47t、f57n、k94n、e96t、r138t(seqidno：7)；k45n、v47t、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：8)；k45n、v47t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：9)；k45n、v47t、k94n、e96t、d110n、k112t、g173t(seqidno：10)；k45n、v47t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：11)；k45s、f57n、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：12)；k45s、f57n、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t(seqidno：13)；k50n、v52tp56n、g58t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：14)；k50n、v52t、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：15)；k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：16)；k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t、g173t(seqidno：17)；k50n、v52t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：18)；k50n、v52t、q126n、r138t、g173t(seqidno：19)；p56n、g58t、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t(seqidno：20)；p56n、g58tk94n、e96t、q126n、r138t(seqidno：21)；p56n、g58t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：22)；p56n、g58t、h78n、q80t、k94n、e96t、g173t(seqidno：23)；p56n、g58t、q126n、r138t、g173t(seqidno：24)；h78n、q80t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：25)；及h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：26)。

另外的实施方案包括timp-3突变蛋白k50n/v52t、d110n/k112t、r138t、g173t；k45n/v47t、d110n/k112t、r138t、g173t；h78n/q80t、d110n/k112t、r138t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/a80t、r138t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、r138t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t；k50n/v52t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、k94n/e96t、r138t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t，g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t、g173t；及k45n/v52t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t。

本发明还提供timp-3突变蛋白，其包含seqidno：3-26及51-60中所列出的氨基酸序列(或由其组成)；以及核酸，所述核酸包含编码seqidno：3-26和51-60中任一者的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一方面，本发明提供核酸(例如，经分离的核酸)，其编码根据上述timp-3突变蛋白中任一者的timp-3突变蛋白。本发明的其它方面为包含该核酸的表达载体；用该表达载体转化或转染的宿主细胞(例如，经分离的宿主细胞)；及产生重组timp-3突变蛋白的方法，所述方法包括在促进timp-3突变蛋白表达的条件下培养所转化或转染的宿主细胞，和回收timp-3突变蛋白。

本发明还提供核酸，其包含seqidno：27-50和61-70中所列出的核酸序列(或由其组成)。

还提供组合物，其包含本文所述的timp-3突变蛋白；以及治疗疾患的方法，在该疾患中受timp-3抑制或可由其抑制的基质金属蛋白酶(mmp)和/或其它蛋白酶起病因性或加剧作用，该方法包含向罹患此疾患的个体施用足以治疗该疾患的一定量的此类组合物。

在一个实施方案中，该疾患选自由以下各项组成的组：炎性疾患、骨关节炎、急性心肌梗塞、心脏缺血(包括心肌缺血)、再灌注损伤及进展至慢性心力衰竭(例如充血性心力衰竭)。在各个方面，疾患为血管斑块稳定化、血管病变或新内膜形成。在另一个实施方案中，疾患选自由以下各项组成的组：急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)及特发性肺纤维化(ipf)、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(crohn′sdisease)及乳糜泻)、银屑病、心肌炎包括病毒性心肌炎、与动脉粥样硬化有关的炎症，及关节炎性疾患包括类风湿性关节炎和银屑病性关节炎。

在另一个实施方案中，疾患选自由以下各项组成的组：营养不良性大疱表皮松解症、骨关节炎、假性痛风、类风湿性关节炎包括幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、牙周病，溃疡形成包括角膜、表皮或胃溃疡形成、术后伤口愈合、再狭窄、气肿、佩吉特骨病(paget′sdiseaseofbone)、骨质疏松症、硬皮病、如褥疮中骨或组织压力性萎缩、胆脂瘤、伤口愈合异常、类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身发作的类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、sea综合征(血清阴性、末端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病性关节炎、硬皮病、全身性红斑狼疮、血管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、骨关节炎、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病(wegener′sgranulomatosis)、动脉炎、风湿性多肌痛、肉样瘤病、硬化症、原发性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、舍格伦综合征(sjogren′ssyndrome)、银屑病、斑块状银屑病、滴状银屑病、皮褶银屑病、脓疱性银屑病、红皮性银屑病、皮炎、特应性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯提耳氏病(still′sdisease)、全身性红斑狼疮(sle)、重症肌无力、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、乳糜泻(非热带性口炎性腹泻)、与血清阴性关节病相关的肠病、微小性或胶原性结肠炎、嗜酸粒细胞性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛门吻合术后导致的隐窝炎、胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、多发性硬化症(ms)、哮喘(包括外因性和内因性哮喘以及相关的气道慢性炎性疾患或气道高反应性)、慢性阻塞性肺病(copd，即慢性支气管炎、气肿)、急性呼吸症综合征(ards)、呼吸窘迫综合征、囊肿性纤维化、肺动脉高压、肺血管收缩、急性肺损伤、变应性支气管肺曲霉菌病、过敏性肺炎、嗜酸粒细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、结核病、过敏性肺炎、职业性哮喘、哮喘样病症、肉样瘤、反应性气道疾病(或功能障碍)综合征、棉尘肺、间质性肺病、嗜酸粒细胞过多综合征、鼻炎、鼻窦炎和寄生虫性肺病、与病毒诱导的疾患(例如呼吸道合胞病毒(rsv)、副流感病毒(piv)、鼻病毒(rv)及腺病毒)相关的气道高反应性、格巴二氏病(guillain-barredisease)、格雷夫斯病(graves′disease)、艾迪生病(addison′sdisease)、雷诺氏现象(raynaud′sphenomenon)、自体免疫性肝炎、移植物抗宿主病(gvhd)、脑缺血、创伤性脑损伤、多发性硬化症、神经病、肌病、脊髓损伤及肌萎缩性侧索硬化症(als)。

附图说明

图1为sds-page凝胶的再现，其示出在不同量的肝素存在下产生的timp-3融合蛋白，即融合至抗体的fc部分的n-timp-3(aa1-144)(“timp-3-fc”)的量。泳道#1-4含有fc标准物(“std”)：泳道#1含有100ng人类fc；泳道#2含有250ng人类fc；泳道#3含有500ng人类fc；且泳道#4含有1000ng人类fc。泳道#5-9含有来自在肝素不存在下(泳道#5)、在500mg/l肝素存在下(泳道#6)、在250mg/l肝素存在下(泳道#7)、在100mg/l肝素存在下(泳道#8)或在50mg/l肝素存在下(泳道#9)生长的表达timp-3-fc的chok1细胞的培养基的10μl样品。

图2为sds-page凝胶的再现，其示出在肝素不存在下产生的融合至抗体的fc部分的timp-3突变蛋白的量。泳道#1-4含有fc标准物(“std”)：泳道#1含有100ng人类fc；泳道#2含有250ng人类fc；泳道#3含有500ng人类fc；且泳道#4含有1000ng人类fc。泳道#5表示宿主细胞对照样品。泳道#6-9含有来自表达以下timp-3突变蛋白-fc的chok1细胞的培养基的10μl样品：timp-3[k45n/v47t/k94n/e96t/d110n/k112t/g173t]-fcg1融合物(泳道#6)、timp-3[k45n/v47t/k94n/e96t/d110n/k112t/g173t]-igg1fc+epkss融合物(泳道#7)、timp-3[h78n/q80t/k94n/e96t/d110n/k112t/r138t]-fcg1融合物(泳道#8)或timp-3[h78n/q80t/k94n/e96t/d110n/k112t/r138t]-igg1fc+epkss融合物(泳道#9)。

图3为sds-page凝胶的再现，其示出在肝素存在及不存在下产生的融合至人血清白蛋白(hsa)的天然n-timp-3的量。泳道#1-4含有fc标准物(“std”)：泳道#1含有100ng人类fc；泳道#2含有250ng人类fc；泳道#3含有500ng人类fc；且泳道#4含有1000ng人类fc。泳道#5表示宿主细胞对照样品。泳道#6-11含有来自表达timp-3-hsa的chok1的培养基的不同汇集物的10μl样品：汇集物1用肝素培养(泳道#6)，汇集物2用肝素培养(泳道#7)，汇集物3用肝素培养(泳道#8)、汇集物1在无(“wo”)肝素下培养(泳道#9)，汇集物2在无肝素下培养(泳道#10)，汇集物3在无肝素下培养(泳道#11)。

图4为与tace、rap及lpr-1缔合的timp-3的三维结构图示。位置22和110处的timp-3赖氨酸被标记。还参见wisniewska等人，j.mol.biol.，381，1307-1319(2008)。

图5含有两个线图，其示出timp-3[k45s、f56n]的药物代谢动力学特性，比较荧光面积/总面积(％)或截至梗塞后天数(x轴)的荧光面积/总面积(时间0时的％)(y轴)。

图6含有两个线图，其示出timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)的药物代谢动力学特性，比较荧光面积/总面积(％)或截至梗塞后天数(x轴)的荧光面积/总面积(时间0时的％)(y轴)。

图7为线图，其示出心肌梗塞后施用timp-3多肽后，随时间(天，x轴)观察到的射血分数(％)(y-轴)。三角形＝全长timp-3(30mg)；空心方形＝timp-3的n末端结构域(n-timp3)(30mg)；实心方形＝n-timp3(30mg)；圆形＝对照(盐水)。

图8a-8c为条形图，其示出心肌梗塞后在大鼠中由timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)(图中称为“timp3v82”)介导的改善的心脏功能及减少的心脏重塑。图8a示出对于用媒介物(左侧的条)或timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](右侧的条)处理的受试者，施用后第3天及第7天(x轴)检测的射血分数(％ef，y轴)。图8b示出施用媒介物或timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]后第3天及第7天(x轴)测量的收缩末期容量(esv)(y轴)。图8c示出施用媒介物或timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]后第3天及第7天(x轴)测量的舒张末期容量(esv)(y轴)。

图9为timp-3的三维结构图示，其注解出各个氨基酸的位置。

图10a-10c提供timp-3突变蛋白的氨基酸序列。氨基酸序列中包括的系列“x”表示信号肽的位置(例如seqidno：2的氨基酸1-23)。

发明详述

本发明提供与timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白有关的组合物、试剂盒及方法。也提供核酸及其衍生物和片段，其包含编码此类timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的全部或一部分的核苷酸序列，例如编码此类timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的全部或一部分的核酸；包含此类核酸的质粒及载体，及包含此类核酸和/或载体和质粒的细胞或细胞系。所提供的方法包括例如制备、鉴定或分离展现出所需特性的timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的方法。

存在将有利于增加哺乳动物中的内源性timp-3或提高特定组织中的timp-3水平的众多条件。因此，本文也提供制备组合物诸如药物组合物的方法，所述组合物包含timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白；以及用于将包含timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的组合物施用至受试者、例如罹患疾患的受试者的方法，在该疾患中基质金属蛋白酶活性的调节异常导致组织的过度或不当重塑。

除非本文另外定义，否则结合本发明使用的技术术语应具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，且复数术语应包括单数术语。一般而言，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学和杂交使用的命名法及其技术为本领域所熟知且通常使用的那些。除非另外指示，否则通常根据本领域熟知且如贯穿本说明书所列举且讨论的各种通用和更具体参考文献中所述的常见方法进行本发明的方法和技术。参见例如sambrook等人molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1989)；和ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociates(1992)；及harlow和laneantibodies：alaboratorymanualcoldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1990)，其以引用方式并入本文中。如本领域通常所实现或如本文所描述，根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术。结合本文所述的分析化学、合成有机化学及药学和药物化学使用的术语及其实验室程序和技术为本领域所熟知且通常使用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，及患者治疗。

除非另外指示，否则应理解以下术语具有以下含义：

如用于表征分子(其中分子为例如多肽、多核苷酸或抗体)的术语“分离”指示分子借助于其衍生起源或来源而(1)不与其天然状态所伴有的天然缔合的组分缔合；(2)基本上不含来自相同物种的其它分子；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)在无人类干预情况下在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的分子将自其天然缔合的组分“分离”。也可使用本领域熟知的纯化技术通过分离致使分子基本上不含天然缔合的组分。可通过本领域熟知的多种方式测定分子纯度或均质性。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使用本领域熟知的技术将多肽可视化来测定多肽样品的纯度。出于某些目的，可通过使用hplc或本领域熟知用于纯化的其它手段来提供更高分辨率。在各种实施方案中，本发明提供经分离的timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白；编码timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的经分离的核酸；及包含该核酸或表达载体或产生该多肽、变体、衍生物或突变蛋白的经分离的宿主细胞。

术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”各自指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。这些术语涵盖例如蛋白质序列的天然和人工蛋白质、蛋白质片段和多肽类似物(诸如突变蛋白、变体及融合蛋白)，以及翻译后或以其它方式共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可为单体型或多聚体型。

如本文所用的术语“多肽片段”指与相应的全长蛋白质相比，具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段可为例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200个氨基酸长。片段还可为例如至多1,000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸长。片段还可在其任一末端或两个末端包含一个或多个另外的氨基酸，例如来自不同天然存在的蛋白质的氨基酸序列(例如fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如人工连接子序列或标记蛋白)。

多肽的“变体”或“突变蛋白”(例如timp-3变体或突变蛋白)包含氨基酸序列，其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基经插入氨基酸序列、自氨基酸序列缺失和/或取代至氨基酸序列中。本发明的变体包括融合蛋白。应理解除非上下文另有规定，否则本文所述的“多肽”或“蛋白质”的特征也归属于变体、突变蛋白及衍生物。

“保守氨基酸取代”为基本上不改变亲本序列的结构特点(例如取代氨基酸不应趋向于破坏亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列或其功能性所必需的其它类型的二级结构)的氨基酸取代。本领域认知的多肽二级和三级结构的实例描述于proteins，structuresandmolecularprinciples(creighton，编辑，w.h.freemanandcompany，newyork(1984))；introductiontoproteinstructure(c.branden和j.tooze，编辑，garlandpublishing，newyork，n.y.(1991))；及thornton等人nature354：105(1991)，其各自以引用方式并入本文中。

提及变体或突变蛋白与天然蛋白的相似度的方式为提及所比较的两个(或更多个)多肽序列或编码核酸序列之间的同一性百分比。通过使用gap计算机程序(gcgwisconsin包10.3版(accelrys，sandiego，ca)的一部分)，使用其默认参数来比较序列，来测定两个多核苷酸或两个多肽序列的“同一性百分比”。

多肽的“衍生物”为已经化学修饰的多肽(例如timp-3多肽、变体或突变蛋白)，所述化学修饰例如经由缀合至另一化学部分(诸如例如聚乙二醇或白蛋白，例如人血清白蛋白)、磷酸化和/或糖基化。

使用标准单字母或三字母缩写指示多核苷酸和多肽序列。除非另外指示，否则各多肽序列的氨基末端处于左侧且羧基末端处于右侧；各单链核酸序列及各双链核酸序列的上链的5′末端处于左侧且3′末端处于右侧。特定多肽或多核苷酸序列也可通过解释其与参考序列的如何不同而进行描述。例如，氨基酸的取代在本文中指定为“n#m”，其中“n”表示天然、全长多肽中存在的氨基酸，“#”表示氨基酸残基编号，且“m”表示经取代的氨基酸。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸”通篇可互换使用，且包括dna分子(例如cdna或基因组dna)、rna分子(例如mrna)、使用核苷酸类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的dna或rna的类似物，及其杂合体。核酸分子可为单链的或双链的。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明的timp-3多肽、片段、变体、衍生物或突变蛋白的连续开放阅读框。本文所述的编码timp-3突变蛋白、变体或衍生物的核酸序列列于seqidno：27-50和61-70中。seqidno：27-50和61-70的核苷酸1-69包含timp信号序列。本发明包括包含以下核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列包含与以下序列至少90％的同一性(例如，至少95％同一性或100％同一性)：seqidno：27-50和61-70，以及缺少核苷酸1-69的seqidno：27-50和61-70。

如果两个单链多核苷酸的序列可在反平行取向上对准，使得一个多核苷酸中的每一核苷酸均与另一多核苷酸中的互补核苷酸相反，而无缺口引入且在任一序列的5′或3′端无未配对核苷酸，则两个单链多核苷酸互为彼此的“互补序列”。如果两个多核苷酸可在中等严格条件下彼此杂交，则多核苷酸与另一多核苷酸“互补”。因此，多核苷酸可在不为其互补序列的情况下与另一多核苷酸互补。

“载体”为可用于将连接至其上的另一核酸引入细胞的核酸。一种类型的载体为“质粒”，其指线性或环状双链dna分子，其中可连接另外的核酸区段。另一类型的载体为病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)，其中可将另外的dna区段引入病毒基因组中。某些载体能够在引入其的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，且借此与宿主基因组一起复制。“表达载体”为一种类型的载体，其可指导所选多核苷酸的表达。

如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如表达水平、时机或位置)，则核苷酸序列“可操作连接”至调控序列。“调控序列”为影响可操作连接至其的核酸的表达(例如表达水平、时机或位置)的核酸。调控序列可例如直接或通过一个或多个其它分子(例如结合至调控序列和/或核酸的多肽)的作用而对所调控核酸施加其作用。调控序列的实例包括启动子、增强子及其它表达控制元件(例如多腺甘酸化信号)。调控序列的其它实例描述于例如goeddel，1990，geneexpressiontechnology：methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，ca和baron等人，1995，nucleicacidsres.23：3605-06中。

天然存在的细胞外蛋白典型地包括“信号序列”，其将蛋白质指引至细胞途径中用于蛋白质分泌，且其不存在于成熟蛋白中。信号序列也可称为“信号肽”或“前导肽”，且自细胞外蛋白酶促裂解。已经如此加工(即，信号序列去除)的蛋白质通常称为“成熟”蛋白。编码本发明的蛋白质或多肽的多核苷酸可编码天然存在的信号序列或异源信号序列，其中许多在本领域为已知的。

如本领域的技术人员所了解，根据本实施方案的重组蛋白或多肽可在包括哺乳动物细胞系的细胞系中表达。编码特定蛋白质的序列可用于合适哺乳动物宿主细胞的转化。转化可通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法，包括例如将多核苷酸封入病毒(或病毒载体)且用病毒(或载体)，或通过本领域已知的转染程序转导宿主细胞，如美国专利no.4,399,216；4,912,040；4,740,461；及4,959,455(所述专利以引用方式并入本文中)所示例。所用转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法为本领域所熟知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装至脂质体中，及dna直接微注射至核中。

“宿主细胞”为可用于表达核酸、例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可为原核细胞，例如大肠杆菌(e.coli)，或其可为真核细胞，例如单细胞真核细胞(例如酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人类细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾细胞cos-7系(atcccrl1651)(参见gluzman等人，1981，cell23：175)，l细胞，c127细胞，3t3细胞(atccccl163)，中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物诸如veggiecho及在不含血清的培养基中生长的有关细胞系(参见rasmussen等人，1998，cytotechnology28：31)或缺失dhfr的cho菌株dx-b11(参见urlaub等人，1980，proc.natl.acad.sci.usa77：4216-20)，hela细胞，bhk(atcccrl10)细胞系，来源于非洲绿猴肾细胞系cv1(atccccl70)的cv1/ebna细胞系(参见mcmahan等人，1991，emboj.10：2821)，人类胚肾细胞诸如293、293ebna或msr293，人类表皮a431细胞，人类colo205细胞，其它转化的灵长类细胞系，正常二倍体细胞，自初生组织，初生外植体的体外培养物来源的细胞菌株，hl-60，u937，hak或jurkat细胞。

典型地，宿主细胞为可用编码多肽的核酸转化或转染的经培养细胞，该编码多肽的核酸接着可在宿主细胞中表达。在“瞬时转染”中，核酸通过本领域已知的数种方法之一引入宿主细胞，且重组蛋白经表达一段有限时期，典型地多达约四天，之后核酸丢失或降解，例如在宿主细胞进行有丝分裂时。如果需要“稳定转染”，则可将编码多肽的核酸与编码可选标记物的核酸一起引入宿主细胞。使用可选标记物允许本领域的技术人员选择所转染的宿主细胞，其中以一种方式将编码多肽的核酸整合至宿主细胞基因组中，使得通过有丝分裂维持编码多肽的核酸且可由子代细胞表达。

短语“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含核酸、但不在所需水平上表达其(除非将调控序列引入宿主细胞，使得其变得与核酸可操作连接)的细胞。应理解，术语宿主细胞不仅指特定受试者细胞，而也指此细胞的子代或潜在子代。由于某些修饰因例如突变或环境影响而可存在于继代中，因此此子代实际上可不与亲本细胞完全相同，但仍包括在如本文所用术语的范围内。

如本文所用，“timp-3dna”、“timp-3编码dna”及类似术语指示所选timp-3编码核酸，其中自其表达的timp-3可为如本文所述的天然timp-3或timp-3变体或突变蛋白。同样，“timp-3”、“timp-3蛋白”及“timp-3多肽”用于指天然timp-3蛋白或包含一个或多个突变的timp-3蛋白(即timp-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白)。timp-3的特定突变蛋白可通过一种或多种突变来指定，例如“k45n”或“k45ntimp-3”或者“timp-3k45n”或“k45ntimp-3多肽”指示其中天然timp-3的氨基酸45处的赖氨酸(k)已经天冬酰胺(n)取代的多肽。

如本文所用的术语“天然timp-3”指野生型timp-3。timp-3在哺乳动物中由各种细胞或组织表达，且存在于胞外基质中；如此表达的timp-3在本文也称为“内源性”timp-3。timp-3的氨基酸序列及编码timp-3的dna的核酸序列公开于2003年5月13日颁予的美国专利6,562,596中，其公开内容以引用方式并入本文中。美国专利6,562,596中使用的氨基酸编号系统用负数指定信号(或前导)肽中的氨基酸，且将成熟蛋白(即，已去除信号或前导肽的蛋白)指代为氨基酸1-188。本文所用的编号系统提及timp-3，其中天然前导肽的第一氨基酸指定为#1；因此全长timp-3包括氨基酸1-211，且成熟形式为氨基酸24-211。本领域的普通技术人员易于理解可通过使用这些不同编码系统发生的氨基酸编号的差异，且因此可易于将本文所用的编号系统应用至例如timp-3多肽，其中成熟形式的第一氨基酸称为#1。因此，例如使用美国专利6,562,596的编号系统将如本文指定的k45n指定为k22n。

timp-3由两个结构域形成，即包含timp-3的氨基酸24至143(即，分子的约三分之二)的n末端结构域及包含氨基酸144至211的c末端结构域。timp-3展现出促进二级和三级结构timp-3形成的复杂二硫键。已发现timp-3的通常称为“n-timp-3”的n末端结构域展现出至少一些timp-3生物活性；因此，如本文所述的timp-3变体、衍生物及突变蛋白包括包含n末端结构域的timp-3片段的变体、衍生物及突变蛋白。

天然timp-3蛋白对于其用作治疗性分子呈现出数种挑战。例如，使用标准哺乳动物表达技术，timp-3蛋白的哺乳动物表达效价过低而无法允许以适于治疗性蛋白质的规模产生足够量的timp-3。此外，timp-3与胞外基质的结合使得肝素(或减少timp-3与胞外基质结合的相似试剂)在细胞培养基中的含入成为必需，且与低密度脂蛋白受体有关蛋白1(lrp1)清除蛋白的结合加剧重组timp-3以允许开发生产规模工艺的水平分泌至培养基中的挑战。由于蛋白质的不正确折叠，已证明难以在原核细胞中微生物产生全长timp-3。

因此，本发明的timp-3变体或突变蛋白已加以修饰以克服一个或多个此类挑战。本发明的多肽包括已以任何方式且出于任何原因加以修饰的多肽，例如以：(1)减少对蛋白水解的易感性；(2)减少对氧化的易感性；(3)减少细胞培养中对抑制timp-3与胞外基质结合的试剂的需要；(4)改变对其它部分例如清除受体诸如lrp-1的结合亲和力；(5)赋予或改进其它物理化学或功能特性，包括药物代谢动力学和/或药效动力学；或(6)促进重组蛋白的表达和/或纯化。类似物包括多肽的突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(例如，在多肽的形成分子间接触的一个或多个结构域之外的部分)中进行单个或多个氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。共有序列可用以选择用于取代的氨基酸残基；本领域技术人员认知到另外的氨基酸残基也可被取代。

在本发明的一方面，提供展现出与对于天然timp-3所观察相比，突变蛋白或变体表达水平增加的timp-3突变蛋白或变体；在本发明的另一方面，增加的表达发生在哺乳动物细胞表达系统中。表达水平可通过将允许定量或半定量分析细胞培养上清液、即条件培养基(cm)中的重组timp-3(天然、变体或突变蛋白)的量的任何合适方法来测定。在一个实施方案中，通过蛋白质印迹评估样品或cm；在另一个实施方案中，使用标准人类timp-3elisa评估cm样品。

在一个实施方案中，在瞬时表达系统中观察到表达增加；在另一个实施方案中，在稳定转染系统中观察到表达增加。一个实施方案提供timp-3突变蛋白或变体，与对于天然timp-3所观察相比，对于其观察到表达增加2倍(2×)；另一个实施方案提供timp-3突变蛋白或变体，与对于天然timp-3所观察相比，对于其观察到表达增加5倍(5×)。另外的实施方案包括timp-3突变蛋白或变体，其表达增加3倍(3×)、4倍(4×)或6倍(6×)。在一个实施方案中，timp-3突变蛋白或变体的表达比天然timp-3所观察到的表达大10倍(10×)；在另一个实施方案中，所观察到的表达比天然timp-3所观察到的表达大10倍以上，例如20倍(20×)或更大。

在本发明的另一方面，提供展现出对添加肝素(或抑制timp-3与胞外基质结合的另一试剂)至细胞培养基的要求减少(即，肝素不依赖性)的timp-3突变蛋白(或变体)。肝素(或其它试剂)的量减少可以半定量方式来描述，即减少可为部分、中度、基本上或完全的。在另一个实施方案中，减少表示为百分比，例如肝素(或相似试剂)的量可减少10％、20％、30％、40％、50％或更多(例如60％、70％、80％、90％或100％)。具有至少某种程度的肝素不依赖性的timp-3突变蛋白的实例包括但不限于融合至hsa的timp-3k45s、f57n；timp-3k45n/v47t、p56n/g58t、k94n/e96t、r138t(seqidno：4)；timp-3k45n/v47t、k94n/e96t、d110n/k112t、g173t(seqidno：9)；timp-3h78n/q80t、k94n/e96t、d110n/k112t、r138t(seqidno：26)；及融合至hsa的timp-3h78n/q80t、k94n/e96t、d110n/k112t、r138t(seqidno：26)。可使用减少水平的肝素产生融合至hsa的n-timp-3。在一个实施方案中，提供包含插入糖基化位点的timp-3变体或突变蛋白。如本领域所已知，糖基化模式可取决于蛋白质序列(例如特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在，以下进行讨论)或其中产生该蛋白质的宿主细胞或生物体。以下讨论特定表达系统。糖基化的存在、不存在或程度可通过本领域的技术人员已知的任何方法来测定，包括分子量(mw)偏移的半定性测量，如通过蛋白质印迹或自考马斯染色的sds-page凝胶所观察，而定量测量可包括利用质谱仪技术和观察对应于天冬酰胺连接的糖基化的添加的mw偏移，或通过观察由酶诸如肽-n-糖甘酶f(pngase-f；sigmaaldrich，st.louis，mo)去除天冬酰胺连接的糖基化而伴有的质量偏移。

多肽的糖基化典型地经n-连接或o连接。n-连接指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸(nxs)及天冬酰胺-x-苏氨酸(nxt)为将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列，其中x为除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，这些三肽序列的任一者在多肽中的存在产生潜在糖基化位点。o-连接糖基化指糖n-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至羟基氨基酸，最通常丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

向蛋白质(例如timp-3)添加糖基化位点便利地通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上述三肽序列(用于n-连接的糖基化位点)来完成。改变也可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至起始序列(用于o-连接的糖基化位点)或用其进行取代来进行。为简便起见，优选通过dna水平的变化改变蛋白质氨基酸序列，所述变化特别通过使编码标靶多肽的dna在预选堿基处突变使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。

因此，可通过改变用于单一氨基酸的密码子添加n-连接的糖基化位点。例如，编码n-x-z(其中z为任何氨基酸)的密码子可经改变以编码n-x-t(或n-x-s)，或编码y-x-t/s的密码子可经改变以编码n-x-t/s。可替代地，可同时改变编码两个氨基酸的密码子，以引入n-连接的糖基化位点(例如，y-x-z的密码子可经改变以编码n-x-t/s)。以此方式，可插入一至十二个n-连接的糖基化位点。糖基化插入也可用于改进表达(参见，例如enhancingthesecretionofrecombinantproteinsbyengineeringn-glycosylationsites.liuy.等人，amerinstchemeng2009，第1468页)。

除在timp-3中插入n-连接的糖基化位点外，可修饰天然timp-3中存在的任何糖基化位点，例如以试图使分子结构稳定。因此，例如，残基208处的a可经诸如y、v或g的不同残基取代。对残基206-208处的‘n-x-t’位点的另外修饰包括用f取代残基205处的i，或用y取代残基205处的i，与上述在残基208处的取代之一组合。

因此，在另一个实施方案中，针对n-糖基化可能性，筛选通过计算分析开发的溶剂暴露位点的子集。对于涉及插入糖基化位点的方法，n-糖基化预测工具可用于选择可加以突变以促进潜在n-连接的糖基化的位点，例如通过鉴定可加以突变以形成标准n-x-t糖基化位点(其中n为天冬酰胺，x为任何氨基酸且t为苏氨酸)的残基。在另一个实施方案中，使用基于结构的方法来鉴定所有溶剂暴露的氨基酸(包括侧链暴露＞的氨基酸)。另一个实施方案包括timp-3上lrp1相互作用性赖氨酸的突变，此基于具有针对timp-3定位的相互作用性rap赖氨酸的lrp1/rap(受体缔合的蛋白质)的晶体结构。

本文考虑了另外的组合。例如，可组合赖氨酸残基处的突变进行本文公开的任何突变，其中赖氨酸残基为timp-3中的任何赖氨酸。在一个实施方案中，使单一赖氨酸突变；在另一个实施方案中，使两个、三个、四个或五个赖氨酸残基突变。在某些实施方案中，可使氨基酸45和/或133处的赖氨酸残基突变。在另一实例中，突变引入单一n-连接的糖基化位点；此突变可与另外的突变一起进行以引入另外的糖基化位点，或与设计来影响timp-3的另一特性的另外的突变一起进行。本文考虑了timp-3突变蛋白或变体，其包含一个引入的n-连接的糖基化位点，所述位点包括两个、三个或四个引入的n-连接的糖基化位点且包括五个或更多个引入的n-连接的糖基化位点。

2014年3月12日提交的美国申请14/207,178和2014年3月13日提交的pct申请pct/us2014/026811的图1和2中示出特定突变，其公开内容以引用方式并入本文中。那些图呈现天然、全长人类timp-3与突变形式的全长人类timp-3的比对，其中字母“x”已被取代为序列内的特定氨基酸。信号序列加下划线；因此，如本文所述，可取代其它信号序列。

本文在序列表中呈现所选突变蛋白的氨基酸序列。提供全长蛋白序列。在许多情况下，信号序列不存在于序列表中针对各种突变蛋白所列的序列中，以促进同一氨基酸残基编号系统及本领域的技术人员对本文所用的氨基酸名称的理解。本发明包括本文所列的突变蛋白序列，所述突变蛋白序列还包含信号序列，该信号序列在各种实施方案中为seqidno：2中作为氨基酸1-23(即，mtpwlglivllgswslgdwgaea)提供的序列。seqidno：2为代表性天然timp-3氨基酸序列。本领域的技术人员应理解：在加工蛋白质以产生n末端以氨基酸半胱氨酸起始的成熟蛋白质过程中去除信号肽。在各种实施方案中，n末端半胱氨酸在timp-3突变蛋白中保守。本领域的技术人员也将理解在细胞中表达timp-3突变蛋白dna与分离蛋白质之间，发生蛋白质的翻译后修饰。翻译后修饰的特定实例包括糖基化(例如n-连接的糖基化)和去除信号肽；也考虑了另外的修饰，包括磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化、蛋白水解等。

已知天然timp-3信号序列可用于表达timp-3突变蛋白，或另一信号序列可经取代。因此，残基1处的氨基酸可为m或另一种氨基酸；残基2处的氨基酸可为t或另一种氨基酸，残基3处的氨基酸可为p或另一种氨基酸等，直至氨基酸23。另外，信号序列可包含另外的氨基酸(即，长于天然timp-3的信号序列)或可包含少于23个的氨基酸(即，短于天然timp-3的信号序列)。不管信号序列的长度，本领域的普通技术人员将能够利用本文的编号系统来制备本公开的timp-3突变蛋白，以及可制备的其它突变蛋白。

在成熟形式的timp-3中预想某些取代，并且所述某些取代在本文中被指定为“n#m”，其中“n”指天然、全长timp-3中存在的氨基酸，“#”指氨基酸残基编号且“m”指经取代的氨基酸。因此，例如“k45n”指示氨基酸45处的赖氨酸(k)已被天冬酰胺(n)取代。本文示例的突变形式的人类timp-3包含以下突变(单独或组合)：k45n；v47t；k50n；v52th78n；k94n；e96t；d110n；k112t；r138t；及g173t。也涵盖这些突变的组合，且其可包括二至十二(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)个上述取代。例如，在一个实施方案中，timp-3突变蛋白包含具有以下取代的seqidno：2的氨基酸24-211(或由其组成)：h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t及r138t。

突变的特定组合包括k50n/v52t、d110n/k112t、r138t、g173t；k45n/v47t、d110n/k112t、r138t、g173t；h78n/q80t、d110n/k112t、r138t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/a80t，r138t；k45n/v47t、h78n/q80td110n/k112t，g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、r138t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t，g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t；k50n/v52t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、k94n/e96t，r138t，g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t、g173t；及k45n/v52t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t。

另外的组合包括k50n/v52t、d110n/k112t、r138t、g173t；k45n/v47t、d110n/k112t、r138t、g173t；h78n/q80t、d110n/k112t、r138t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/a80t、r138t；k45n/v47t、h78n/q80td110n/k112t，g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、r138t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t，g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t；k50n/v52t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t，g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、r138t、g173t；k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t，g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、k94n/e96t，r138t、g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、k94n/e96t、r138t、g173t；k45n/v47t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t，g173t；k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t，g173t；及k45n/v47t、k50n/v52t、h78n/q80t、d110n/k112t、r138t。

在各种实施方案中，突变蛋白为k45n、v47t、p56n、g58t、q126n、r138t(seqidno：3)；k45n、v47t、p56n、g58t、k94n、e96t、r138t(seqidno：4)；k45n、v47t、p56n、g58t、r138t、g173t(seqidno：5)；k45n、v47t、f57n、k94n、e96t、d110n、k112t(seqidno：6)；k45n、v47t、f57n、k94n、e96t、r138t(seqidno：7)；k45n、v47t、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：8)；k45n、v47t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：9)；k45n、v47t、k94n、e96t、d110n、k112t、g173t(seqidno：10)；k45n、v47t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：11)；k45s、f57n、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：12)；k45s、f57n、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t(seqidno：13)；k50n、v52tp56n、g58t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：14)；k50n、v52t、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：15)；k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：16)；k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t、g173t(seqidno：17)；k50n、v52t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：18)；k50n、v52t、q126n、r138t、g173t(seqidno：19)；p56n、g58t、h78n、q80t、k94n、e96t、r138t(seqidno：20)；p56n、g58tk94n、e96t、q126n、r138t(seqidno：21)；p56n、g58t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t(seqidno：22)；p56n、g58t、h78n、q80t、k94n、e96t、g173t(seqidno：23)；p56n、g58t、q126n、r138t、g173t(seqidno：24)；h78n、q80t、k94n、e96t、r138t、g173t(seqidno：25)。

timp-3变体、突变蛋白或衍生物具有极其类似于天然timp-3的氨基酸序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，timp-3变体、突变蛋白或衍生物将与天然timp-3具有至少85％同一性；在另一个实施方案中，timp-3变体、突变蛋白或衍生物将与天然timp-3具有至少90％同一性；在另一个实施方案中，timp-3变体、突变蛋白或衍生物将与天然timp-3具有至少95％同一性。在另外的实施方案中，timp-3变体、突变蛋白或衍生物与天然timp-3具有至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性。如本文所用，同一性百分比指成熟全长变体、突变蛋白或衍生物与成熟全长形式的天然timp-3、即缺少信号肽(timp-3的氨基酸24至211)的timp-3的比较。本领域的技术人员将易于理解可在timp-3的n末端结构域的变体、突变蛋白或衍生物与天然timp-3的n末端结构域之间进行类似比较。

也可通过突变蛋白或变体与天然timp-3之间不同的氨基酸的数量表示相似性。例如，timp-3变体或突变蛋白可与天然timp-3有一个氨基酸、两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸、五个氨基酸、六个氨基酸、七个氨基酸、八个氨基酸、九个氨基酸或十个氨基酸不同。与天然timp-3有10个氨基酸不同的变体或突变蛋白将与天然timp-3具有约95％同一性。在另外的实施方案中，timp-3变体或突变蛋白与天然成熟timp-3有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸不同。

可在编码timp-3多肽(天然、突变蛋白、变体或衍生物)的核酸中进行另外的变化以促进表达。例如，天然timp-3的信号肽可经不同信号肽取代。

在本发明范围内的timp-3多肽的其它衍生物包括timp-3多肽或其片段与其它蛋白质或多肽的诸如通过表达包含融合至timp-3多肽的n末端或c末端的异源多肽的重组融合蛋白的共价缀合物或聚集缀合物。例如，缀合的肽可为异源信号(或前导)肽，例如酵母α-因子前导序列或诸如表位标记的肽。本领域的普通技术人员应理解异源信号肽的长度可不同于天然timp-3信号肽，但可通过比对使用异源信号肽产生的timp-3多肽的n末端半胱氨酸残基，正确地鉴定相对于成熟timp-3的氨基酸序列的突变蛋白的位置。

含timp-3多肽的融合蛋白可包含添加以促进timp-3多肽的纯化或鉴定的肽(例如聚组氨酸)。另一标记肽为hopp等人，bio/technology6：1204，1988和美国专利5,011,912描述的肽。肽具有高度抗原性，且提供通过特异性单克隆抗体(mab)可逆结合的表位，从而能够快速测定且易于纯化所表达的重组蛋白。可用于制备其中肽融合至给定多肽的融合蛋白的试剂为可商购获得的(sigma，st.louis，mo)。

在各种实施方案中，本文所述的timp-3多肽(例如，本文所述的任一timp-3突变蛋白)融合至延长多肽的体内半衰期的部分。示例性部分包括但不限于抗体(例如igg)或其片段(例如抗体诸如igg的fc部分)或白蛋白(例如人血清白蛋白)。可替代地或另外，timp-3多肽包含在体内施用时结合白蛋白的白蛋白结合结构域或脂肪酸。白蛋白结合结构域的实例为“白蛋白-标记(albu-tag)”，即源自4-(对碘苯基)-丁酸的部分(dumelin等人，angewchemintedengl47：3196-3201(2008))。该部分可融合至timp-3多肽的n末端或融合至c末端，且该部分本身可处于任何取向(即，通过部分n末端或c末端连接)。任选地，该部分经由连接子诸如柔性肽连接子(例如，包含1-10或2-4个甘氨酸例如四个甘氨酸的连接子，或epkss(seqidno：75))连接至timp-3多肽。本文所述的timp-3多肽的融合配偶体的实例包括但不限于seqidno：71的人血清白蛋白、seqidno：72的人fcg1、seqidno：73的fc-mono及seqidno：74的人fc-monondel5。本发明考虑了融合蛋白，其包含经融合至本文所述的任何融合配偶体(例如seqidno：71-74)的本文所述的任何突变蛋白(例如seqidno：3-26)。

共价修饰也被认为为timp-3多肽的衍生物且包括在本发明的范围内，且通常但不总在翻译后进行。例如，可通过使抗原结合蛋白的特定氨基酸残基与能够与所选侧链或n-或c末端残基反应的有机衍生剂反应，将timp-3的数种类型的共价修饰引入分子。

最通常使半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(及相应胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以得到羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与以下各物反应来进行衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、n-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-比啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。因此，在本发明的一方面，例如通过将一个或多个所选密码子改变为编码cys来将半胱氨酰残基添加至天然timp-3序列。可在timp-3的示出对表达、折叠或如本文所示的其它特性重要的区域中进行此类cys取代。

本发明的蛋白上碳水化合物部分的数量可通过将糖苷化学偶联或酶促偶联至蛋白质而增加。这些程序的有利之处在于其不要求在具有n-和o-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。根据所用偶联方式，可将一个或多个糖连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，诸如苯丙胺酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于1987年9月11日公开的wo87/05330及aplin和wriston，1981，crccrit.rev.biochem.，第259-306页中。

去除起始重组蛋白上存在的碳水化合物部分可化学或酶促完成。化学脱糖基化要求将蛋白质暴露至化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(n-乙酰基葡萄糖胺或n-乙酰基半乳糖胺)外的大部分或所有糖裂解，而多肽保留完整。化学脱糖基化由hakimuddin等人，1987，arch.biochem.biophys.259：52和edge等人，1981，anal.biochem.118：131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如thotakura等人，1987，meth.enzymol.138：350描述的多种内切和外切糖苷酶达成。可通过使用化合物衣霉素防止潜在糖基化位点处的糖基化，如duskin等人，1982，j.biol.chem.257：3105所描述。衣霉素阻断蛋白质-n-糖苷键连的形成。

对抗原结合蛋白的另一类型的共价修饰包括以美国专利no.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式将蛋白质连接至各种非蛋白性聚合物，包括但不限于各种多元醇诸如聚乙二醇(例如约40kd、30kd、20kd、10kd、5kd或1kd大小的peg)、聚丙二醇或聚氧化烯。其它有用聚合物包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素、聚-(n-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚唾液酸(psa)、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇，以及任何上述各物的混合物。在一方面，本发明的timp-3多肽为peg化肽。另外，如本领域所已知，可在蛋白质内的各种位置进行氨基酸取代，以促进此类聚合物的添加。

在各个方面，对天然timp-3氨基酸序列进行的以得到本发明的timp-3变体、突变蛋白或衍生物的修饰基本上不削弱天然timp-3活性。例如，timp-3变体、突变蛋白或衍生物优选抑制一种或多种基质金属蛋白酶(例如mmp-2、mmp-9和/或mmp-13)，抑制一种或多种聚蛋白多糖酶(adams)(例如adamts4和/或adamts5)，抑制肿瘤坏死因子α(tnf-α)转化酶(tace)，抑制体外或体内tnf-α产生，抑制胞外基质降解和/或抑制炎症。实例中提供表征timp-3多肽活性的示例性方法。任选地，timp-3变体、突变蛋白或衍生物展现出至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的任一与天然timp-3相关联的活性，包括以上所述的活性。可替代地或另外，与天然timp-3相比，timp-3变体、突变蛋白或衍生物任选地展现出活性(例如mmp-2或mmp-9抑制)降低不超过10倍、降低不超过5倍或降低不超过2倍。

timp-3多肽的表达

可使用本领域已知的任何表达系统来制备本发明的重组多肽。一般而言，将宿主细胞用包含编码所需timp-3多肽(包括timp-3突变蛋白或变体)的dna的重组表达载体转化。可采用的宿主细胞为原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞及确立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞cos-7系(atcccrl1651)(gluzman等人，1981，cell23：175)、l细胞、293细胞、c127细胞、3t3细胞(atccccl163)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、bhk(atcccrl10)细胞系，及源自非洲绿猴肾细胞系cvi(atccccl70)的cvi/ebna细胞系，如mcmahan等人，1991，emboj.10：2821所描述。用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体由pouwels等人(cloningvectors：alaboratorymanual，elsevier，newyork，1985)描述。

哺乳动物细胞表达对于timp-3多肽产生可提供优势，优势在于促进与天然timp-3密切相似的构象的折叠和采用。众多哺乳动物细胞表达系统为本领域已知的，和/或可商购获得；后者包括诸如以下的系统：(设计供易用于中国仓鼠卵巢(cho)来源的悬浮培养物中重组蛋白克隆和表达的所有方面的产品；probiogen，lifetechnologies；carlsbad，ca)、gs基因表达系统^tm(设计来提供高产率、稳定、cgmp相容性哺乳动物细胞系的开发的转染系统；lonzabiologics，slough，uk)、技术(设计来促进大规模生产重组蛋白的工具包，其利用源自单一、永生化人类细胞衍生的连续分裂的一组细胞；crucell，leiden，thenetherlands)，或永生化羊水细胞诸如cap和cap-t(用于表达和产生复杂蛋白质的人类细胞基表达系统；cevec，cologne，germany)。

另外的细胞表达系统包括诸如以下的系统：selexissuretechnologyplatform^tm(可应用至多种细胞系以促进开发用于产生重组蛋白的细胞系的技术平台；selexisinc.，switzerland)；哺乳动物转染系统(提供高效细胞转染以用于产生重组蛋白的转染系统；promega，madisonwi)；expi293^tm表达系统(高密度哺乳动物瞬时蛋白表达系统，lifetechnologies，grandisland，ny)；及vlx^tm和stx^tm瞬时转染系统(用于产生包括抗体的重组蛋白的可缩放转染系统；maxcyte，gaithersurg，md)。本领域技术人员进一步意识到其它表达系统，诸如最初由wigler等人(cell1979：777)描述的技术，及例如加拿大国立研究会(nationalresearchcouncilofcanada)在其网站上描述的其它技术。

本领域已知各种容器适于培养所转化细胞和产生重组蛋白。这些容器包括24深孔板，250ml及1l摇瓶；及各种尺寸的各种生物反应器，例如2l、5l、10l、30l、100l、1000l、10000l及更大生物反应器。用于细胞培养的其它合适容器在本领域是已知的，且也可如本文所述使用。

细胞培养基制剂在本领域中是熟知的；典型地，培养基提供细胞最低生长和/或存活所要求的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质及微量元素，以及缓冲液和盐。培养基也可含有增强生长和/或存活高于最小速率的补充组分，包括但不限于激素和/或其它生长因子，尤其是离子(诸如钠、氯化物、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(无机化合物，通常以极低最终浓度存在)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量源；如本文所描述，可添加细胞周期抑制剂至培养基。在某些实施方案中，有利地将培养基配制至对于细胞存活和增殖最佳的ph和盐浓度。在某些实施方案中，培养基为在开始细胞培养之后添加的补料培养基。在某些实施方案中，细胞培养基为起始营养溶液和在开始细胞培养之后添加的任何补料培养基的混合物。

各种组织培养基，包括限定的培养基，为可商购获得的，例如尤其可使用以下细胞培养基中的任一种或其组合：rpmi-1640培养基、rpmi-1641培养基、杜尔贝科氏改良伊格尔培养基培养基(dulbecco′smodifiedeagle′smedium，dmem)、伊格尔最低必需培养基(minimumessentialmediumeagle)、f-12k培养基、哈姆f12培养基(ham′sf12medium)、伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(iscove′smodifieddulbecco′smedium)、麦考伊氏5a培养基(mccoy′s5amedium)、莱博维茨氏l-15培养基(leibovitz′sl-15medium)及不含血清的培养基，诸如ex-cell^tm300系列(jrhbiosciences，lenexa，kansas)。不含血清形式的此类培养基也可用。细胞培养基可补充有另外的或增加浓度的组分诸如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等，这取决于待培养的细胞的要求和/或所需细胞培养参数。

可在促进多肽表达条件下培养所转化细胞，且通过常规的蛋白质纯化程序回收多肽。一种此类纯化程序包括使用亲和力色谱法以及本领域已知的其它方法。自哺乳动物上清液分离亲本timp-3或timp-3突变蛋白的方法为利用融合至羧基末端6x-组氨酸标记的timp-3与6x-组氨酸亲和力ni-琼脂糖凝胶树脂(例如，固定金属亲和力色谱法(imac)；通用程序为本领域已知，且用于此类程序的试剂及此类程序的实例由qiagen，germantown，md及gehealthcare，pittsburg，pa概括)的组合。可利用阳离子交换色谱法(例如，sp-hpgehealthcare)在imac洗脱后来进一步分离timp-3，或作为替代策略而不使用imac从哺乳动物上清液捕获timp-3(在使用中性ph下的氯化钠梯度情况下，发生timp-3及其突变蛋白的洗脱)。尺寸排阻色谱法(例如，superdexgeheathcare(移动相实例：10mmna2hpo4、1.8mmkh2po4、137mmnacl、2.7mmkcl))为可用于进一步分离timp-3或其突变蛋白的通用策略(组合imac过程或离子交换色谱法)。这些和其它方法为本领域已知；参见例如proteinpurification：principles：highresolutionmethods，andapplications，第三版(2012，johnwiley和sons；hoboken，nj)。

多肽(天然timp-3或timp-3突变蛋白或变体)的量可通过任何合适的定量或半定量方法来测定，该方法将允许分析细胞培养上清液、即条件培养基(cm)中的重组timp-3(天然、变体或突变蛋白)的量。合适的定性或半定量方法包括蛋白质印迹和考马斯染色的sdspage凝胶。定量测量可包括使用酶免疫测定，诸如人类timp-3elisa(r&dsystemsinc.，minneapolis，mn)或fortebio(pallfortebiocorp，menlopark，ca)与抗体介导的timp-3捕获，或对经纯化timp-3的直接uv(紫外)吸光度(280nm)测量。

因此，timp-3中特定突变的作用可通过比较所制备的重组突变蛋白的量与在类似培养条件下制备的天然蛋白的量进行评价。timp-3突变蛋白或变体可在比对天然timp-3所观察的水平高1×、2×、3×、4×、5×、10×或更高的水平下表达。需要时，可测定特定转化或转染的细胞系的比生产率以允许比较，或测定各种形式的timp-3的比生产率。比生产率或qp以皮克重组蛋白/细胞/天(pg/c/d)表示，并且可通过应用本领域已知定量培养物中的细胞的方法及上述定量重组蛋白的方法而易于测定。

timp-3多肽的用途

timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物可在例如测定中使用，或它们可用来治疗其中需要更高水平的timp-3活性的任何疾患(即，其中基质金属蛋白酶(mmp)和/或经或可经timp-3抑制的其它蛋白酶起病因性或加剧性作用的疾患)，所述疾患包括但不限于炎性疾患、骨关节炎及其它其中发生过度或不当mmp活性的疾患(例如，心肌缺血、再灌注损伤、血管病变、新内膜形成且在进展至慢性心力衰竭(例如充血性心力衰竭)过程中)。炎性疾患包括哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)及特发性肺纤维化(ipf)、炎性肠病(例如渍疡性结肠炎、克罗恩氏病及乳糜泻)、银屑病(psoriases)、心肌炎(包括病毒性心肌炎)、与动脉粥样硬化有关的炎症，及关节炎性疾患(包括类风湿性关节炎、银屑病性关节炎)等。

本文所述的timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物组合物改变发病机理，且提供对特征在于基质降解和/或炎症的疾病或疾患、即其中金属蛋白酶起有害作用的那些疾病或疾患的有益治疗。所述组合物可单独使用或与用于治疗此类疾患的一种或多种药剂结合使用。因此，本发明的timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物组合物可用于治疗其中金属蛋白酶活性引起过度基质损失(降解)的任何病症。在治疗各种病症中本发明的timp-3变体、突变蛋白或衍生物组合物可单独使用或其它药物组合使用，所述病症与胶原酶、明胶酶、聚蛋白多糖酶或其它一种或多种基质降解或促炎症酶的过度产生有关联，包括营养不良性大疱表皮松解症、骨关节炎、假性痛风、类风湿性关节炎(包括幼年型类风湿性关节炎)、强直性脊柱炎、硬皮病、牙周病、溃疡形成(包括角膜、表皮或胃溃疡形成)、术后伤口愈合及再狭窄。其中胶原和/或蛋白聚糖过度降解可起一定作用且因此其中可应用timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物组合物的其它病理学疾患包括气肿、佩吉特骨病、骨质疏松症、硬皮病、如褥疮中骨或组织压力性萎缩、胆脂瘤及伤口愈合异常。直接或间接为timp-3量降低或金属蛋白酶量增加(例如在心肌缺血、再灌注损伤中及在进展至充血性心力衰竭过程中)的结果的另外疾患也可用本发明描述的组合物治疗，单独或结合通常用于治疗罹患此类疾患的个体的其它药物。本文描述的组合物可用于血管斑块稳定化并抑制血管新内膜形成。timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物组合物可另外应用作为对其它伤口愈合促进剂的辅佐，例如以在愈合过程中调节胶原的反转。

许多金属蛋白酶也展现出促炎性活性；因此，另外的实施方案包括治疗炎症和/或自体免疫病症的方法，其中所述病症包括但不限于软骨炎症和/或骨降解、关节炎、类湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身发作的类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、sea综合征(血清阴性、末端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病性关节炎、硬皮病、全身性红斑狼疮、血管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、骨关节炎、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、动脉炎、风湿性多肌痛、肉样瘤病、硬化症、原发性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、舍格伦综合征、银屑病、斑块状银屑病、滴状银屑病、皮褶银屑病、脓疱性银屑病、红皮性银屑病、皮炎、特应性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯提耳氏病、全身性红斑狼疮(sle)、重症肌无力、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、乳糜泻(非热带性口炎性腹泻)、与血清阴性关节病相关的肠病、微小性或胶原性结肠炎、嗜酸粒细胞性胃肠炎、或直肠结肠切除术及回肠肛门吻合术后导致的隐窝炎、胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、多发性硬化症(ms)、哮喘(包括外因性和内因性哮喘以及有关慢性炎性疾患，或气道过度应答)、慢性阻塞性肺病(copd，即慢性支气管炎、气肿)、急性呼吸症综合征(ards)、呼吸窘迫综合征、囊肿性纤维化、肺动脉高压、肺血管收缩、急性肺损伤、变应性支气管肺曲霉菌病、过敏性肺炎、嗜酸粒细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、结核病、过敏性肺炎、职业性哮喘、哮喘样病症、肉样瘤、反应性气道疾病(或功能障碍)综合征、棉尘肺、间质性肺病、嗜酸粒细胞过多综合征、鼻炎、鼻窦炎及寄生虫性肺病、与病毒诱导的疾患(例如呼吸道合胞病毒(rsv)、副流感病毒(piv)、鼻病毒(rv)及腺病毒)相关的气道高反应性、格巴二氏病、格雷夫斯病、艾迪生病、雷诺氏现象、自体免疫性肝炎、gvhd等。timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物也应用于以下情况，其中相对水平降低的timp-3(即，内源性timp-3与金属蛋白酶的比率降低，其可为timp-3量降低或金属蛋白酶量增加的结果)与在心肌缺血、再灌注损伤及在进展至慢性心力衰竭过程中与病理学作用相关联。

基于timp-3抑制结缔组织降解的能力，timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物应用于以下情况，其中在预防或阻滞肿瘤发展和预防寄生虫侵袭中抑制血管生成为有用的。例如，在肿瘤侵袭和转移领域中，一些特定肿瘤的转移潜力与胶原酶合成和分泌能力增加相关，且与不能合成和分泌显著量的金属蛋白酶抑制剂相关。本发明公开的timp-3蛋白在去除原发性肿瘤过程中、在化学疗法和放射疗法过程中、在收集受污染骨髓过程中及在癌性腹水分流过程中在抑制肿瘤细胞扩散中也具有治疗应用。在诊断上，肿瘤样本中timp-3产生的不存在与其转移潜力间的相关性可用作诊断指示，以及可能预防疗法的指示。

mmp还对大脑中的基底层和紧密连接蛋白起作用，作为打开血脑屏障(bbb)途径的一部分，从而促进细胞和炎症的可溶性介质进入大脑。因此，本发明组合物和方法可用于治疗特征在于bbb的过度或不当透化的神经系统病症。另外，神经元周围基质蛋白的降解可导致接触损失和细胞死亡；因此，所公开的timp-3组合物可通过保存神经细胞周围的基底膜而保护神经细胞免于损坏。本发明的timp-3组合物可用于治疗或改善对损伤例如脑缺血或创伤性脑损伤的神经炎性反应。本文公开的组合物将也可用于治疗其中炎症为潜在病因的神经变性疾病，例如多发性硬化症，以及治疗各种形式的神经病和/或肌病、脊髓损伤及肌萎缩性侧索硬化症(als)。因此，本发明组合物的使用可涉及与bdnf、nt-3、ngf、cntf、ndf、scf或其它神经细胞生长或增殖调节因子共施用。另外，本发明组合物和方法可应用于美容目的，因为局部抑制结缔组织分解可改变组织外观。

timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物也可用于体外程序，或体内施用以增加内源性timp-3活性和/或增强timp-3诱导的生物活性。本发明的timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物可在其中内源性timp-3下调或存在水平低的情况下体内使用。因此可治疗由timp-3可抑制性蛋白酶引起或加剧(直接或间接)的病症，所述病症的实例提供在本文中。在一个实施方案中，本发明提供治疗方法，其包括以可有效增加timp-3诱导的生物活性的量向有需要的哺乳动物体内施用timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物或编码timp3多肽、变体、突变蛋白或衍生物的核酸(例如，存在于表达载体中，诸如病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒及腺相关病毒载体)。在另一个实施方案中，本发明提供治疗方法，其包括以可有效升高timp-3的内源性水平的量向有需要的哺乳动物体内施用timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物。

例如，本发明提供治疗病症、诸如以上描述的任一种病症的方法，其包括向有需要的受试者施用可有效治疗该病症的量的timp-3变体、突变蛋白或衍生物。本发明还提供本文所述的timp-3变体、突变蛋白或衍生物在治疗病症、诸如以上描述的任一种病症的用途，以及timp-3变体、突变蛋白或衍生物在制备用于治疗病症的医药中的用途。应理解“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指与病症相关的症状严重程度和/或发作的任何减少。与其相关的病症或症状的任何程度的预防或改善对受试者诸如人类患者有益。

本发明包括抑制任选地与心肌梗塞(例如急性心肌梗塞)相关联的心脏胞外基质(ecm)降解和/或不利重塑的方法。该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的timp-3变体、突变蛋白或衍生物，从而抑制ecm降解和/或不利重塑。在本发明的背景下不要求完全抑制；考虑了ecm降解和/或不利心脏重塑的任何程度的减少。梗塞后数小时内，ecm体内平衡被破坏，引起ecm不稳定性和不利心脏重塑。不利心脏重塑导致心脏结构和功能改变，诸如心室壁变薄、左心室舒张(lvedv增加)、收缩和舒张功能障碍(射血分数(ef)％下降)、梗死扩展及最终心力衰竭。维持ecm体内平衡(完全或部分)减少组织破坏的严重性并且改善心脏功能。因此，在一方面，在已确定受试者处于心肌梗塞(或本文描述的任何病症)风险后尽可能快地或在检测到心肌梗塞后尽可能快地进行该方法。例如，在至少一个实施方案中，timp-3变体、突变蛋白或衍生物在心肌梗塞1、2、3、4、5、6、7、8、12或24小时内施用。任选地，心肌梗塞后，timp-3变体、突变蛋白或衍生物的施用导致射血分数提高至少3％、至少5％、至少10％或至少15％(与未施用timp-3变体、突变蛋白或衍生物的受试者的ef相比)，和/或心输出量提高，和/或左心室壁变薄减少，和/或收缩末期容量或舒张末期容量增加或维持。

在另一方面，本发明提供timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物，其具有经提高的体内半衰期。在一个实施方案中，timp-3突变蛋白的半衰期为天然timp-3的半衰期的至少两倍；在另一个实施方案中，半衰期比天然timp-3的半衰期大至少三倍、四倍、五倍、六倍、八倍或十倍。可替代地或另外，timp-3变体、突变蛋白或衍生物的半衰期比天然timp-3(例如seqidno：2或seqidno：2的氨基酸1-144)长至少0.5小时、长至少1小时、长至少1.5小时、长至少2小时、长至少3小时、长至少6小时、长至少8小时、长至少10小时、长至少12小时或长至少24小时。在一个实施方案中，在非人类哺乳动物中测定半衰期；在另一个实施方案中，在人类受试者中测定半衰期。在各种实施方案中，timp-3突变蛋白、变体或衍生物的半衰期为至少两小时、至少三小时、至少四小时、至少五小时或更大，例如多达24小时、多达18小时、多达13小时或多达12小时。另外的实施方案提供体内半衰期为至少一天(例如，在施用人类受试者时)的timp-3突变蛋白或变体。在一个实施方案中，timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物的半衰期为至少三天。在另一个实施方案中，timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物的半衰期为四天或更长或者五天或更长。在另一个实施方案中，timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物的半衰期为八天或更长。可测量全身半衰期(例如在血浆中)，或可测量局部、原位半衰期(例如，在心脏组织或邻近局部施用位点的组织中)。

在另一个实施方案中，timp-3多肽、变体或突变蛋白经衍生或修饰成使得与未衍生或未修饰的timp-3结合蛋白相比，其具有更长半衰期。所衍生的多肽可包含对多肽赋予所需特性的任何分子或物质，该所需特性诸如特定用途中增加的半衰期。所衍生的多肽可包含例如可检测(或标记)部分(例如放射活性分子、比色分子、抗原性分子或酶促分子、可检测珠粒(诸如磁性或电子致密(例如金)珠粒)或结合另一分子的分子(例如生物素或链霉素))的分子，治疗性或诊断性部分(例如，放射活性部分、细胞毒性部分或药学上活性部分)，或者增加多肽用于特定用途(例如施用至受试者诸如人类受试者，或其它体内或体内用途)的适合性的分子。

在一个此类实例中，用特异性结合至关节软骨组织的配体衍生多肽，例如如wo2008063291和/或rothenfluh等人，naturematerials7：248(2008)中所公开。可用于衍生多肽的分子的实例包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(peg)。可使用本领域熟知的技术制备多肽的白蛋白连接且peg化的衍生物。在一个实施方案中，将多肽缀合或以其它方式连接至甲状腺素运载蛋白(ttr)或ttr变体。ttr或ttr变体可用例如选自由以下各项组成的组的化学品化学修饰：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇及聚乙烯醇(美国专利申请no.20030195154)。

组合物

本发明包括药物组合物，其包含有效量的本发明的多肽产物(即，timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物)连同药学上接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂以用于timp-3疗法(即，其中增加timp-3的内源性水平或提高内源性timp-3的活性有用的疾患)。此类组合物包括各种缓冲剂含量(例如tris-hcl、乙酸盐、磷酸盐)、ph及离子强度的稀释剂；添加剂，诸如洗涤剂和增溶剂(例如tween80、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞(thimersol)、卞基醇)及填充物质(例如，乳糖、甘露醇)；共价连接聚合物诸如聚乙二醇至蛋白质(如上文所讨论，参见，例如美国专利4,179,337，其以引用方式并入本文中)；将材料并入聚合型化合物诸如聚乳酸、聚羟乙酸等的颗粒制剂或并入脂质体。此类组合物将影响timp-3结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放率及体内清除率。参见，例如，remington′spharmaceuticalsciences，第18th版(1990，mackpublishingco.，easton，pa18042)第1435-1712页，其以引用方式并入本文中。

一般而言，将通过接受者的年龄、体重及疾病状况或严重程度确定本发明多肽的有效量。参见remingtonspharmaceuticalsciences，同上，第697-773页，其以引用方式并入。典型地，可使用介于约0.001g/体重kg至约1g/体重kg(或1mg-1000mg)之间的剂量，但可使用更多或更少的剂量，如本领域技术人员将认识到。对于局部(即，非全身性)施加，诸如局部或关节内施加，给药可在约0.001g/cm²至约1g/cm²之间。在减少或抑制ecm降解和/或不利心脏组织重塑的背景下，直接注射(或构成单次施用的一系列注射)至心肌中任任选地包括1mg-50mgtimp-3多肽(例如3mg-40mg、5mg-30mg或10mg-25mg)。给药可为每日一次或多次，或频率更低，且如本文所述可结合其它组合物。timp-3变体、突变蛋白或衍生物的施用可视需要每周施加一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天。可替代地，timp-3变体、突变蛋白或衍生物每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次或每四周施用一次(每月一次)。在各种实施方案中，治疗方案包括单次施用timp-3多肽；例如，心肌梗塞后或过程中干预可包括单次直接施用至心脏中，任选地在手术程序过程中。应注意本发明不限于本文所述的剂量。

如相关领域应理解，以适于适应症的方式将包含本发明分子的药物组合物施用至受试者。可通过任何合适技术施用药物组合物，包括但不限于肠胃外、局部(topically)、局部(locally)或通过吸入。如果进行注射，则可例如经由静脉内途径、肌肉内途径、病变内途径、腹膜内途径或皮下途径，通过团注注射或连续输注施用药物组合物。

考虑了局部施用，例如在疾病或损伤部位处，也考虑了经皮递送和自植入物或贴片持续释放。其它可替代物包括滴眼剂；口服制剂，包括丸剂、糖浆、锭剂或口香糖；及局部制剂，诸如洗剂、凝胶剂、喷雾剂及软膏剂。例如，局部施用至关节或肌肉骨骼系统包括关节周施用、关节内施用、囊内施用、软骨内施用、滑膜内施用及腱内施用。施用至呼吸系统包括肺内递送、胸膜腔内递送、肺内递送、气管内递送、窦内递送及支气管内递送，并且可通过例如吸入器或雾化器来促进。本文也考虑了鞘内递送及可用于将组合物引入大脑和/或神经系统内的其它方法，例如硬膜外施用、硬膜内或硬膜周施用，以及神经周围施用、尾侧内施用、大脑内施用、脑池内施用及脊柱内施用。

局部施用的另外的实例包括结合手术或另一医学程序递送至组织。例如，本发明的药物组合物可在进行来治疗或改善心脏症状的手术过程中或在诸如心导管插入术(例如，经皮冠状动脉介入或血管成形术)的程序过程中施用至心脏组织。递送可经由例如冠状动脉内途径、心脏内途径、心肌内途径、心外膜途径和/或经心内膜途径，且可通过血管造影术或心脏的待注射区域的电动机械图，或通过使用其它技术诸如磁共振成像(mri)来引导。组合物也可经由纳入心脏贴片、冠状动脉内导管或者支架或可用于心脏疾患的其它设备的涂层来递送。合适递送设备的实例描述于2014年8月15日提交的美国临时专利申请no.62/037，743中，其以引用方式全部并入本文中。

除滴眼剂之外，也考虑了使用软膏剂、乳膏剂或凝胶剂来将本发明组合物施用至眼睛。直接施用至眼睛内部可通过眼周、结膜、角膜内、结膜下、眼球筋膜下、眼球后、眼内、和/或玻璃体内注射或施用完成。这些和其它技术论述于例如gibaldi′sdrugdeliverysystemsinpharmaceuticalcare(2007，americansocietyofhealthe-sytempharmacists，bethesda，md)中。

多种试剂一起作用以维持胞外基质与组织之间的动态平衡。在治疗其中平衡偏斜的疾患中，一种或多种其它试剂可与本发明多肽结合使用。这些其它试剂可共施用或连续施用或其组合。一般而言，这些其它试剂可选自由以下各项组成的列表：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、基质降解酶的抑制剂、细胞内酶、细胞粘附调节剂及调控胞外基质降解蛋白酶及其抑制剂表达的因子。尽管以下列出具体实例，但本领域技术人员将认识到其它试剂执行等效功能，包括另外的试剂或其它形式的所列试剂(诸如经由重组dna技术合成产生的那些，及类似物和衍生物)。

如果需要对胞外基质降解的增加或更特定的预防，则也可使用其它降解抑制剂。抑制剂可选自由以下各项组成的组：α2巨球蛋白、妊娠区带蛋白、卵白抑制素、α1-蛋白酶抑制剂、α2-抗纤维蛋白溶酶、抑肽酶、蛋白酶连接蛋白-1、纤溶酶原激活剂抑制剂(pai)-1、pai-2、timp-1、timp-2及timp-4。如本领域技术人员将认识到，可使用其它试剂。

细胞内酶也可与本发明多肽结合使用。细胞内酶也可影响胞外基质降解，且包括溶菌酶、糖苷酶及组织蛋白酶。

细胞粘附调节剂也可与本发明多肽组合使用。例如，可能希望在使用本发明多肽抑制胞外基质降解之前、过程中或之后调节细胞与胞外基质的粘附。展现出细胞与胞外基质粘附的细胞包括破骨细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、杀伤t细胞及肥大细胞。细胞粘附调节剂包括含有“rgd”基序的肽，或类似物或模拟拮抗剂或激动剂。

调控胞外基质降解蛋白酶及其抑制剂表达的因子包括细胞因子，诸如il-1及tnf-α、tgf-β、糖皮质激素和类视色素。如果所需作用为使用本发明多肽抑制胞外基质降解，则也可结合此类细胞作用使用影响细胞增殖和/或分化的其它生长因子。例如，在炎症过程中，可能需要维持胞外基质(经由抑制酶促活性)，而仍需要嗜中性粒细胞产生；因此可施用g-csf。其它因子包括促红细胞生成素、白细胞介素家族成员、scf、m-csf、igf-i、igf-ii、egf、fgf家族成员诸如kgf、pdgf及其它因子。可能另外希望干扰素活性，诸如干扰素α、β、γ或共有干扰素的活性。细胞内试剂包括g-蛋白、蛋白激酶c及肌醇磷酸酶。本发明多肽的使用可与炎症疗法中涉及的一种或多种试剂一起提供治疗益处。

也可使用细胞运输剂。例如，炎症涉及胞外基质降解，及细胞移动或运输至损伤部位。防止胞外基质降解可防止此细胞运输。因此，在治疗炎症中可需要使用本发明多肽结合细胞运输调节剂的激动剂或拮抗剂。细胞运输调节剂可选自由以下各项组成的列表：内皮细胞表面受体(诸如e-选择素和整联蛋白)；白细胞表面受体(l-选择素)；趋化因子及化学引诱物。对于炎症中涉及的组合物的评论，参见carlos等人，immunol.rev.114：5-28(1990)，其以引用方式并入本文中。

此外，组合物可包括neu分化因子“ndf”，且治疗方法可包括在施用timp-3之前、同时或之后施用ndf。已发现ndf刺激timp-2的产生，且ndf、timp-1、timp-2和/或timp-3的组合在治疗肿瘤中可提供益处。

本发明的多肽可通过与可检测标记物物质(例如用¹²⁵i放射标记或用荧光团诸如[lifetechnologies，grandislandny]标记)或ir染料[dylight800nhs酯，thermoscientific]缔合而进行“标记”，以提供可用于检测和定量实体组织和流体样品(诸如血液或尿液)中的timp-3的试剂。本发明的核酸产物也可经可检测标记物(诸如放射标签和非同位素标签诸如生物素)标记，且用于杂交过程以鉴定例如相关基因。

如以上所述，本发明的timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物组合物在多种病症中具有广泛应用。因此，本文考虑的另一个实施方案为包括本发明组合物和任选地以上所述的一种或多种另外的组合物的试剂盒，以供治疗涉及胞外基质降解的病症。另一个实施方案为制品，其包含封装材料和该封装材料内的医药剂，其中所述医药剂含有一种或多种本发明多肽、变体、突变蛋白或衍生物，且其中所述封装材料包含指示timp-3的治疗用途的标签。在一些方面，制品包含所需量(例如1-1000mg、1-100mg、1-50mg或本文公开的任何其它量)的timp-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物。在一个实施方案中，医药剂可用于选自由以下各项组成的组的适应症：癌症、炎症、关节炎(包括骨关节炎等)、营养不良性大疱表皮松解症、牙周病、溃疡形成、气肿、骨病症、硬皮病、伤口愈合、红细胞不足、美容组织重建、受精或胚胎植入物调节及神经细胞症。该制品可任选地包括其它组合物或其它组合物的标签描述。

提供以下实施例用于说明本发明具体实施方案或特征的目的且不限制其范围。

实施例

实施例1：

该实施例描述用于测定timp-3中一种或多种突变对哺乳动物表达系统中的表达的作用(如果有)的方法。此实施例描述通用载体和宿主细胞系统，众多载体和宿主细胞系统为本领域已知，在本文中进行描述且适于测定timp-3序列中的特定突变对重组蛋白的表达的作用(如果有)。

一般而言，将timp-3-编码dna在常规条件下连接至表达载体中(即，将timp-3编码dna可操作连接至载体中的其它序列，以便可表达)，且用载体转化或转染合适的哺乳动物细胞。在适当条件下培养所转化或转染细胞，且表达重组蛋白，且例如通过蛋白质印迹或sds＝page定性/半定量或者使用测定诸如elsa(r&dsystems，minneapolismn)或fortebio(pallfortebiocorp，menlopark，ca)更定量地评估量。以此方式，可测定各种突变对哺乳动物细胞表达timp-3蛋白、突变蛋白或变体的能力的作用。

如果进行一种或多种突变以将n-连接的糖基化位点引入timp-3多肽中或增强天然糖基化位点，则可能需要评价糖基化的存在和/或程度。如先前所述转化或转染细胞，且如果n-连接的糖基化未成功并入、经部分并入或完全并入，可使用半定量测量(例如蛋白质印迹)来测定。

实施例2：

此实施例描述用于测定timp-3中的一种或多种突变是否导致肝素不依赖性增加的方法。将细胞转化或转染，且在肝素存在或不存在下培养。可添加不同量肝素，以发展肝素依赖性程度的半定量概念。然后测定在各种条件下表达的timp-3蛋白、突变蛋白或变体的量，且进行比较以确定特定突变是否对timp-3蛋白、突变蛋白或变体自胞外基质的释放是否需要肝素或者所需要肝素的量是否减少具有任何作用。

使用以上描述的方法，测定各种timp-3突变蛋白的肝素依赖性。稳定转染(用嘌呤霉素选择)chok1细胞以产生timp-3或timp-3突变蛋白。当细胞活力达到90％以上时，将细胞接种至产生培养基中，且在肝素(多达500ug/ml)存在或不存在下培养6天。经由sds-page(4-20％tris-甘氨酸；未还原+碘乙酰胺)测定timp-3蛋白的量。代表性数据说明于图1-3中。

在肝素不存在下，未在培养基中检测到包含融合至fc的timp-3片段的融合蛋白的表达。图1，泳道5。随供应至培养基的肝素的量增加，在培养基中检测到的融合蛋白的量相应增加。图1，泳道6-9。

糖基化位点的引入影响timp-3突变蛋白的肝素依赖性。在chok1细胞中在肝素不存在下产生融合至fc的timp-3变体[h78n/q80t/k94n/e96t/d110n/k112t/r138t]和[k45n/v47t/k94n/e96t/d110n/k112t/g173t]。孵育6天后检测timp-3突变蛋白的表达，指示对肝素的依赖性减少。比较图2与图1。表1列出表达估值(mg/ml)(fortebio蛋白a)。

表1

肝素依赖性也受融合配偶体选择的影响。不同于fc融合，天然timp-3片段(aa1-144)与人血清白蛋白(hsa)的融合减少对肝素的依赖性。图3说明n-timp-3-hsa融合物的稳健表达。类似地，timp-3变体[f57n/k45s]与hsa的融合导致蛋白质在肝素不存在下的强表达，而融合至fc(代替hsa)不消除肝素依赖性。

此实施例证明本文所述的timp-3突变蛋白对于在培养基产生而言，展现出对肝素的依赖性减少。

实施例3：

此实施例描述mmp抑制测定，其中通过使用荧光测定法测量mmp活性；其它方法在本领域为已知的。例如，在通过激活的mmp亚型或亚型特异性催化结构域裂解猝灭的mmp亚型5-fam/qxl520荧光共振能量转移(fret)肽底物后，荧光信号增加。fret肽可用于来自例如anaspec(fremont，ca)或r&dsystems(minneapolis，mn)的多种不同mmp。本文所用的timp-3蛋白可为天然timp-3或timp-3突变蛋白、变体或衍生物；待测试的蛋白质被称为测试分子。

对于mmp2活性测定，在37℃下用1mm4-氨基苯基乙酸汞(apma，anaspec，fremont，ca)将人类原-mmp2(anaspec，fremont，ca)激活1小时，之后用mmp2敏感性5-fam/qxl520fret肽在供应商提供的测定缓冲液中针对各种浓度的测试分子在黑384孔optiplate(perkinelmer，waltham，ma)中在37℃下孵育。孵育2小时后，在激发(490nm)和发射(520nm)下在envision多标签酶标仪(perkinelmer，waltham，ma)上测量来自反应板的荧光信号。在graphpadprism5.0(graphpad，sandiego，ca)中将以相对荧光单位(rfu)表示的数据相对于所测试测试分子浓度作图，以评估半最大抑制常数(ic50)。

对于mmp9活性测量，用mmp9敏感性5-fam/qxl520fret肽和各种浓度的测试分子在黑384孔optiplate(perkinelmer，waltham，ma)中在37℃下孵育人类mmp9的催化结构域(anaspec，fremont，ca)。孵育2小时后，在激发(490nm)和发射(520nm)下在envision多标签酶标仪(perkinelmer，waltham，ma)上测量荧光信号。在graphpadprism5.0(graphpad，sandiego，ca)中将以相对荧光单位(rfu)表示的数据相对于所测试测试分子浓度作图，以评估半最大抑制常数(ic50)。

对于mmp13活性，在测定缓冲液(20mmtris、10mmcacl2、10umzncl2、0.01％brij35(calbiochem/emd，sandiego，ca)ph7.5)中滴定测试分子并且添加至黑聚苯乙烯96或384孔测定板(grienerbio-one，germany)中。在测定缓冲液中稀释活性mmp13(calbiochem/emd)，并且添加至测试分子滴定，且在室温下在50微升的最终体积中孵育10分钟。可替代地，在37℃下用apma将原-mmp-13(r&dsystems，minneapolis，mn)激活2小时，且用于测定中。制备产荧光底物诸如mca-plgl-dpa-ar-nh2产荧光mmp底物或mca-kplgl-dpa-ar-nh2产荧光肽底物(r&dsystems)，且添加至mmp-13酶/hutimp-3/测试分子溶液。使用moleculardevices荧光板读取器(或等效物)动力学测量mmp-13活性，例如持续20分钟。

所测试分子的作用可表示为mmp酶活性的所预期最大timp-3抑制的百分比。可替代地，mmp抑制活性的定量评价可能不是必需的；反而可评价单独测试分子是否抑制mmp。本领域的普通技术人员应认识到本文概括的参数可根据常规实验的应用而不同。例如，可使用先前测试的timp-3及其它材料进行预实验，以测定mmp或原-mpp的适当浓度。相似地，也可测定底物的类型及适当浓度。因此，例如可滴定mmp并且与先前测试批次的mmp比较，以最优化测定参数。另外，本领域普通技术人员可利用类似测定来评价各种timp-3突变对timp-3突变蛋白或变体抑制包括tnfα转化酶(tace)的其它mmp的能力的作用(如果有)。

实施例4：

基本上如先前所述，使用标准分子生物学技术，在哺乳动物细胞中制备且表达编码多种timp-3突变蛋白的核酸。评价突变对所编码timp-3突变蛋白的表达的作用。所进行的突变的列表包括k45n；v47t；k50n；v52t；p56n；f57n；g58t；h78n；q80t；k94n；e96t；d110n；k112t；r138t；g173t；及其组合。

该表总结用在哺乳动物细胞中的确表达的众多timp-3突变蛋白获得的表达和mmp抑制结果。与针对野生型timp-3所观察相比，证明表达成倍增加的表达水平增加通过使用蛋白质印迹或sds-page考马斯染色的凝胶定性测定，或者通过测量表达效价测定，如使用抗timp-3抗体捕获timp-3(此类抗体公开可获得，例如自emdmillipore，billerica，ma：cambridge，ma；或r&dsystems，minneapolis，mn)使用fortebio读出所测量。

表2

1：“#eg”＝经工程化的糖基化位点的数量

2：“hi”指示肝素不依赖性，‘是’；‘否’或‘部分’如实施例中所描述

3：“效价”指与野生型相比的相对效价：‘+’：1-10mg/l；‘++’：10-25mg/l；‘+++’：50-100mg/l；‘++++’：＞100mg/l

4：“mmp2”列出与野生型相比mmp2抑制活性的变化(即，倍数降低)

5：“mmp9”列出与野生型相比mmp9抑制活性的变化(即，倍数降低)

6：“tace”列出与野生型相比tace抑制活性的变化(即，倍数降低)

nd＝无数据

进行另外的研究以使用本文所述的方法表征本发明的融合蛋白。timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)抑制mmp2和mmp9(ec50分别为1nm及2.5nm)。融合至hsa、fc及igg的timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)维持抑制活性：hsa融合：mmp2ec50＝1.4nm，mmp9ec50＝5.1nm；fc融合：mmp2ec50＝13.3nm，mmp9ec50＝32.9nm；igg融合：mmp2ec50＝14nm，mmp9ec50＝26nm。为进行比较，n-timp3展现出mmp2ec50＝7.6nm，mmp9ec50＝1.7nm。hsa与n-timp3的融合导致mmp2ec50＝38.7nm，mmp9ec50＝36.5nm；且fc的融合导致mmp2ec50＝6.9nm，mmp9ec50＝1.6nm。

描述另外的突变蛋白，包括下表3所示的那些。在表中，特定突变列于标题；特定标题下的“x”指示该突变存在。标题“#gly”指示经工程化糖基化位点的数量，且标题“名称”指示所考虑的突变的组合。可如本文所述制备且测试这些突变蛋白。

表3

实施例5：

此实施例描述通过荧光激活的细胞分选(facs)分析，评价timp-3蛋白结合至htb-94^tm细胞(可获自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)，manassas，va的软骨细胞系)的能力的分析。htb-94^tm细胞表达高水平的lrp1和ecm蛋白，且可用于监测timp-3突变蛋白与细胞的结合。在htb-94培养基(含有10％胎牛血清[fbs]和2mml谷氨酰胺的高葡萄糖dmem)中在37c下于5％co2中培养htb-94细胞。将细胞以2.5×10⁴个细胞/ml的细胞密度接种在标准组织培养烧瓶中，持续6-12周，之后染色且经由胰蛋白酶消化自烧瓶去除后每3-4天传代。facs染色前大约16小时，将htb-94细胞以100,000个细胞/孔接种在标准组织培养12-孔板的2ml体积htb94培养基中，且在37c下于5％co2中孵育。染色前，细胞80-90％汇合。

大约16小时后，通过抽吸自12孔板去除htb94培养基，且每孔施加1ml4c染色缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[pbs]2％fbs0.15％nan3)。在冰上孵育细胞板1h。抽吸染色缓冲液，且添加0.9ml/孔在染色缓冲液中稀释至80微克/ml的timp-3his-myc标记的蛋白(天然timp-3或timp-3变体)；仅将相同体积的缓冲液添加至阴性对照孔。将细胞板在冰上孵育30min，抽吸且用1ml/孔染色缓冲液洗涤两次。抽吸第二洗涤缓冲液后，并添加0.9ml/孔在染色缓冲液中稀释至20ug/ml的小鼠抗-五hisalexafluor488缀合的抗体(qiagen，valencia，ca)。平行地，平行添加在染色缓冲液中稀释至20微克/ml的不相干migg1alexafluor488缀合的抗体(ebioscience，sandiego，ca)阴性对照染色试剂至用已知结合剂timp3his-myc(例如k45s、f57n，seqidno：23)染色的重复孔。

将细胞板在冰上孵育30min，同时避光保护，抽吸且用1ml/孔染色缓冲液洗涤两次。抽吸第二洗涤缓冲液后，添加1ml/孔细胞解离缓冲液(不含酶，pbs，目录号13151-014；lifetechnologies，grandislandny)。将细胞板在37c下孵育5min，且将细胞转移至4mlfacs管。用1ml/孔25cpbs冲洗孔，且将冲洗液添加至含有细胞解离缓冲液中的细胞的相应facs管中。将管在1000rpm下离心5min，以形成细胞沉淀且抽吸。将细胞再悬浮于300微升含4％多聚甲醛的pbs(pfa)中，且可储存在4c下，避光保护，直至在facs上操作。

timp3染色两天内，例如使用fl1在bectondickinsonfacscalibur上获得8000个固定htb94细胞事件，以用于检测alexafluor488荧光。正向散射(fsc)检测器的电压设置为e00，且侧向散射(ssc)检测器的电压设置为316。组合使用下，这些检测器将细胞反射的光测为‘正向散射’和‘侧向散射’，其允许限定htb-94细胞门，也称为‘设门’，且在管中基于细胞大小和颗粒度自非细胞材料分离。fl1检测器的电压设置为370。例如使用flowjovx.0.6进行分析。

使用以上描述的方法，确定timp-3[k45n、v47t、k94n、e96t、d110n、k112t、g173t](seqidno：10)仅弱结合htb-94^tm细胞，且timp-3[k45s、f57n、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：12)、timp-3[k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：16)、timp-3[p56n、g58t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：22)及timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)不结合htb-94^tm细胞。

也确定timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)不结合lrp1。与胞外基质的组分(如通过与htb-94细胞的结合减少所指示)和lrp-1清除蛋白的结合减少通过减少对肝素的依赖性而简化产生、提高产率且增加分子的体内可获得性，其均解决了先前timp-3多肽所遭受的timp-3产生和治疗的并发症。因此，本文所述的timp-3突变蛋白提供优于先前鉴定的timp-3多肽的独特优势。

实施例6：

此实施例描述本文所述的timp-3突变蛋白的药物代谢动力学特性。

用5％异氟烷麻醉具有颈静脉插管的spraguedarley大鼠(200g-300g，charlesriverlabs，sandiego，ca)，之后通过颈静脉施用timp-3蛋白(3-6mg/kg)。在5分钟至72小时的各所需时间点在edta处理的注射器管中收集血液样品(0.2ml)，且离心用于血清和血细胞分离。通过免疫测定在gyros(gyrolabs，uppsala，sweden)中用timp-3特异性单克隆抗体(10a7，amgen)作为捕获抗体和抗五组氨酸抗体(qiagen，alameda，ca)或抗-fc抗体(amgen)作为检测抗体来分析所收集的血清样品。另外，经由lc-ms/ms法定量timp-3特异性片段。用timp-3特异性10a7捕获抗体孵育血清样品(25μl)，之后在37℃下胰蛋白酶消化过夜。通过自用肽产生的标准曲线外推来定量timp-3特征肽片段(wdqltlsqr和tqylltgr)。

表4

引入n-连接的糖基化位点增加半衰期和vss且减少timp-3突变蛋白的清除率。timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)证明与具有更少n-连接的糖基化位点的timp-3[k45s、f57n]相比，基本上改进的药物代谢动力学特性。与缺少fc部分的timp-3[k45s、f57n]相比，将半衰期延长部分(异fc融合物)融合至timp-3[k45s、f57n]基本上改进药物代谢动力学特性。

也使用类似方法测定以下各物的全身半衰期：timp-3[k45n、v47t、p56n、g58t、k94n、e96t、r138t](seqidno：4)(2.7小时)、timp-3[k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t、g173t](seqidno：17)(2小时)、timp-3[k45n、v47t、k94n、e96t、d110n、k112t、g173t](seqidno：10)(1.4小时)及timp-3[k50n、v52t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：16)(2小时)。timp-3突变蛋白证明与天然timp-3和天然timp-3的n末端结构域(均为0.8小时)相比，全身半衰期增加。

检查timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]及timp-3[k45s、f57n]的曲线下面积(auc；h*μg/ml)。将静脉内团注的3mg/kgtimp-3多肽施用至大鼠。与timp-3[k45s、f57n]的16.0±1.9相比，timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]的auc为62.5±4.0。timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]展现出与timp-3[k45s、f57n]相比，清除率和体内暴露改进。

实施例7：

此实施例描述timp-3多肽在临床可接受动物模型中的代表性体内研究。将timp-3和timp-3突变蛋白施用至猪或大鼠心脏，以测定半衰期和对心脏功能的作用。

驯化成熟yorkshire猪(25-30kg)且用手术前程序根据iacuc方案进行处置。以无菌方式制备包涵右股动脉的区域，且手术暴露主支股动脉。将导管引入器(6f输入引入器鞘，medtronic)定位且稳定在动脉中，且将鞘置有初始肝素团注(4000单位，iv)，之后为每小时另外一次团注(1000单位，iv)。在荧光显微镜引导(geoec9600，ut)下，将冠状血管造影术导管/发射器(5flauncher引导导管，medtronic)置入左冠状动脉口中。将含有注射腔的血管造影术气囊导管(3mm×10mmsprinterotw气囊导管，medtronic)定位在左前降支动脉(lad)的下部。通过气囊膨胀(12atm气囊膨胀压力，everest30一次性膨胀设备，medtronic)阻塞lad，且维持90分钟。当进行成像时，刚好在再灌注之前，通过气囊阻塞导管的腔将ir800染料(dylight800nhs酯，thermoscientific)标记的timp-3(5mg)缓慢输注至缺血性心肌区域中。接着使气囊收缩，且将导管系统脱开且去除。结扎股动脉且闭合切口。通过手术前施用的丁丙诺啡(0.05mg/kg，im)以及手术前及手术后3天放置的芬太尼贴片(25ug/h，72h)促进手术后镇痛。手术后施用另外的利多卡因(1mg/kg，iv)和胺碘酮(200mgpo)持续三天，并且每天施用阿司匹林(81mgpo)直至末期程序。

在结扎诱导的心肌梗塞后，将全长天然timp-3(f-timp3)和n末端timp-3结构域(aa1-144，n-timp3)直接注射至猪心肌中。施用多肽显著改善心脏功能；与盐水注射相比，在梗塞后2周，射血分数改善大于10％。参见图7。

对于成像程序，在指定i/r后时间点(3h、1天、3天、7天及14天)，用异氟烷(5％)麻醉猪，且收集lv。制备整个lv用于分析。使顶部、中部(2个切片)及基部区域的全圆周切片经受整装成像，以计算作为lv面积的函数的timp-3分布。将切片置于冰上，且立即进行成像。对来自各区域的圆周lv切片进行落射成像(xenogenivis，perkinelmer，inc，ma)。根据irdye800光谱(745/800激发/发射)预测成像系统的设置，且经0.5秒曝光窗口收集信号。使数字图像(livingimagesoftware，perkinelmerinc.，ma)经受测面法(imagejsoftware，researchservicesbranch，md)以测定此区域的总lv圆周面积。对于中部lv区域，借由进行重复测量，计算两者的平均值。最终结果表示为ir800-timp-3所占据的面积，并表示为总lv区域面积的百分比。对于timp-3分布的另外定量测量，使来自各区域和各部分的lv切片(70-100mg)经受荧光/光谱法(li-corodysseyclx，li-corbiosciences，ne)。将来自所收集器官(约100mg)的切片和血浆样品(200ul)也放置在96孔黑壁微板中，经受分析。针对本底进行校正之后，接着将来自样品孔板的光谱信号(20min)针对绝对样品重量(mg)或血浆体积(ml)归一化。

当全身施用时，timp-3快速清除；在静脉内施用时，timp-3的半衰期小于1小时。使用与以上所述的那些成像程序相似的成像程序，测定出在结扎诱导的心肌梗塞后，直接注射后全长天然timp-3(f-timp3)和n末端timp-3结构域(aa1-144，n-timp3)在心脏组织中的半衰期分别为约5天和3.4天。相似地，预期冠状动脉内导管递送后timp-3多肽的心脏保留更长，因为timp3对心肌中的胞外基质蛋白具有高结合亲和力。timp-3[k45s、f57n]的心脏组织半衰期在猪心肌梗塞模型中约为3天。参见图5(t1/2＝y＝a*e^(-b*x))。timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)的心脏组织半衰期约为5.43天(即，与静脉内施用相比，提高大于50倍)。参见图6。

使用与以上针对猪所述的那些方法相似的方法，在大鼠心脏中建立心肌梗塞，且施用timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](seqidno：26)以观察对心脏功能的影响。经由心肌注射对大鼠施用媒介物(pbs，n＝9)或4mgtimp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t](n＝8)。在注射后第3天及第7天，经由超声心动描记术测量射血分数(ef％)。施用timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]的动物证明与对照相比这两天的ef均显著增强(与对照相比，增加多于20％)。参见图8a。收缩末期容量(esv)和舒张末期容量(edv)为心脏重塑的指示；与基线相比edv和esv的进行性增加标志急性心肌梗塞后左心室(lv)重塑。如图8b和8c所说明，与对照相比，timp-3[h78n、q80t、k94n、e96t、d110n、k112t、r138t]减少esv和edv。

以上描述的该结果证明与天然timp-3相比，本发明的代表性timp-3突变蛋白具有增加的半衰期，在急性心肌梗塞后减少不利心脏重塑且改善心脏功能。