脂质化的基于酰胺的胰岛素前药的制作方法

相关申请的交叉引用本申请根据35usc§119(e)要求2014年9月24日提交的美国临时专利系列号62/054,670的优先权，所述申请的整个公开内容通过引用并入本文。通过引用电子形式提交的材料的并入通过引用以其整体并入计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，所述序列表与本文一并提交并如下标识：于2015年9月22日创建的名称为“242706_pct_sequence_listing.txt”的一个22kbacii(文本)文件。
背景技术：
：胰岛素是一种由二链异源二聚体组成的肽激素，所述异源二聚体以生物合成的方式由低效力单链胰岛素原前体通过酶加工获得。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“a链”(seqidno:1)和“b链”(seqidno:2))组成，共有51个氨基酸。b链的c末端区和a链的两个末端区以三维结构缔合装配成以高亲和力结合胰岛素受体的部位。对于几乎所有形式的糖尿病，胰岛素都显示出无以伦比的降低葡萄糖的能力。遗憾的是，其药理学并不是葡萄糖敏感性的，且因此它能够产生可导致危及生命的低血糖症的过度作用。不一致的药理学是胰岛素疗法的标志，使得要使血糖正常化而又不发生低血糖症极为困难。此外，天然胰岛素的作用持续时间短，而且天然胰岛素需要经过修饰使之适用于基础葡萄糖的控制。已确立的延迟胰岛素发作的方法包括降低溶解度和白蛋白结合。如图3中所示，目前用于推迟商业胰岛素类似物诸如lantus&degludec中胰岛素作用发作的策略依赖于在皮下组织中产生“不溶性”胰岛素的储库，其随时间缓慢释放至血浆中(k1)。然后血浆中存在的可溶形式以相对较快的速率进入胰岛素靶组织(k2)。然而，由于与皮下组织向血浆的移动相关的变异性，当k1慢于k2时，靶组织的胰岛素摄取将反映这种变异性。商业胰岛素类似物lantus&degludec以比k2慢得多的k1发挥功能。因此，具有比k2快得多的k1的胰岛素类似物是理想的，因为与k1相关的变异性对靶组织的胰岛素摄取影响最小。一种市售的胰岛素衍生物是[lysb29-十四烷酰基，des(b30)]胰岛素，其中lysb29已经用c14脂肪酸酰化(mayer等人，peptidescience，88，5，687-713)。脂肪酸链的存在促进肽与血清白蛋白的结合，导致血浆半衰期延长。然而，这种衍生物具有体内效力降低的缺点。此外，此胰岛素衍生物的生物学作用在一名患者与另一患者之间也表现出差异。这种差异部分由于溶解和从皮下组织储库向血浆循环的移动的差异以及k1比k2更慢的事实。前药化学法为在从给药部位清除并在血浆中以高度限定的浓度平衡后精确控制胰岛素作用的开始和持续时间提供了机会。与现有的长效胰岛素类似物和制剂相比，这种方法的主要优点是胰岛素贮库不是其中进行注射的皮下脂肪组织，而是血液隔室(即，k1比k2快得多)。这就排除了现有技术延迟发作胰岛素衍生物所遇到的吸收和溶解度的变异性。这还使通过皮下注射以外的途径施用该肽激素成为可能。胰岛素与其受体结合将引起生物刺激，但也将通过胰岛素肽的酶促降解而引发胰岛素诱导的药理学的后续失活。使用胰岛素前药衍生物的额外优势是这种方法还基于抑制前药被相应受体识别的策略来延长胰岛素的生物半衰期。尽管存在与前药衍生物相关的这些优势，但是制备这样的前药的复杂特性至今一直妨碍有效胰岛素前药衍生物的制备。为了开发成功的前药激素，需要活性部位结构地址(structuraladdress)，其可形成用于前药结构元件可逆附着的基础。该结构地址需提供两个关键特征；(1)选择性化学修饰的潜力，和(2)在脱去前药结构元件时以天然形式提供高度活性的能力。将本文公开的胰岛素前药以化学法转化为可被受体识别的结构，其中该化学转化的速度将决定体内生物作用的开始和持续时间。本申请公开的前药化学法依赖于分子内的化学反应，该反应不依赖其它化学添加剂或者酶或酶抑制剂。理想的前药在生理条件(例如ph7.2和37℃)下应可溶解于水，并且以粉末形式长期保存时应保持稳定。与母体药物相比，前药还应是免疫沉默的，并显示出低活性。通常，前药将显示出不超过母体药物活性的10%，在一个实施方案中，与母体药物相比，前药显示出小于10%、小于5%、约1%或小于1%的活性。此外，当注射到体内时，前药应在规定时段内定量转化为活性药物。申请人首次公开了符合这些目标中的每一项的胰岛素前药类似物。概述基于肽的药物是十分有效的药物，其作用持续时间相对较短并且治疗指数可变。本发明涉及胰岛素前药，其中将前药衍生物设计成延迟发作，而且药物半衰期延长。发作延迟是有利的，因为允许前药在其活化前系统分布。因此，施用前药排除了在给药时由峰值活性引起的并发症，并提高母体药物的治疗指数。根据一个实施方案，通过将二肽通过酰胺键与胰岛素肽共价连接来制备胰岛素的前药衍生物，其中二肽包含共价连接的部分(例如非天然烷基或酰基)，其具有足够大小以不可逆结合哺乳动物血浆蛋白诸如哺乳动物血清白蛋白。随后在生理条件下且缺乏酶活性时，通过导致二酮哌嗪或二酮吗啉形成的分子内反应除去二肽，恢复胰岛素多肽的完整活性。在一个实施方案中，选择二肽的取代基以产生在血清中和在生理条件下约2至约168小时或约12至约168小时的切割半衰期。在一个实施方案中，选择二肽的取代基以产生在血清中和在生理条件下约0.5天至约10天或约2至约10天的切割半衰期。根据一个实施方案，治疗糖尿病或治疗/预防高血压的方法包括施用本文公开的胰岛素前药。在一个实施方案中，基于在血清中在生理条件下前药的半衰期，每日以部分剂量施用胰岛素前药。例如，如果前药具有n的半衰期，其中n等于或大于一天，则每日剂量是胰岛素肽的相应非前药形式的最佳剂量的1/n。因此，半衰期为10天的胰岛素前药将每日以胰岛素肽的相应非前药形式的最佳剂量的十分之一施用。根据一个实施方案，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽；a为包含(c1-c8烷基)nh2侧链的氨基酸或羟酸，其中a的侧链与不可逆结合哺乳动物血浆蛋白(包括例如哺乳动物血清白蛋白)的部分共价连接。在一个实施方案中，a的侧链与酰基或烷基共价连接，所述酰基或烷基包括脂肪酸、胆酸、胆汁盐或胆汁酸的类固醇部分，其长度优选为至少16、18或20个碳。在一个实施方案中，a的侧链与c16-c30酰基或c16-c30烷基共价连接；b为n-烷基化氨基酸；且c为酰胺键、x70或x70x71，其中x70和x71为氨基酸，其独立地选自甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，其中a-b-c通过酰胺键经由q的脂族氨基与q连接。任选地，a的侧链与酰基或烷基之间的连接通过间隔物，其中间隔物包含一个或两个带电氨基酸。根据一个实施方案，结构a-b-c通过酰胺键在脂族氨基处与q连接，所述脂族氨基选自a链或b链的n端氨基酸上的α氨基或q的b3、b28或b29氨基酸的侧链上的脂族氨基。根据一个实施方案，b为用c1-c18烷基、c3-c18烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)或(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)n-烷基化的氨基酸。在另一个实施方案中，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q是胰岛素肽，且a-b-c包含以下结构：其中r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2为h或c1-c6烷基；r3选自c2-c4烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)和(c1-c4烷基)(c6-c10杂芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4和r8独立地选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r5为nhr6或oh;r6为h或c1-c8烷基；r7选自h、oh、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c0-c4烷基)nh2,和(c0-c4烷基)oh；r9选自c18-c30酰基；r10、r11、r12和r13独立地选自h、ch2、choh、ch2sh、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，其中a-b-c通过酰胺键经由q的脂族氨基与q连接。在一个实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r3选自c2-c4烷基；r2、r4、r11和r13各自为h；r5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2和(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2；且s1是包含一个或两个带电氨基酸的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，且a-b-c通过酰胺键经由胰岛素b链的n端胺与q连接。在一个实施方案中，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q是胰岛素肽，且a-b-c包含以下结构：其中r1为c18-c30烷基、(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r3选自c2-c4烷基，r4、r11和r13各自为hr5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；且r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，其中a-b-c通过酰胺键经由q的脂族氨基与q连接。在一个实施方案中，r1为(ch2)4-s1-nhr9或(ch2)4nhr9；r3为c3-c4烷基；r5为nh2；且r9为c18-c28酰基，且a-b-c通过酰胺键经由胰岛素b链的n端胺与q连接。本文公开的前药的胰岛素肽可以包含本领域技术人员已知对胰岛素受体具有激动剂活性的任何胰岛素。根据一个实施方案，胰岛素肽包含a链序列giveqccx8sicslyqlenycx21r44(seqidno:3)和b链序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)，其中b链通过二硫键与a链连接；x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；x25选自组氨酸和苏氨酸；x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；x33选自天冬氨酸和谷氨酸；x34选自丙氨酸和苏氨酸；x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；x45为酪氨酸或苯丙氨酸；r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n端胺；且r44为cooh或conh2。在一个实施方案中，本文公开的前药的胰岛素肽包含a链序列giveqccx8sicslyqlenycx21(seqidno:3)和b链序列r22-hlcgshlvealylvcgergfx45(seqidno:15)，其中b链通过二硫键与所述a链连接；r22为键或选自fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、vnq、nq和q的1-4个氨基酸序列；x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸；且x45为组氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。在一个实施方案中，a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn-r44(seqidno:1)，且所述b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)，其中r44为cooh或conh2。在一个实施方案中，前药元件的氨基酸a和/或b为呈d立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性实施方案中，a是呈d立体异构体构型的氨基酸，且b是呈l立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性实施方案中，a是呈l立体异构体构型的氨基酸，且b是呈d立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性实施方案中，a是呈d立体异构体构型的氨基酸，且b是呈d立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，b是n-烷基化氨基酸，但不是置换的脯氨酸或脯氨酸类似物。根据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中胰岛素肽的a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn(seqidno:1)，且b链包含选自以下的序列：z-fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)、z-fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)、z-fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)和z-fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)，其中z是包含以下一般结构的肽：其中z通过酰胺键经由b链的n端氨基酸或b链的b28或b29的侧链上的脂族氨基与q连接；r1选自h、c18-c30烷基、(c1-c4烷基)nhr9、(c1-c4烷基)o-s1-r9、(c1-c4烷基)s-s1-r9、(c1-c4烷基)conh-s1-r9、(c1-c4烷基)coo-s1-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9和(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)-s1-r9；r2和r8独立地选自h、c1-c8烷基、c2-c8烯基、(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conhh、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nhh、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；r3为c1-c18烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4为h、c1-c18烷基、（c1-c6烷基)nh-r9或（c1-c6烷基)nh-s1-r9，r5为oh、nhr6或nhr9；r6为h、c1-c8烷基；r7选自h、oh和or9；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基;r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自h、ch2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，条件是当r4为h或c1-c18烷基时，r1不是h。在一个实施方案中，r1为(ch2)4-s1-nhr9或(ch2)4nhr9；r3为c3-c4烷基；r5为nh2；且r9为c18-c28酰基，且z通过酰胺键与胰岛素的b链的n端胺连接。根据一个实施方案，提供单链胰岛素前药类似物。在该实施方案中，人胰岛素b链或其功能类似物的羧基端与人胰岛素a链或其功能类似物的n端共价连接，其中具有以下通用结构的肽前药元件在胰岛素肽的a或b链的n端或者在与b链的b3、b28或b29位对应的氨基酸侧链上通过酰胺键共价结合：在一个实施方案中，b链通过4-12或4-8个氨基酸的肽接头与a链连接。在另一个实施方案中，将本发明的胰岛素前药进一步修饰以防止在储存期间和施用于患者之前肽前药元件的切割。在一个实施方案中，肽前药元件的n端胺与部分连接，所述部分保持与n端结合，直到施用于患者。在一个实施方案中，式a-b-c-q的胰岛素前药还包含通过a的n端胺与a连接的血清酶可切割部分。在一个实施方案中，酶可切割部分是由二肽基肽酶iv(dpp-iv)切割的肽，包括例如arg-pro、lys-pro或glu-pro的二肽。在另一个实施方案中，通过将亲水部分与肽共价连接来提高胰岛素前药类似物的溶解度。在一个实施方案中，亲水部分与b链的n端α胺、与前药肽的氨基酸的侧链或与a链的a9、a14和a15位或b链的b1、b2、b3、b10、b22、b28或b29位的氨基酸(包括例如seqidno:9的28氨基酸或seqidno:2的29位氨基酸)的侧链连接。在一个实施方案中，亲水部分为分子量范围为约500至约40,000道尔顿的聚乙二醇(peg)链。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量选自约500至约5,000道尔顿的范围。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000至约20,000道尔顿。酰化或烷基化可增加胰岛素肽在循环中的半衰期。在前药活化时，酰化或烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的发作和/或延长对胰岛素受体的作用持续时间。胰岛素类似物可以在与亲水部分所连接氨基酸位置相同的氨基酸位置上酰化或烷基化，或者在不同的氨基酸位置上酰化或烷基化。根据一个实施方案，提供包含本文公开的任何新的胰岛素前药类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述胰岛素前药类似物的纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这样的组合物可含有本文公开的a19胰岛素类似物，其浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经灭菌并任选装入各种包装容器中保存的含水溶液剂。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉末。药物组合物可进一步作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将组合物施用于患者的一次性装置。容器或试剂盒可贴上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。根据一个实施方案，提供调节胰岛素依赖性患者的血糖水平的改善方法。该方法包括以对控制糖尿病治疗有效的量施用本发明的胰岛素前药类似物的步骤。在一个实施方案中，将胰岛素前药类似物用以高亲和力结合白蛋白的足够大小的酰基酰化，和/或用分子量范围为约5,000至约40,000道尔顿的peg链聚乙二醇化。附图简述图1a和1b表示了从胰岛素前药类似物miu-30a：(b1(y16,l17,y25)29a:a1(dlys(ac),sar-af19)(其中酰化二肽dlys(ac),sar经由酰胺键与胰岛素类似物的a194-氨基phe连接))的比较性胰岛素耐量测试得到的结果。据估计，所述前药的半衰期为大约20小时。图1a所示的数据揭示，母体化合物具有低效力，但是在20%血浆中温育48小时(产生“miu-30c”)以后，效力增加。●=媒介物对照，▼=miu30a，90nm/kg；▽=miu30c，90nm/kg；◆=miu30a，270nm/kg；◇=miu30c，270nm/kg。类似地，图1b表示了在c57/blk小鼠(c57/blkmice)中8小时以后的血糖auc，表明化合物的效力随施用之前在体外温育的时间增加而增加。图2是描绘酰化的前药miu42：(b1(y16,l17,y25)29a:a1(dlys(re-c14),sar-af19)(其中二肽前药元件的氨基酸被酰化，连接在谷氨酸接头的γ位“re”处))相对于在30%acn/pbs(ph7.4，37℃)中离体温育的时间的体外活性的图。数据表明，随着离体温育时间增加，活性恢复至母体化合物miu42。图3表明了超基础/基础/大剂量胰岛素治疗。目前用于推迟商业胰岛素类似物中胰岛素作用发作的策略依赖于在皮下组织中产生“不溶性”胰岛素的储库，其随时间缓慢释放至血浆中(k1)。然后血浆中存在的可溶形式以相对较快的速率进入胰岛素靶组织(k2)。用可溶性长效胰岛素(qw)的有目的的分数每日剂量(qd)使单次施用固有的变异性最小化。图4显示了通过使血清白蛋白不可逆结合与b链的n端胺连接的脂质化前药元件而使胰岛素类似物失活的示意图。在生理条件下和在不存在酶活性下二肽元件的随后切割导致通过释放二肽前药元件而活化胰岛素。图5提供了用于制备包含与b链的n端胺连接的脂质化前药元件的双链胰岛素类似物的合成方案。图6提供了与b链的n端胺连接的脂质化前药元件的切割半衰期，其中第一氨基酸的n-烷基化被修饰并且与第二氨基酸连接的烷基链的长度变化。图7提供了显示胰岛素前药类似物(aib-(n-me)lys(c22)-cys-(s-丙基)b1-胰岛素)的降解的hlpc迹线。胰岛素前药的前药元件表现出约8小时的半衰期。图8提供了显示胰岛素前药类似物((α-me)lys(c18)-sar,b1-胰岛素)的降解的hlpc迹线。胰岛素前药的前药元件表现出约6小时的半衰期。图9提供了显示胰岛素前药类似物(lys(c18)-n(sbu)gly,glyb1-胰岛素)的降解的hlpc迹线。胰岛素前药的前药元件表现出约16小时的半衰期。图10表明了二肽前药元件的第二氨基酸处的n-烷基化对二肽的切割速率的影响。图11提供了用于前药元件的结构的另外的实施方案。图12提供了通过2-溴羧酸将n-烷基引入肽的合成方案。图13提供了通过mitsunobu反应将n-烷基引入肽和α碳取代的合成方案。图14a-14d提供了另外的合成方案。图14a提供了通过ugi反应将n-烷基引入肽和α碳取代的液相合成。图14b提供了具有n-烷基化氨基酸的脂质化三肽的替代固相合成。图14c提供了使用a1,b29-二-tboc-胰岛素合成脂质化胰岛素前药的合成方案。图14d提供了使用a1,b29-二-(fmoc)-胰岛素合成脂质化胰岛素前药的合成方案。图15a-15c提供了胰岛素耐量实验的数据，其中向糖尿病模型小鼠施用天然胰岛素或基于天然胰岛素的前药。图15a提供了实验程序的概述，且图15b提供了显示酰化前体胰岛素类似物在降低血糖水平方面的延长作用时间的结果。图15c表明了血糖水平与血糖水平相关。图16a-16c提供了胰岛素耐量实验的数据，其中向糖尿病模型小鼠施用天然胰岛素或基于天然胰岛素的前药。图16a提供了实验程序的概述，且图16b提供了显示酰化前体胰岛素类似物在降低血糖水平方面的延长作用时间的结果。图16c提供了施用天然胰岛素或胰岛素前药的糖尿病禁食小鼠的数据，其显示了施用后血糖的变化。图17a和17b提供了胰岛素耐量实验的数据，其中向正常小鼠施用天然胰岛素或基于天然胰岛素的前药。图17a提供了实验程序的概述，且图17b提供了显示酰化前体胰岛素类似物在降低血糖水平方面的延长作用时间的结果。详述定义在描述和要求保护本发明时，将根据下文给出的定义使用下列术语。将如本文所用的术语“前药”定义为在显示其药理作用之前经历化学修饰的任何化合物。“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内施加生物作用的多肽。如本文所用的术语“氨基酸”包括既含氨基官能团又含羧基官能团的任何分子，其中氨基和羧酸基连接至同一碳(α碳)上。α碳任选可具有一个或两个其它的有机取代基。未说明其立体化学的情况下对氨基酸的命名意在包括l型或d型氨基酸或外消旋混合物。然而，在氨基酸通过其三个字母代码命名并包括上标数字的情况下，通过在三个字母代码和上标数字之前加上小写字母d来指定d型氨基酸(例如dlys-1)，其中缺乏小写字母d的命名(例如lys-1)意在说明天然l型氨基酸。在该命名法中，加上上标数字表明氨基酸在igf肽序列中的位置，其中位于igf序列内的氨基酸用从n端起连续编号的正的上标数字标示。在n端或通过侧链与igf肽连接的其它氨基酸从0开始编号，并随着其更远离igf序列，以负整数值递增。例如，与igf的n端连接的二肽前药内的氨基酸位置标为aa-1-aa0-igf，其中aa0表示二肽的羧基端氨基酸，并且aa-1表示二肽的氨基端氨基酸。如本文所用的术语“羟酸”是指已经修饰以用羟基代替α碳氨基的氨基酸。如本文所用的术语“非编码氨基酸”包括不是任何下列20种氨基酸的l-异构体的任何氨基酸：ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp、tyr。“二肽”是α氨基酸或α羟酸通过肽键与另一个氨基酸连接形成的化合物。本文所定义的肽前药元件是包含n端自切割二肽的肽，其中二肽在生理条件下自发地经历酰胺键的化学切割以形成二酮哌嗪或二酮吗啉。肽前药元件可以由二肽组成，或者可以包括通过酰胺键与自切割二肽的羧基端的连接的另外氨基酸。如本文所用的不存在任何其它名称的术语“化学切割”包括导致共价化学键断裂的非酶促反应。血清酶可切割部分是可以在不存在酶促活性下与肽共价连接以形成稳定结构的化合物。暴露于哺乳动物血清中发现的酶后，从肽切割整个部分。例如，血清酶可切割部分可以是通过酰胺键与多肽连接的血清酶可切割肽，其中酶可切割肽易于被二肽基肽酶iv(dpp-iv)切割。“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内施加生物作用的多肽。如本文所用对肽的一般提及意在包括具有修饰的氨基端和羧基端的肽。例如，标明标准氨基酸的氨基酸序列意在包括在n端和c端处的标准氨基酸以及在n端处相应的羟酸和/或经修饰包含替换末端羧酸的酰胺基的相应的c端氨基酸。如本文所用的“酰化的”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的酰基的氨基酸，与其制备方法无关。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的，该方法包括在包含入肽前使氨基酸酰化或在肽合成之后接着对肽进行化学酰化。在一个实施方案中，酰基导致肽具有一种或多种以下性质：(i)循环中的半衰期延长、(ii)发作延迟、(iii)作用持续时间延长、(iv)对蛋白酶(诸如dpp-iv)的抗性改善，和(v)对胰岛素肽受体的效力增加。如本文所用的“烷基化的”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的烷基的氨基酸，与其制备方法无关。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的，该方法包括在包含入肽前使氨基酸烷基化或肽合成之后接着对肽进行化学烷基化。在不固守任何特定理论的情况下，据信肽的烷基化将获得与肽的酰化相似(如果不是相同的话)的作用，例如循环中的半衰期延长、发作延迟、作用持续时间延长、对蛋白酶(诸如dpp-iv)的抗性改善和对胰岛素肽受体效力增加。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药用载体，诸如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(诸如水包油或油包水乳剂)和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府管理机构批准或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何试剂。如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的生物活性的化合物的盐，并且其在生物学或其它方面不是不合乎需要的。本文公开的许多化合物能够通过氨基和/或羧基或其类似基团的存在而形成酸式盐和/或碱式盐。可由无机和有机碱制备药学上可接受的碱加成盐。仅作为实例，由无机碱得到的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。由有机碱得到的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。可由无机和有机酸制备药学上可接受的酸加成盐。由无机酸得到的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。由有机酸得到的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。如本文所用的术语“治疗”包括预防特定的病症或病况，或减轻特定病症或病况的相关症状和/或防止或消除所述症状。例如，如本文所用的术语“治疗糖尿病”总的来说是指保持葡萄糖血液水平接近正常水平，并可根据既定情况，包括提高或降低血糖水平。如本文所用的“有效的”量或“治疗有效量”的前药是指无毒但足量的前药以提供所需作用。例如一种所需要的作用将会是预防或治疗高血糖症。“有效”量在受试者之间不同，这取决于个体的年龄和一般状况、给药方式等。因此，并非总是能指定确切的“有效量”。然而，在任何个体情况下，本领域普通技术人员采用常规实验可确定合适的“有效”量。术语“胃肠外”意指不通过消化道但通过某些其它途径，诸如鼻内、吸入、皮下、肌内、脊柱内或静脉内。如本文所用的术语“天然胰岛素肽”意在表示包含a链seqidno:1和b链seqidno:2的51个氨基酸异源二聚体以及包含seqidno:1和2的单链胰岛素类似物。本文使用的缺乏更多描述性语言的术语“胰岛素肽”意在包括包含a链seqidno:1和b链seqidno:2的51个氨基酸异源二聚体及其单链胰岛素类似物(包括例如已公布的国际申请wo96/34882和美国专利号6,630,348中公开的单链胰岛素类似物，其公开内容通过引用结合到本文中)，以及包括包含天然a链和/或b链的修饰衍生物的异源二聚体和单链类似物，所述修饰衍生物包括a19、b16或b25位上的氨基酸被修饰成4-氨基苯丙氨酸，或者一个或多个选自以下位置的氨基酸置换：a5、a8、a9、a10、a12、a14、a15、a17、a18、a21、b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b17、b20、b21、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30，或者b1-4和b26-30位置中的任何或全部的缺失。如本文所用的“胰岛素前药类似物”是指在干扰胰岛素的活性或基于igf1的胰岛素类似物的活性(例如与胰岛素和igf-1受体相互作用的能力)的位置上，已经通过经由酰胺键共价连接二肽来修饰的胰岛素肽(或实施例9中公开的基于igf1的胰岛素类似物)。如本文所用的术语“单链胰岛素类似物”包括一组结构上相关的蛋白，其中胰岛素a和b链共价连接为线性主链。如本文所用的氨基酸“修饰”是指氨基酸的置换、添加或缺失，或者通过在/从氨基酸上添加和/或除去化学基团而对氨基酸的衍生，包括用任何通常存在于人蛋白中的20种氨基酸以及非典型的或非天然存在的氨基酸置换或添加。非典型氨基酸的商业来源包括sigma-aldrich(milwaukee,wi),chempepinc.(miami,fl)和genzymepharmaceuticals(cambridge,ma)。非典型氨基酸可购自商业供应商、从头合成、或者由天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生化。如本文所用的氨基酸“置换”是指一种氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。在本申请全文中，所有通过字母和数字提及的具体氨基酸位置(例如a5位)是指在各自天然人胰岛素a链(seqidno:1)或b链(seqidno:2)中a链(例如a5位)或b链(例如b5位)的该位置上的氨基酸，或其任何类似物中相应的氨基酸位置。例如，本文缺乏任何更多详尽描述提及的“b28位”将意指其中已经缺失了seqidno:2的第一个氨基酸的胰岛素类似物b链相应的b27位。如本文所用的术语“保守氨基酸置换”在此定义为在下列5组之一内的互换：i.小的脂族非极性或略有极性的残基：ala、ser、thr、pro、gly；ii.极性带负电荷的残基及其酰胺：asp、asn、glu、gln；iii.极性带正电荷的残基：his、arg、lys、鸟氨酸(orn)；iv.大的脂族非极性残基：met、leu、ile、val、cys、正亮氨酸(nle)、高半胱氨酸；v.大的芳族残基：phe、tyr、trp、乙酰基苯丙氨酸。如本文所用的通用术语“聚乙二醇链”或“peg链”是指呈支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，用通式h(och2ch2)noh表示，其中n至少为9。缺乏任何更多描述的该术语意在包括平均总分子量范围为500-80,000道尔顿的乙二醇聚合物。“聚乙二醇链”或“peg链”与数字后缀联用以表示其大致平均分子量。例如，peg-5,000是指总分子量平均为约5,000道尔顿的聚乙二醇链。如本文所用的术语“聚乙二醇化的”和类似术语是指已通过将聚乙二醇链与化合物连接对其天然状态进行修饰的化合物。“聚乙二醇化多肽”是具有与多肽共价结合的peg链的多肽。如本文所用的“接头”是使两个独立的实体彼此结合的键、分子或分子的基团。接头可为两个实体提供最佳间隔，或者还可提供使两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。如本文所用的“胰岛素二聚体”是包含2个胰岛素肽通过接头彼此共价结合的复合物。在缺乏任何限定性语言下使用时，术语胰岛素二聚体既包括胰岛素同源二聚体又包括胰岛素异源二聚体。胰岛素同源二聚体包含2个相同的亚基(各自包含a链和b链)，而胰岛素异源二聚体包含2个不同的亚基(各自包含a链和b链)，尽管2个亚基彼此大致相似。如本文所用的术语“c1-cn烷基”(其中n可为1-n)表示具有一个至指定数目的碳原子的支链或直链烷基。通常c1-c6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。如本文所用的术语“c2-cn烯基”表示具有2个至指定数目的碳原子和至少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这样的基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基(-ch2-ch=ch2)、1,3-丁二烯基、(-ch=chch=ch2)、1-丁烯基(-ch=chch2ch3)、己烯基、戊烯基等。术语“c2-cn炔基”表示具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这样的基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。如本文所用的术语“芳基”被定义为具有一个或两个芳环的单环或二环碳环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。通过指明碳存在的数目来表示芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语“(c1-c3烷基)(c6-c10芳基)”是指通过1-3元烷基链与母体部分连接的6-10元芳基。如本文所用的术语“杂芳基”被定义为含有一个或两个芳环并在芳环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或二环环系。通过指明碳存在的数目来表示杂芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语“(c1-cn烷基)(c5-c6杂芳基)”是指通过1-“n”元烷基链与母体部分连接的5或6元杂芳基。术语“c3-cn环烷基”被定义为包含碳和氢原子的非芳族单环或多环，其下标数字表示碳原子存在的数目。例如术语c3-c8环烷基表示环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基化合物。术语“c3-cn杂环基”被定义为含有1-“n-1”个杂原子的环烷基环系，其中杂原子选自氧、硫和氮。例如短语“5元杂环”或“c5杂环”包括但不限于具有一个杂原子的5元杂环(例如噻吩、吡咯、呋喃)；在1、2或1、3位具有两个杂原子的5元杂环(例如噁唑、吡唑、咪唑、噻唑、嘌呤)；具有3个杂原子的5元杂环(例如三唑、噻二唑)。如本文所用的术语“c3-cn元环”被定义为包含共3-“n”个数目的彼此连接形成环的元素的饱和或不饱和烃环结构，其中环元素选自c、o、s和n。该术语意在包括环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。如本文所用的术语“卤素”被定义为由氟、氯、溴和碘组成的群组中的一个或多个成员。如本文所用的术语“带电氨基酸”被定义为包含在生理ph下在水溶液中带负电(即去质子化)或带正电(即质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸和高谷氨酸，而带正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电氨基酸包括通常在人类蛋白中发现的20种氨基酸中的带电氨基酸，以及非典型或非天然存在的氨基酸。如本文所用的术语“酸性氨基酸”被定义为包含第二酸性部分(除了所有氨基酸具有的α-羧基以外)(包括例如羧酸或磺酸基团)的氨基酸。如本文所用的无其它名称的术语“患者”意在包括任何家养的温血脊椎动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)、哺乳动物和人。如本文所用的短语“与血浆蛋白不可逆结合”或“与血清白蛋白不可逆结合”被定义为高亲和力结合，其中在生理条件下基本上不释放结合的血浆蛋白/血清白蛋白。在酰化胰岛素的情况下，足够大足以“不可逆结合”白蛋白的酰基或烷基被定义为这样的酰基或烷基，其抑制潜在的胰岛素肽在向患者施用后在施用后6小时的过程将血糖降低至用不含酰基或烷基的相同的胰岛素肽实现的小于10％的能力。实施方案本发明提供配制成延迟发作和延长胰岛素肽的半衰期，从而改善基础胰岛素肽的治疗指数的胰岛素前药衍生物。本文公开的胰岛素前药化学允许通过非酶促降解机制活化前药。公开的前药化学可以与不可逆结合哺乳动物血浆蛋白的有机部分化学连接，从而在施用后使胰岛素肽失活。在一个实施方案中，有机部分是足够大小以结合血清白蛋白的烷基或酰基。在另一个实施方案中，有机部分是胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。在一个具体实施方案中，胰岛素类似物包含胆固醇酸，其通过烷基化的脱氨基cys间隔物、即烷基化的3-巯基丙酸间隔物与胰岛素类似物的lys残基连接。烷基化的脱氨基cys间隔物可以是例如包含十二乙二醇部分的脱氨基-cys间隔物。这种新型的生物友好型前药化学在生理条件(例如ph为约7，在37℃，在水性环境中)下自发降解，其中前药元件的切割将结合的血浆蛋白(例如白蛋白)与胰岛素肽分离，恢复胰岛素肽的活性。在一个实施方案中，酰基或烷基与本文公开的肽前药元件连接，其中烷基或酰基是直链或支链的，并且在一个实施方案中为c18-c30烃骨架链。例如，酰基或烷基可以是c18、c20、c22、c24、c26、c28或c30烃骨架链中的任一种。在一个实施方案中，公开的前药化学与c16-c20脂肪酸(例如c18脂肪酸或c20脂肪酸)化学连接。前药衍生物的持续时间通过选择肽前药元件序列来确定，从而允许前药制剂的灵活性。在一个实施方案中，提供在生理条件下非酶促活化半衰期(t1/2)为约2至约240小时、约2至约168小时、约6至约168小时或约12至约168小时或约12至约120小时之间的前药。在一个实施方案中，在血清中和在生理条件下的前药元件的切割半衰期为约0.5天至约10天。本文公开的生理条件意在包括温度为约35-40℃，ph为约7.0至约7.4，更通常包括水性环境中ph为7.2-7.4，温度为36-38℃。在一个实施方案中，在生理条件下能够经历二酮哌嗪形成的肽通过酰胺键与胰岛素肽的脂族氨基共价连接。有利的是，切割(并且由此活化前药)速率取决于二肽前部分(pro-moiety)的结构和立体化学，还取决于亲核体的强度。本文公开的前药最终将以化学法转化成可被该药物的天然受体识别的结构，其中该化学转化的速度将决定体内生物作用的开始时间和持续时间。本申请公开的前药化学依赖于不依赖额外化学添加剂或酶的分子内化学反应。转化速度受二肽取代基的化学性质及其在生理条件下的切割的控制。由于生理ph和温度紧紧地在严格限定的范围内调节，因此前药至药物的转化速度将表现出高的患者内和患者间再现性。如本文所公开，提供前药，其中生物活性多肽具有至少1小时、更通常大于24小时但不大于10天的延长半衰期，并且在生理条件下，通过由固有的化学不稳定性驱动的非酶促反应而转变为活性形式。在一个实施方案中，前药的非酶促活化t1/2时间为约12-约168小时之间，更通常为12-约120小时或12小时和72小时之间，而在一个实施方案中，通过将前药在37℃和ph7.2下的磷酸盐缓冲溶液(例如pbs)中温育测定的t1/2介于24-48小时之间。运用公式t1/2=.693/k，来计算各种前药的半衰期，其中‘k’为前药降解的一级速率常数。在一个实施方案中，前药的活化在酰胺键连接的二肽切割，并形成二酮哌嗪或二酮吗啉和活性胰岛素肽之后发生，其中二肽与足够大小以结合血清白蛋白的烷基或酰基(例如c18-c30)共价连接。已经鉴定由天然或合成氨基酸组成的特定二肽在生理条件下促进分子内分解以释放活性胰岛素肽。二肽可与存在于天然胰岛素上的氨基或者与通过天然胰岛素肽修饰而引入胰岛素肽中的氨基连接(通过酰胺键)。可以向二肽羧基端添加另外的氨基酸以产生可通过酰胺键与胰岛素肽连接的三肽或四肽。在其中向原始二肽元件添加另外一个或两个氨基酸的那些实施方案中，在切割二肽以形成二酮哌嗪或二酮吗啉后，另外一个或两个氨基酸将保持与胰岛素肽连接。在一个实施方案中，一个或两个另外的氨基酸是带电的氨基酸。在一个实施方案中，选择耐受存在于哺乳动物血清中的肽酶(包括例如二肽基肽酶iv(dpp-iv))切割的二肽结构。因此，在一个实施方案中，与蛋白酶不存在时进行反应相比，在血清蛋白酶存在下利用生理条件进行反应时，二肽前药元件从生物活性肽(例如，胰岛素肽(q))中的切割速率不显著提高(例如大于2x)。因此二肽前药元件自胰岛素肽的切割半衰期(在生理条件下的pbs中)不超过在包含dpp-iv蛋白酶的溶液中二肽前药元件自胰岛素肽的切割半衰期的2、3、4或5倍。在一个实施方案中，包含dpp-iv蛋白酶的溶液为血清，更具体地为哺乳动物血清，包括人血清。在一个实施方案中，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽，a-b-c-为通过酰胺键与q连接的肽，其中a为氨基酸，b为n-烷基化氨基酸，且c为酰胺键、x70或x70x71，其中x70和x71为氨基酸，其独立地选自甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，其中a或b之一包含与c16-c30酰基或c16-c30烷基共价连接的侧链。在一个实施方案中，与c16-c30酰基或c16-c30烷基连接的氨基酸具有(c1-c8烷基)nh2侧链。在一个实施方案中，a为包含(c1-c8烷基)nh2侧链的氨基酸或羟酸，其中侧链与c16-c30酰基或c16-c30烷基共价连接。在一个实施方案中，a的侧链与酰基或烷基之间的连接通过间隔物，所述间隔物包含一个或两个带电氨基酸。在一个实施方案中，b为n-烷基化氨基酸；且c为酰胺键、x70或x70x71，其中x70和x71为氨基酸，其独立地选自甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。此外，a、b和c通过酰胺键彼此连接，并且a-b-c肽经由q的脂族氨基通过酰胺键与q连接。在一个实施方案中，脂族氨基选自a链或b链的n端氨基酸上的α氨基或q的b3、b28或b29氨基酸的侧链上的脂族氨基。在一个实施方案中，a-b-c肽通过酰胺键经由胰岛素肽的b3、b28或b29位的赖氨酸侧链的氨基与q连接。在一个实施方案中，a-b-c肽通过酰胺键经由胰岛素b链的n端胺与q连接。在另一个实施方案中，a-b-c肽通过酰胺键经由胰岛素b链的n端胺与q连接，其中氨基酸a或氨基酸b的侧链与不可逆结合血浆蛋白的部分共价连接。在一个实施方案中，不可逆结合血浆蛋白的部分是c16-c30酰基或c16-c30烷基，并且在另一个实施方案中，a氨基酸或b氨基酸包含(c1-c8烷基)nh2侧链，其中c16-c30酰基或c16-c30烷基通过(c1-c8烷基)nh2侧链的脂族胺共价结合。在一个实施方案中，a氨基酸与不可逆结合血浆蛋白的部分共价连接。如本文所公开，在一个实施方案中，通过直接或通过间隔物部分间接地酰化a或b的侧链的胺、羟基或硫醇而修饰胰岛素前药的前药元件的a或b氨基酸以包含酰基。根据一个实施方案，c16-c30酰基或c16-c30烷基经由间隔物与a连接，其中间隔物位于胰岛素肽的氨基酸和酰基或烷基之间。在示例性实施方案中，间隔物是氨基酸、二肽或三肽或亲水双官能间隔物。在一个实施方案中，间隔物包含一个或两个带电氨基酸。在一个实施方案中，间隔物是单电荷氨基酸。在另一个实施方案中，间隔物是二肽，其中二肽包含一个或两个带电氨基酸。在一个实施方案中，间隔物选自：asp、glu、his、arg、lys和包含nh2(ch2ch2o)n(ch2)mcooh的间隔物，其中m是1-6的任何整数，而n是2-12的任何整数。在一个实施方案中，a包含通过γ谷氨酸间隔物用c16-c22脂肪酸酰化的(c1-c8烷基)nh2侧链。在一个实施方案中，a包含通过二肽γ谷氨酸-γ谷氨酸间隔物用c18-c22脂肪酸酰化的(c1-c8烷基)nh2侧链。结构a-b-c的b氨基酸为n-烷基化氨基酸，其中n-烷基包含c1-c18支链、环状或直链烃链。根据一个实施方案，b为用c1-c18烷基、c3-c18烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)或(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)n-烷基化的氨基酸。在一个实施方案中，结构a-b-c的b氨基酸用c1-c6烷基、(c1-c4烷基)(c5-c6芳基)或(c1-c4烷基)(c4-c6环烷基)进行n-烷基化。在一个实施方案中，b用正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基进行n-烷基化。在另一个实施方案中，b用异丙基、仲丁基或叔丁基进行n-烷基化。在一个实施方案中，b选自甘氨酸(n-c1-c10烷基)、异亮氨酸(n-c1-c10烷基)、缬氨酸(n-c1-c10烷基)和苏氨酸(n-c1-c10烷基)。在一个实施方案中，b选自甘氨酸(n-c1-c6烷基)、异亮氨酸(n-c1-c6烷基)、缬氨酸(n-c1-c6烷基)和苏氨酸(n-c1-c6烷基)。在一个实施方案中，b选自甘氨酸(n-甲基)、甘氨酸(n-乙基)、甘氨酸(n-丙基)、甘氨酸(n-丁基)、甘氨酸(仲丁基)、甘氨酸(叔丁基)、甘氨酸(n-戊基)、甘氨酸(n-己基)、甘氨酸(n-庚基)和甘氨酸(n-辛基)。在一个实施方案中，b选自甘氨酸(n-异丙基)、甘氨酸(n-仲丁基)或甘氨酸(n-叔丁基)。根据一个实施方案，式a-b-c的c是氨基酸或二肽。在一个实施方案中，包含c的氨基酸包括至少一个具有侧链的氨基酸，所述侧链独立地选自h、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)so3h、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2。在一个实施方案中，c是二肽，其中二肽的一个或两个氨基酸包含选自h、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)so3h、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2的侧链。在一个实施方案中，c的氨基酸独立地选自甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，c的氨基酸独立地选自甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q是胰岛素肽，且a-b-c包含以下结构：其中r1为c18-c30烷基、(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2为h或c1-c6烷基；r3选自c2-c4烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4和r8独立地选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r5为nhr6或oh；r6为h或c1-c8烷基；r7选自h、oh、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c0-c4烷基)nh2和(c0-c4烷基)oh；r9选自c18-c30酰基；r10、r11、r12和r13独立地选自h、ch2、ch2oh、ch2sh、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，其中a-b-c通过酰胺键经由q的脂族氨基与q连接。在一个实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r3选自c2-c4烷基；r2、r4、r11和r13各自为h；r5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是包含一个或两个带电氨基酸的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，且a-b-c通过酰胺键经由胰岛素b链的n端胺与q连接。在一个实施方案中，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q是胰岛素肽，且a-b-c包含以下结构：其中r1为c18-c30烷基、(c1-c6烷基)nh-s1-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r3选自c2-c4烷基，r4、r11和r13各自为hr5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；且r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，其中a-b-c通过酰胺键经由q的脂族氨基与q连接。在一个实施方案中，r1为(ch2)4-s1-nhr9或(ch2)4nhr9；r3为c3-c4烷基；r5为nh2；且r9为c18-c28酰基，且a-b-c通过酰胺键经由胰岛素b链的n端胺与q连接。本文公开的前药的胰岛素肽可以包含本领域技术人员已知对胰岛素受体具有激动剂活性的的任何已知的胰岛素。根据一个实施方案，胰岛素肽包含a链序列giveqccx8sicslyqlenycx21r44(seqidno:3)和b链序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)，其中b链通过二硫键与a链连接；x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；x25选自组氨酸和苏氨酸；x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；x33选自天冬氨酸和谷氨酸；x34选自丙氨酸和苏氨酸；x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；x45为酪氨酸或苯丙氨酸；r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n端胺；且r44为cooh或conh2。在一个实施方案中，胰岛素肽包含a链序列giveqccx8sicslyqlenycx21(seqidno:3)和b链序列r22-hlcgshlvealylvcgergfx45(seqidno:15)，其中所述b链通过二硫键与所述a链连接；r22为键或选自fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、vnq、nq和q的1-4个氨基酸序列；x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、赖氨酸、甘氨酸和丙氨酸；且x45为组氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。在一个实施方案中，a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn-r44(seqidno:1)，且所述b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)，其中r44为cooh或conh2。可将本文公开的胰岛素前药进一步修饰以改善其在储存期间的稳定性。在一个实施方案中，二肽元件的n端胺与部分连接，所述部分保持与n端结合，直到施用于患者。在一个实施方案中，式a-b-c-q的胰岛素前药还包含通过a的n端胺与a连接的血清酶可切割部分。血清酶可切割部分与a的n端的连接阻止了在不存在酶促活性下形成二酮哌嗪或二酮吗啉和从胰岛素切割a-b。暴露于血清酶后，血清酶可切割部分将被去除，随后前药的活化将依赖于基于a-b结构切割a-b的非酶促降解机制。在一个实施方案中，酶可切割部分是由二肽基肽酶iv(dpp-iv)切割的肽。在一个实施方案中，血清酶可切割肽通过a的n端胺与a连接，并且选自具有序列z-脯氨酸或z-丙氨酸的二肽，其中z选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在一个实施方案中，酶可切割部分是由二肽基肽酶iv(dpp-iv)切割的肽，包括例如arg-pro、lys-pro或glu-pro的二肽。在一个实施方案中，在血清中在生理条件下的a-b-c从q的切割半衰期为约2至约168小时。在另一个实施方案中，在血清中在生理条件下的a-b-c从q的切割半衰期为约0.5天至约10天。在一个实施方案中，提供包含以下结构的胰岛素前药：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽；a为包含(c1-c8烷基)nh2侧链的氨基酸，其中侧链与不可逆结合血浆蛋白的部分共价连接，其中所述部分通过间隔物与a的侧链连接，其中间隔物包含一个或两个带电氨基酸；b为n-烷基化氨基酸；且c为酰胺键、x70或x70x71，其中x70和x71为具有侧链的氨基酸，所述侧链独立地选自h、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)so3h、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2，其中a-b-c通过酰胺键经由q的脂族氨基与q连接，所述脂族氨基选自a链或b链的n端氨基酸上的α氨基或q的b3、b28或b29氨基酸的侧链上的脂族氨基。在一个实施方案中，不可逆结合血浆蛋白的部分是c16-c30酰基或c16-c30烷基，其中a的侧链与酰基或烷基之间的连接通过所述间隔物。在一个实施方案中，c为氨基酸或二肽，其中c的氨基酸选自甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，c为二肽，其中二肽的氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，c为二肽，其中两个氨基酸之一为甘氨酸或丙氨酸，且二肽的另一个氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在另一个实施方案中，b为用c1-c18烷基、c3-c18烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)或(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)n-烷基化的氨基酸。在一个实施方案中，胰岛素前药包含与胰岛素的a或b链的n端氨基或b3、b28或b29位的赖氨酸的侧链连接的以下一般结构的肽：其中r1为(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2为h或c1-c6烷基；r3选自c2-c4烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4和r8独立地选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r10、r11、r12和r13独立地选自h、ch3、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基);r5为nhr6或oh；r6为h,或c1-c8烷基；r7选自h、oh、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c0-c4烷基)nh2和(c0-c4烷基)oh；r9选自c18-c30酰基；且s1是键或由1-6个氨基酸组成的间隔物，其中所述间隔物包含一个或多个选自选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸的带电氨基酸。在一个实施方案中，s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，胰岛素前药包含以下一般结构的肽r1为c18-c30烷基、(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r3选自c2-c4烷基，r4、r11和r13各自为hr5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；且r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2和(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2；且s1是由与胰岛素的a或b链的n端氨基或b3、b28或b29位的赖氨酸的侧链连接的一个或两个选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸的带电氨基酸组成的间隔物。在一个实施方案中，s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，由式a-b-c表示的肽与胰岛素的b链的n端氨基连接。在另一个实施方案中，r1为(ch2)4-r9或(ch2)4-s1-nhr9，r3为c3-c4烷基；r5为nh2；且r9为c18-c28酰基。在另一个实施方案中，r1选自(ch2)4nhco(ch2)17ch3、(ch2)4nhco(ch2)19ch3和(ch2)4nhco(ch2)21ch3。根据一个实施方案，提供胰岛素前药，其中胰岛素蛋白包含a链序列giveqcctsicslyqlenycn-r44(seqidno:1)和选自以下的b链序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)，其中r44为cooh或conh2，以及在a链或b链的n端氨基或b3、b28或b29位的赖氨酸的侧链胺处与所述胰岛素肽共价连接的前药，其中前药元件包含以下结构：，其中r1选自h、(c1-c4烷基)o-s1-r9、(c1-c4烷基)s-s1-r9、(c1-c4烷基)conh-s1-r9、(c1-c4烷基)coo-s1-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9、(c1-c6烷基)nhr9和(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)-s1-r9；r2和r8独立地选自h、c1-c8烷基、c2-c8烯基、(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conhh、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nhh、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；r3为c1-c18烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4为h、c1-c18烷基、(c1-c6烷基)nhr9或c1-c6烷基)nh-s1-r9，r5为oh或nhr6；r6为h、c1-c8烷基；r7选自h、oh和or9；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h或c1-c6烷基；r10和r12独立地选自h、ch3、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由1-6个氨基酸组成的间隔物，其中所述间隔物包含一个或多个选自选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸的带电氨基酸，条件是当r4为h或c1-c18烷基时，r1不是h。在另一个实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nhr9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2、r4、r11和r13各自为h；r5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在另一个实施方案中，r1为(c3-c5烷基)nh-s1r9,或(c3-c5烷基)nhr9；r2、r4、r11和r13各自为h；r5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；且r9为c18-c30酰基。在另一个实施方案中，胰岛素前药包含以下结构：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽；且a-b-c包含以下结构：，其中a-b-c通过酰胺键经由a链或b链的n端氨基酸或q的b3、b28或b29氨基酸的侧链上的脂族氨基与q连接，r2、r4、r8、r11和r13各自为h；r1为(c1-c6烷基)nhr9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r3为c2-c8烷基，r5为nh2，r10和r12独立地选自h、ch3、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)，r9选自c18-c30酰基和c18-c30烷基，且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在另一个实施方案中，r1为(ch2)4nhr9或(ch2)4nh-s1-r9；r3为c3-c4烷基；且r9为c18-c28酰基。根据一个实施方案，本文公开的前药的胰岛素组分包含a链序列giveqccx8sicslyqlenycx21(seqidno:3)和b链序列r22-hlcgshlvealylvcgergfx45(seqidno:15)，其中b链通过二硫键与所述a链连接；r22为键或选自fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、vnq、nq和q的1-4个氨基酸序列；x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸、甘氨酸和丙氨酸；且x45为组氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。在一个实施方案中，胰岛素肽包含a和b链，其中a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn(seqidno:1)，且b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)。根据一个实施方案，本文公开的前药的胰岛素组分包含a链序列givx4x5ccx8x9x10cx12lx14x15lx17x18ycx21-r44(seqidno:19)和b链序列r22-x25lcgx29x30lvx33x34lylvcgx41x42gfx45(seqidno:20)，其中所述b链通过二硫键与所述a链连接；x4为谷氨酸或天冬氨酸；x5为谷氨酰胺或谷氨酸x8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；x9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；x10为异亮氨酸或丝氨酸；x12为丝氨酸或天冬氨酸；x14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；x15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；x17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺；x18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸；x21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸；x25为组氨酸或苏氨酸；x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；x33选自天冬氨酸和谷氨酸；x34选自丙氨酸和苏氨酸；x41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；x42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸；x45为酪氨酸或苯丙氨酸；r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n端胺；且r44为cooh或conh2。根据一个实施方案，胰岛素前药包含以下结构：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽；且a-b-c包含以下结构：，其中a-b-c通过酰胺键经由a链或b链的n端氨基酸或q的b3、b28或b29氨基酸的侧链上的脂族氨基与q连接，r1选自h、(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c4烷基)o-s1-r9、(c1-c4烷基)s-s1-r9、(c1-c4烷基)conh-s1-r9、(c1-c4烷基)coo-s1-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9、(c1-c6烷基)nhr9和(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)-s1-r9；r2和r8独立地选自h、c1-c8烷基、c2-c8烯基、(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conhh、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nhh、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；r3为c1-c18烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4为h、c1-c18烷基或(c1-c6烷基)nh-s1-r9，r5为oh或nhr6；r6为h、c1-c8烷基；r7选自h、oh和or9；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，条件是当r4为h或c1-c18烷基时，r1不是h。在一个实施方案中，r1为(c3-c5烷基)nh-s1-r9或(c3-c5烷基)nhr9；r2、r4、r11和r13各自为h；r5为nh2；r8为h或c1-c8烷基；r9为c18-c30酰基；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2和(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，r3为c1-c8烷基，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环。在一个实施方案中，r1为(ch2)4nhr9或(ch2)4nh-s1-r9；r3为c3-c4烷基；且r9为c18-c28酰基。根据一个实施方案，前药二肽元件的第一氨基酸具有d-立体化学。根据一个实施方案，提供治疗高血糖或糖尿病的方法，其中所述方法包括施用有效量的包含本文公开的胰岛素前药的药物组合物。在一个实施方案中，胰岛素前药被设计为在哺乳动物血清中具有大于一天的半衰期。在这样的实施方案中，胰岛素前药可以以每日剂量施用，所述每日剂量是当施用胰岛素蛋白的相应的活性非前药形式时施用的剂量的一部分。在一个实施方案中，前药以相应的非前药胰岛素肽的最佳剂量的分数1/n每日施用，其中n表示在血清中在生理条件下从q切割a-b-c的半衰期(天)。将二肽前药元件设计成在生理条件下和在缺乏酶活性时自切割其酰胺键形成胰岛素类似物。在一个实施方案中，二肽延伸物的n端氨基酸包含c-烷基化氨基酸(例如氨基异丁酸)。在一个实施方案中，二肽的c端氨基酸包含n-烷基化氨基酸(例如脯氨酸或n-甲基甘氨酸)。在一个实施方案中，二肽包含n端c-烷基化氨基酸和随后的n-烷基化氨基酸的序列。包含胰岛素前药类似物的a链和b链可包含各自肽的天然序列(即seqidno:1和seqidno:2)，或者可包含seqidno:1和/或seqidno:2的衍生物，其中所述衍生物包括将a19位上的氨基酸修饰成4-氨基苯丙氨酸和/或一个或多个选自以下位置的氨基酸置换：a5、a8、a9、a10、a14、a15、a17、a18、a19和a21、b1、b2、b3、b4、b5、b9、b10、b13、b14、b17、b20、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30；或者在b1-4和b26-30位置中的任何或全部的缺失。在一个实施方案中，肽前药元件a-b-c与胰岛素a链或b链的n端氨基连接，其中肽前药元件的b氨基酸包含n-烷基化氨基酸，而肽前药元件的a氨基酸为任何氨基酸，条件是，如果肽前药元件的b氨基酸为脯氨酸，则肽前药元件的a氨基酸包含c-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，肽前药元件包含下式的通用结构：其中r1和r8独立地选自h、(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c5烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w)c1-c12烷基，其中w为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；r2和r4独立地选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c5烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w)c1-c12烷基，其中w为选自n、s和o的杂原子，或者r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r3选自c1-c18烷基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)nh2、(c1-c18烷基)sh、(c0-c4烷基)(c3-c6)环烷基、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7和(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r5为nhr6或oh；r6为h、c1-c8烷基，或者r6和r2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r7选自h和oh，条件是当r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环时，r1和r2两者都不是hr9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或包含1-6肽的间隔物，其中1-6肽包含1、2或3个带电氨基酸，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，条件是r1或r8之一为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9。在一个实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9，且r2和r4为h。在另一个实施方案中，肽前药元件包含以下一般结构：其中r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2和r8为h或c1-c8烷基；r4选自h、c1-c8烷基、c2-c8烯基、(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7和ch2(c3-c9杂芳基)；r3选自c1-c8烷基、(c3-c6)(c5-c6环烷基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r5为nhr6；r6为h、c1-c8烷基；且r7选自氢、c1-c18烷基、(c0-c4烷基)cooh、(c0-c4烷基)nh2、(c0-c4烷基)oh和卤素；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸为呈d立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，提供具有以下通式的前药元件：其中r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9r2为h；且r4独立地选自h、c1-c8烷基、c2-c8烯基、(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7和ch2(c5-c9杂芳基)；r3选自c1-c8烷基、(c1-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c5-c10环烷基)和ch2(c5-c9杂芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；r5为nh2；r7选自h和oh且r8为hr9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，条件是当r4为h或c1-c18烷基时，r1不是h。在一个实施方案中，r3为c1-c8烷基且r4选自h、c1-c6烷基、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7和ch2(c5-c9杂芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸为非编码氨基酸，且在一个实施方案中为呈d立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，提供具有一般结构a-b-c-q的胰岛素前药，其中q是包含a和b链的胰岛素肽，其中a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn(seqidno:1)，且b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)；且a-b-c是具有以下结构的肽前药元件：，其中r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2选自氢和c1-c8烷基；r3为c1-c8烷基；r4为h、c1-c8烷基或(c1-c4烷基)(c6-c10芳基)r7；r5为nh2；r7选自氢、c1-c8烷基和(c0-c4烷基)oh；r8为氢；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在另一个实施方案中，r2为氢；r3为c1-c18烷基；r4和r8各自为氢；r5为nh2；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2和(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。根据一个实施方案，提供包含胰岛素肽和酰胺连接的前药元件的胰岛素前药类似物。更具体地，胰岛素前药类似物包含a链序列和b链序列，其中a链包含序列z-giveqccx8sicslyqlenycx21r44(seqidno:3)(seqidno:3)或者其类似物，该类似物包含通过1-9、1-5或1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于seqidno:3的序列：a5、a8、a9、a10、a14、a15、a17、a18(相对于天然胰岛素a链)，并且b链序列包含序列j-r22-x25lcgx29x30lvealylvcgergfx45(seqidno:)或者其类似物，该类似物包含通过1-10、1-5或1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于seqidno:14序列的序列：b1、b2、b3、b4、b5、b13、b14、b17、b20、b22、b23、b26、b27、b28、b29和b30(相对于天然胰岛素b链；即seqidno:的氨基酸x25对应于天然胰岛素的b5位)，其中x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；x25选自组氨酸和苏氨酸；x29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；x45为酪氨酸或苯丙氨酸；r22选自fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n端胺；且r44为cooh或conh2。z和j独立地为h或包含与胰岛素a或b链的n端胺连接的以下一般结构的肽前药元件：，其中r1选自(c1-c6烷基)nh-r9和(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2、r4和r8独立地选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w)c1-c12烷基，其中w为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；或者r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r3选自c1-c18烷基、(c0-c4烷基)(c3-c6)环烷基、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7和(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r5为nhr6；r6为h、c1-c8烷基；且r7选自h和oh；r13为cooh或conh2；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在另一个实施方案中，a链包含序列giveqccx8sicslyqlenycx21r13(seqidno:3)，且b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)；和fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)，其中r13为cooh，并且b链的羧基端氨基酸任选地具有替代天然α碳羧基的酰胺(conh2)，其余名称如紧接的上文中所定义。在一个实施方案中，a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn-r44(seqidno:1)，且b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)或fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物包含代替a链和/或b链上的c端羧酸酯的c端酰胺或酯。根据一个实施方案，将具有以下通式的本文公开的肽前药元件进一步修饰以包含大聚合物，其干扰胰岛素类似物与胰岛素或igf-1受体相互作用的能力：，二肽的随后切割从二肽复合物中释放胰岛素类似物，其中释放的胰岛素类似物具有完整活性。根据一个实施方案，前药元件通过酰胺键与脂族胺连接，所述脂族胺选自a链或b链的n端胺或b3、b27或b28位的赖氨酸的侧链胺，其中在本发明中定义了r1、r2、r4、r8、r10、r11、r12和r13的取代基。在一个实施方案中，前药元件在a链或b链的n端胺通过酰胺键与胰岛素肽共价结合，或者与携带内部氨基酸侧链的胺连接，其中前药元件还包含与前药元件连接的长效聚合物。根据一个实施方案，本文公开的肽前药元件具有以下一般结构：其中d1是通过酰胺键与肽前药元件共价连接的血清酶可切割部分。在一个实施方案中，d1是由二肽基肽酶iv(dpp-iv)切割的肽，包括例如arg-pro、lys-pro或glu-pro的二肽。在本发明中定义了r1、r2、r4、r8、r10、r11、r12和r13的取代基。在一个实施方案中，胰岛素肽的天然氨基酸被适合于与本文公开的前药元件形成酰胺键的氨基酸置换。在一个实施方案中，携带前药元件的长效物在选自以下的位置连接：a14、a19、b3、b16、b28和b29。在一个实施方案中，两个或更多个携带前药元件的长效聚合物与胰岛素肽连接，其中携带前药元件的第一长效聚合物与b链的n端胺连接，并且携带前药元件的第二长效聚合物与a链的n端胺或胰岛素的b3、b28或b29位的赖氨酸的侧链胺连接。在一个实施方案中，长效聚合物是不可逆结合哺乳动物血浆蛋白的部分，并且在一个实施方案中，长效聚合物是具有足够大小以不可逆结合哺乳动物血清白蛋白的酰基或烷基。在一个实施方案中，选择长效聚合物以具有生物相容性和足够大小(或能够与足够大小的血浆蛋白不可逆结合)，其通过共价连接前药元件修饰的胰岛素肽在施用患者后在注射部位保持隔离(sequestered)和/或不能与其相应受体发生相互作用。前药元件的随后切割释放胰岛素肽以与预期靶标相互作用。根据一个实施方案，长效聚合物选自本领域技术人员已知的生物相容性聚合物。长效聚合物的大小通常约为20,000-120,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物的大小为约40,000-100,000或约40,000-80,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物的大小为约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿。合适的长效聚合物包括但不限于葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、基于己内酯的聚合物、聚(己内酯)、聚酐、聚胺、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚二氧杂环己酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸及其共聚物、三元共聚物及其混合物，以及生物可降解聚合物及其共聚物，包括基于己内酯的聚合物、聚己内酯和包括聚对苯二甲酸丁二酯的共聚物。在一个实施方案中，长效聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和乳酸与乙醇酸的共聚物，而在一个具体实施方案中，长效聚合物为聚乙二醇。在一个实施方案中，长效聚合物为聚乙二醇，且与二肽元件连接的长效聚合物的总的分子量为约40,000-80,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物是不可逆结合哺乳动物血浆蛋白的部分，并且在一个实施方案中，长效聚合物是具有足够大小以不可逆结合哺乳动物血清白蛋白的酰基或烷基。根据一个实施方案，前药元件还包含聚环氧乙烷、烷基或酰基。在一个实施方案中，一条或多条聚环氧乙烷链与肽前药元件连接，其中聚环氧乙烷链的总的分子量为约20,000至约80,000道尔顿，或40,000-80,000道尔顿或40,000-60,000道尔顿。在一个实施方案中，聚环氧乙烷为聚乙二醇。在一个实施方案中，至少一条分子量约40,000道尔顿或约20,000道尔顿的聚乙二醇链与前药元件直接地或通过接头/间隔物连接。在另一个实施方案中，将肽前药元件的自切割的二肽用具有对于结合血清白蛋白而言足够大小的酰基酰化，从而在给药时使胰岛素类似物失活。酰基可以是直链或支链的，并且在一个实施方案中是c16-c30脂肪酸。例如，酰基可以是c16脂肪酸、c18脂肪酸、c20脂肪酸、c22脂肪酸、c24脂肪酸、c26脂肪酸、c28脂肪酸或c30脂肪酸中的任一种。在一个实施方案中，酰基是c16-c20脂肪酸，例如c18脂肪酸或c20脂肪酸或为c18或c30脂肪酸。二肽元件上的取代基和二肽前药元件的连接位点的选择可影响二肽前药元件从胰岛素肽的化学切割的速率。在一个实施方案中，提供包含a链序列和b链序列的胰岛素前药，其中a链包含序列giveqccx8sicslyqlenycx21r13(seqidno:3)，并且b链序列包含序列x14-x4lcgx5x6lvealylvcgergff(seqidno:4)，其中x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；x4选自组氨酸和苏氨酸；x5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；且x14选自键、x9vnq(seqidno:21)、vnq、nq和q，且x9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸，进一步其中包含以下结构的肽前药元件与seqidno:3或seqidno:4的肽的n端胺连接：，其中r1选自(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2、r4和r8为h；r3为c1-c6烷基；r5为nh2；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，a链包含序列giveqccx8sicslyqlenycx21r13(seqidno:3)，且b链包含序列r22-x25lcgax30lvdalylvcgdx42gfy(seqidno:65)，其中x8为苯丙氨酸或组氨酸；x21为丙氨酸或天冬酰胺；x25为组氨酸或苏氨酸；x30选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；x42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；r22选自ayrpse(seqidno:14)、fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、pgpe(seqidno:11)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和n端胺；且r44为cooh或conh2。在另一个实施方案中，a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn-r44(seqidno:1)，且b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)。在一个实施方案中，具有与胰岛素a链或b链肽的n端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约12至约72小时之间，或者在一个实施方案中约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：其中r1和r2独立地选自氢、c1-c8烷基和(c1-c4烷基)nh2，或者r1和r2通过(ch2)p连接，其中p为2-9；r3为c1-c8烷基，或者r3和r4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；r4选自氢和c1-c8烷基；且r5为nh2，条件是，r1和r2两者都不为氢。在其它实施方案中，具有与胰岛素a链或b链肽的n端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约12至约72小时之间，或者在一个实施方案中约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：其中r1和r2独立地选自氢、c1-c8烷基和(c1-c4烷基)nh2；r3为c1-c6烷基；r4为氢；且r5为nh2，条件是，r1和r2两者都不为氢。在一个实施方案中，具有与胰岛素a链或b链肽的n端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约12至约72小时之间，或者在一个实施方案中约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：其中r1和r2独立地选自氢和c1-c8烷基、(c1-c4烷基)nh2，或者r1和r2通过(ch2)p连接，其中p为2-9；r3为c1-c8烷基；r4为(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7；r5为nh2；且r7选自氢、c1-c8烷基和(c0-c4烷基)oh，条件是，r1和r2两者都不为氢。此外，提供具有与胰岛素a或b链肽的n端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72至约168小时的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：其中r1选自氢、c1-c8烷基和(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7；r3为c1-c18烷基；r4和r8各自为氢；r5为nhr6或oh；r6为h、c1-c8烷基，或者r6和r1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且r7选自氢、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c0-c4烷基)conh2、(c0-c4烷基)cooh、(c0-c4烷基)nh2、(c0-c4烷基)oh和卤素，条件是，如果r1为烷基或(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7，则r1和r5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。在一个实施方案中，二肽前药元件与胰岛素肽内部氨基酸的侧链胺连接，其中内部氨基酸包含式iv的结构：其中n为选自1-4的整数。在一个实施方案中，n为3或4，而在一个实施方案中，内部氨基酸为赖氨酸。在一个实施方案中，二肽前药元件与位于胰岛素肽b链3、28或29位的氨基酸侧链上的伯胺连接。在一个实施方案中，提供包含a链序列和b链序列的胰岛素前药，其中a链包含序列giveqccx1sicslyqlenycx3(seqidno:3)，并且b链序列包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgergfx8(seqidno:14)，其中x1选自苏氨酸和组氨酸；在另一个实施方案中，提供胰岛素前药类似物，其包含a链序列giveqccx1sicslyqlenycx3(seqidno:3)和包含序列z-x4lcgx5x6lvealylvcgergff(seqidno:4)的b链序列，其中z是包含以下一般结构的肽：其中x1选自苏氨酸和组氨酸；x3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；x4选自组氨酸和苏氨酸；x5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；其中r1选自h、(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9和c1-c8烷基；r2和r8独立地选自h或c1-c4烷基；r4选自h、(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9、c1-c8烷基、c2-c8烯基、(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c1-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c1-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、ch2(c5-c9杂芳基)，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r3选自c1-c8烷基、(c1-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c1-c4烷基)(c6-c10芳基)r7和(c1-c4烷基)oh；r5为nh2；r7选自h和oh；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，a链包含序列giveqccx1sicslyqlenycx3(seqidno:3)，且b链序列包含序列z-x9vnqx4lcgx5x6lvealylvcgergffytpkt(seqidno:10)或z-x9vnqx4lcgx5x6lvealylvcgergffytkpt(seqidno:13)，其中x1选自苏氨酸和组氨酸；x3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；x4选自组氨酸和苏氨酸；x5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；x6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；x9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。根据一个实施方案，提供单链胰岛素前药类似物，其中人胰岛素b链的羧基端或人胰岛素b链的功能类似物与人胰岛素a链的n端或人胰岛素b链的功能类似物共价连接，并且进一步其中，具有以下一般结构的肽前药部分通过酰胺键与单链胰岛素类似物的n端胺连接：其中r1为(c1-c6烷基)nh-s1-r9或(c1-c6烷基)nh-r9；r2为h或c1-c6烷基；r3选自c1-c6烷基、c3-c8烯基、(c0-c4烷基)(c4-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c3-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)，或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r4和r8独立地选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基；r10、r11、r12和r13独立地选自h、ch3、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；r5为nh2；r7选自h、oh、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c0-c4烷基)nh2和(c0-c4烷基)oh；r9选自c18-c30酰基和c16-c30烷基；且s1是键或由1-6个氨基酸组成的间隔物，其中所述间隔物包含一个或多个选自选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、精氨酸和赖氨酸的带电氨基酸。在一个实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-s1-r9或(c1-c6烷基)nh-r9；r2和r8均为h；且r3为c1-c6烷基。在另一个实施方案中，r9为c18-c30酰基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一个实施方案中，胰岛素肽包含a链序列giveqccx8sicslyqlenycx21(seqidno:3)和b链序列r22-hlcgshlvealylvcgergfx45(seqidno:15)，其中所述b链通过二硫键与所述a链连接；r22为氨基或选自fvnq(seqidno:12)、fvkq(seqidno:8)、vnq、nq和q的1-4个氨基酸序列；x8选自苏氨酸和组氨酸；x21选自天冬酰胺、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸；且x45为组氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，a链包含序列giveqcctsicslyqlenycn-r44(seqidno:1)，且所述b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)和fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)。根据一个实施方案，单链胰岛素类似物包含式b-p-a的化合物，其中：b表示人胰岛素的b链或者本文公开的b链的功能类似物或前药类似物之一，a表示人胰岛素的a链或者本文公开的a链的功能类似物之一，并且p表示接头，包括肽接头，其使a链与b链共价连接。在一个实施方案中，接头为约5至约18、或约10至约14、或约4至约8个或约6个氨基酸的肽接头。在一个实施方案中，b链通过4-12或4-8个氨基酸的肽接头与a链连接。在一个实施方案中，单链类似物的肽接头选自：gygsssrrapqt；seqidno:23、gygsssrr(seqidno:61)、gygsssor(seqidno:63)、gagsssrr(seqidno:66)或gagsssrrapqt(seqidno:64)，或通过1-3个氨基酸置换或1-2个氨基酸置换而不同于seqidno:23或66的序列。任选地，单链类似物的连接部分还可以充当肽前药元件的连接位点，且在一个实施方案中，连接部分是包含具有适合通过酰胺键连接本发明的肽前药元件的侧链基团的氨基酸的肽接头。根据一个实施方案，肽接头长度为5-18个氨基酸，且包含选自以下的序列：gly-gly-gly-pro-gly-lys-arg(seqidno:22)、gly-tyr-gly-ser-ser-ser-arg-arg-ala-pro-gln-thr(seqidno:23)、arg-arg-gly-pro-gly-gly-gly(seqidno:32)、gly-gly-gly-gly-gly-lys-arg(seqidno:24)、arg-arg-gly-gly-gly-gly-gly(seqidno:25)、gly-gly-ala-pro-gly-asp-val-lys-arg(seqidno:26)、arg-arg-ala-pro-gly-asp-val-gly-gly(seqidno:27)、gly-gly-tyr-pro-gly-asp-val-lys-arg(seqidno:28)、arg-arg-tyr-pro-gly-asp-val-gly-gly(seqidno:29)、gly-gly-his-pro-gly-asp-val-lys-arg(seqidno:30)和arg-arg-his-pro-gly-asp-val-gly-gly(seqidno:31)。在一个实施方案中，肽接头长度为7-12个氨基酸且包含序列gly-gly-gly-pro-gly-lys-arg(seqidno:22)或gly-tyr-gly-ser-ser-ser-arg-arg-ala-pro-gln-thr(seqidno:23)。在另一个实施方案中，肽接头包含选自以下的序列：agrgsgk(seqidno:35)、aglgsgk(seqidno:36)、agmgsgk(seqidno:37)、aswgsgk(seqidno:38)、tglgsgq(seqidno:39)、tglgrgk(seqidno:40)、tglgsgk(seqidno:41)、hglysgk(seqidno:42)、kglgsgq(seqidno:43)、vglmsgk(seqidno:44)、vglssgq(seqidno:45)、vglysgk(seqidno:46)、vglssgk(seqidno:47)、vgmssgk(seqidno:48)、vwsssgk(seqidno:49)、vgsssgk(seqidno:50)、vgmssgk(seqidno:51)、tglgsgr(seqidno:52)、tglgkgq(seqidno:53)、kglssgq(seqidno:54)、vklssgq(seqidno:55)、vglksgq(seqidno:56)、tglgkgq(seqidno:57)srvsrrsr(seqidno:60)、gygsssrrapqt(seqidno:23)和vglskgq(seqidno:58)。在一个实施方案中，接头包含gsssrrap(seqidno:62)或srvsrrsr(seqidno:60)。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物具有氨基酸序列：phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr-gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn(seqidno:33)或phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr-gln-pro-leu-ala-leu-glu-gly-ser-leu-gln-lys-arg-gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn(seqidno:34)。本文公开的胰岛素前药可以为包含通过接头结合的至少2、3或更多个肽的二聚体、三聚体或更高级次的多聚体的部分，其中至少一个或两个肽包含与胰岛素肽连接的肽前药元件。二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体，包含选自天然胰岛素、天然igf-1、天然igf-ii和本文公开的胰岛素类似物肽的肽。在一个实施方案中，接头选自双官能硫醇交联剂和双官能胺交联剂。在某些实施方案中，接头为peg，例如5kdapeg、20kdapeg。在一些实施方案中，接头为二硫键。例如，二聚体的每个单体可包含cys残基(例如位于末端的cys或位于内部的cys)，且每个cys残基的硫原子参与在胰岛素单体之间二硫键的形成。二聚体的每个单体代表a链和b链的异源二聚体。a链和b链通过二硫键连接，或制备成单链肽。在本发明的一些方面，胰岛素肽单体(各自包含胰岛素a和b链)通过末端氨基酸(例如n端或c端)、通过内部氨基酸或通过至少一个单体的末端氨基酸和至少一个其它单体的内部氨基酸连接起来。在具体的方面，单体不通过n端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾对尾(tail-to-tail)”方向连接在一起，其中每个单体的c端氨基酸连接在一起。缀合物部分可与本文所述的任何胰岛素肽(包括二聚体、三聚体或更高级次多聚体)共价连接。还可修饰本文公开的前药以改善肽在生理ph下肽在水性溶液中的溶解度，同时通过防止肽的肾清除而提高肽的有效持续时间。因为与血浆蛋白相比，肽的分子大小相对较小，因此容易被清除掉。将肽的分子量增加到40kda以上超过了肾阈，从而显著延长了在血浆中的持续时间。因此，在一个实施方案中，对肽前药作进一步修饰以包含共价连接的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分为血浆蛋白聚环氧乙烷链或免疫球蛋白的fc部分。因此，在一个实施方案中，对本发明公开的前药作进一步修饰以包含一个或多个与胰岛素肽的氨基酸的侧链共价连接的亲水基团。根据一个实施方案，通过将亲水部分与b链的n端氨基酸或位于b链羧基端的赖氨酸氨基酸(包括例如seqidno:9的28位或seqidno:2的29位)的侧链连接，来进一步修饰本文公开的胰岛素前药。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药类似物，其中通过将亲水部分与肽接头的侧链连接来修饰肽接头的一个氨基酸。在一个实施方案中，修饰氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在另一个实施方案中，通过将修饰氨基酸添加至胰岛素前药b链的羧基端，来进一步修饰本文公开的胰岛素前药类似物，其中对c端加入的氨基酸进行修饰以包含与该氨基酸连接的亲水部分。在一个实施方案中，添加至c端的氨基酸为修饰的半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，本文公开的肽前药元件与已添加至b链的c端的赖氨酸残基的侧链胺连接。在一个实施方案中，亲水部分选自血浆蛋白、聚环氧乙烷链和免疫球蛋白的fc部分。在一个实施方案中，亲水基团为聚环氧乙烷链，而在一个实施方案中，两个或更多个聚环氧乙烷链与胰岛素前药类似物的两个或更多个氨基酸侧链共价连接。根据一个实施方案，亲水部分在选自以下的位置与本文公开的胰岛素前药类似物的氨基酸侧链共价连接：a9、a14、a15、b3、b22、b28、b29和b链的c端或n端。对于具有多个聚环氧乙烷链的胰岛素前药类似物，聚环氧乙烷链可以在b链的n端氨基酸上连接，或者与位于b链羧基端的赖氨酸氨基酸的侧链连接，或者通过在肽的c端添加单个氨基酸而连接，其中所添加的氨基酸具有与其侧链连接的聚环氧乙烷链。根据一个实施方案，聚环氧乙烷链或其它亲水部分与包含二肽前药元件的两个氨基酸之一的侧链连接。在一个实施方案中，肽前药元件包含具有与其侧链胺连接的聚环氧乙烷链的赖氨酸(d或l构型)。亲水部分的连接在一个实施方案中，通过将亲水部分与肽共价连接来提高本文公开的胰岛素类似物的溶解度。可在用于使蛋白与活化聚合物分子反应的任何合适的条件下，将亲水部分与胰岛素类似物连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原烷基化、迈克尔加成(michaeladdition)、巯基烷基化或通过peg部分上的反应基(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基(maleimido)或肼基)与目标化合物上的反应基(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚氨基或肼基)进行的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于将水溶性聚合物与一个或多个蛋白连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、硫氢基、巯基、三氟甲磺酸基、三氟乙磺酸基(triflate)、氮丙啶(azidirine)、环氧乙烷和5-吡啶基。如果通过还原烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单一反应性醛，使得聚合程度受到控制。参见例如kinstler等人，adv.drug.deliveryrev.54:477-485(2002)；roberts等人，adv.drugdeliveryrev.54:459-476(2002)；以及zalipsky等人，adv.drug.deliveryrev.16:157-182(1995)。合适的亲水部分包括聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如pog)、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(pog)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy-polyethyleneglycol)、单-(c1-c10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(propropyleneglycolhomopolymers，ppg)和其它聚环氧烷(polyakyleneoxides)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、肠菌酸(colonicacid)或其它多糖聚合物、菲柯尔(ficoll)或葡聚糖及其混合物。根据一个实施方案，亲水部分(例如聚乙二醇链)的分子量选自约500至约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分(例如peg)的分子量选自约500至约5,000道尔顿、或约1,000至约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分(例如peg)的分子量为约10,000至约20,000道尔顿。在其它示例性实施方案中，亲水部分(例如peg)的分子量为约20,000至约40,000道尔顿。在一个实施方案中，将葡聚糖用作亲水部分。葡聚糖是主要通过α1-6键连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。可获得许多分子量范围的葡聚糖，例如，约1kda至约100kda，或约5、10、15或20kda至约20、30、40、50、60、70、80或90kda。考虑了直链或支链聚合物。缀合物的所得制备物可以是基本单分散性的或多分散性的，且每个肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。在一个实施方案中，亲水部分与肽前药元件的氨基酸连接。根据一个实施方案，本文公开的胰岛素前药类似物通过氨基酸置换进一步修饰，其中置换的氨基酸包含适合于与亲水部分(包括例如聚乙二醇)交联的侧链。在一个实施方案中，在待亲水部分连接的胰岛素前药类似物位置上的氨基酸被天然或合成氨基酸置换(或添加至c端上)，以引入亲水部分或使亲水部分容易连接。例如，在一个实施方案中，在选自a5、a8、a9、a10、a12、a14、a15、a17、a18、b1、b2、b3、b4、b5、b13、b14、b17、b21、b22、b26、b27、b28、b29和b30的位置上的天然氨基酸被赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基置换(或将赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基添加至c端上)，以允许聚乙二醇链共价连接。在一个实施方案中，胰岛素前药类似物具有单个添加至b链的羧基端上的半胱氨酸残基，或者胰岛素前药类似物被至少一个半胱氨酸残基取代，其中将所述半胱氨酸残基的侧链用巯基反应性试剂进一步修饰，所述巯基反应性试剂包括例如马来酰亚氨基、乙烯砜、2-吡啶基硫代(2-pyridylthio)、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可含有羧基、酮基、羟基和醚基团以及其它亲水部分，诸如聚乙二醇单元。在一个替代实施方案中，胰岛素前药类似物具有单个添加至b链的羧基端上的赖氨酸残基，或者胰岛素前药类似物被赖氨酸置换，并且使用胺反应性试剂诸如羧酸的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)或亲水部分(例如聚乙二醇)的醛对置换的赖氨酸残基的侧链进行进一步修饰。在其中胰岛素前药类似物包含聚乙二醇链的那些实施方案中，聚乙二醇链可呈直链的形式，或者其可以是支链的。根据一个实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约20,000至约60,000道尔顿。多条聚乙二醇链可与胰岛素前药类似物连接以提供具有最佳溶解度和血液清除特征的胰岛素前药类似物。在一个实施方案中，胰岛素前药类似物与平均分子量为约20,000至约60,000道尔顿的单一聚乙二醇链连接。在另一个实施方案中，胰岛素前药类似物与两条聚乙二醇链连接，其中两条链总的平均分子量为约40,000至约80,000道尔顿。在一个实施方案中，平均分子量为20,000或60,000道尔顿的单一聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接。在另一个实施方案中，单一聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，且平均分子量为约40,000至约50,000道尔顿。在一个实施方案中，两条聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，其中第一条和第二条聚乙二醇链各自的平均分子量为20,000道尔顿。在另一个实施方案中，两条聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，其中第一条和第二条聚乙二醇链各自的平均分子量为40,000道尔顿。在另一个实施方案中，提供包含与肽共价结合的两条或更多条聚乙二醇链的胰岛素前药类似物，其中聚乙二醇链的总分子量为约40,000至约60,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化胰岛素前药类似物包含与选自b链n端和/或seqidno:9的28位或seqidno:2的29位的一个或多个氨基酸连接的聚乙二醇链，其中peg链总的分子量为约40,000至约80,000道尔顿。根据一个实施方案，提供胰岛素前药类似物，其中代表免疫球蛋白分子的fc部分的线性氨基酸序列已经与本文公开的胰岛素前药类似物的氨基酸侧链共价连接，以改善胰岛素前药类似物的溶解度、稳定性和/或药代动力学。例如，代表免疫球蛋白分子的fc部分的氨基酸序列可与b链的n端、或者a链或b链的c端、或者已末端延伸的a链或b链的c端共价结合。例如，代表免疫球蛋白分子的fc部分的氨基酸序列可与b链的c端共价结合，包括例如与对应于seqidno:9的28位或seqidno:2的29位的氨基酸连接。fc部分通常自igg中分离，但是来自任何免疫球蛋白的fc肽片段应起等同作用。在本发明的一个具体方面，通过对胰岛素前药类似物的氨基酸(包括例如肽前药元件的a或b氨基酸)侧链的胺、羟基或巯基进行直接烷基化或酰化，来对胰岛素前药类似物进行修饰以包含烷基或酰基。在一个实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基对胰岛素前药类似物进行直接酰化。在一个实施方案中，在选自以下的一个或多个位置上进行酰化：a9、a14、a15、b3、b22、b28或b29或肽前药元件的氨基酸。在这点上，酰化胰岛素前药类似物可包含seqidno:3的a链氨基酸序列和seqidno:5的b链，或者seqidno:3和/或seqidno:5的修饰氨基酸序列，其中a9、a14、a15、b22、b28或b29位上的至少一个氨基酸被修饰成为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在一些具体实施方案中，通过b28或b29位氨基酸或肽前药元件的a或b氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰岛素前药类似物的直接酰化。在又一个的实施方案中，胰岛素前药类似物包含与存在于b28或b29位上的lys的ε-氨基结合并具有1-24个碳原子的羧酸的酰基。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药类似物，其中通过对肽接头的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基进行直接酰化，来修饰肽接头的氨基酸之一以包含酰基。根据一个实施方案，单链胰岛素类似物的肽接头选自agrgsgk(seqidno:35)、aglgsgk(seqidno:36)、agmgsgk(seqidno:37)、aswgsgk(seqidno:38)、tglgsgq(seqidno:39)、tglgrgk(seqidno:40)、tglgsgk(seqidno:41)、hglysgk(seqidno:42)、kglgsgq(seqidno:43)、vglmsgk(seqidno:44)、vglssgq(seqidno:45)、vglysgk(seqidno:46)、vglssgk(seqidno:47)、vgmssgk(seqidno:48)、vwsssgk(seqidno:49)、vgsssgk(seqidno:50)、vgmssgk(seqidno:51)、tglgsgr(seqidno:52)、tglgkgq(seqidno:53)、kglssgq(seqidno:54)、vklssgq(seqidno:55)、vglksgq(seqidno:56)、tglgkgq(seqidno:57)和vglskgq(seqidno:58)，其中a链中、b链中或连接肽中的至少一个赖氨酸残基已经通过酰化被化学修饰。在一个实施方案中，酰化基团包含1-5个、10-12个或18-24个碳的链。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物的连接肽中的至少一个赖氨酸残基通过a-b-c和连接肽的侧链胺之间的酰胺键与本文公开的肽前药元件连接。根据一个实施方案，进一步修饰本文公开的胰岛素前药类似物以将其它化合物与该类似物的肽前药元件连接。在一个实施方案中，将包含二肽前药元件(a-b-c的a-b)的氨基酸侧链聚乙二醇化、酰化或烷基化。在一个实施方案中，二肽(a-b)用包含18-24个碳的链的基团酰化。在一个实施方案中，二肽(a-b)用40-80kda聚乙二醇链进行聚乙二醇化。在一个实施方案中，肽前药元件的二肽(a-b)是聚乙二醇化的，且与肽前药元件连接的胰岛素肽是酰化的，包括例如b链c端赖氨酸(b28或b29)的酰化。根据一个实施方案，亲水部分或隔离大分子(sequesteringmacromolecule)与包含以下通用结构的肽前药元件的r1侧链共价连接：，其中r1选自(c1-c4烷基)oh、(c1-c4烷基)sh和(c1-c4烷基)nh2。在一个实施方案中，r1为(c3-c4烷基)nh2。隔离大分子为本领域技术人员所知，包括葡聚糖和大分子量聚乙二醇(即大于或等于80kda)。通过将隔离大分子与二肽部分连接，前药将保持隔离，同时活性胰岛素肽根据二肽酰胺键切割的动力学缓慢释放。在一个实施方案中，肽前药元件还包含肽前药元件的n端胺共价连接的第二肽，其中第二肽仅在暴露于存在于哺乳动物血清中的酶后才从肽前药元件切割。此外，选择第二肽并将其与肽前药元件连接，其方式使得第二肽的切割离开与胰岛素肽连接的肽前药元件并保留自发地从胰岛素肽化学切割以形成二酮哌嗪的能力。在一个实施方案中，第二肽是由二肽基肽酶iv(dpp-iv)切割的肽，包括例如arg-pro、lys-pro或glu-pro的二肽。在一个实施方案中，肽前药元件包含以下结构：。本发明还包括其它缀合物，其中本发明的胰岛素前药类似物任选通过共价结合和任选通过接头与缀合物连接。可通过共价化学键；物理力(诸如静电、氢、离子、范德华力或者疏水或亲水相互作用)实现连接。可采用各种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞黏着分子配偶体；或彼此具有亲和力的其任何结合配偶体或片段。示例性缀合物包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向试剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、cdr或fc区)、诊断标记物(诸如放射性同位素、荧光团或酶标记物)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其它治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，提供包含本发明的胰岛素前药类似物和血浆蛋白的缀合物，其中所述血浆蛋白选自白蛋白、运铁蛋白和血纤蛋白原。在一个实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分是白蛋白或运铁蛋白。在一个实施方案中，接头包含长为1至约60个原子、或1-30个原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子或10-20个原子的链。在一个实施方案中，链原子全部为碳原子。在一个实施方案中，接头骨架中的链原子选自c、o、n和s。可以根据其预计的溶解度(亲水性)来选择链原子和接头，使得提供更易溶解的缀合物。在一个实施方案中，接头提供受到存在于靶组织或器官或细胞中的酶或其它催化剂或水解条件切割的官能团。在一个实施方案中，接头的长度足够长以减小位阻的可能性。如果接头为共价键或肽基键，且缀合物为多肽，则整个缀合物可为融合蛋白。这样的肽基接头可以为任何长度。示例性接头的长度为约1-50个氨基酸、5-50、3-5、5-10、5-15或10-30个氨基酸。可选地，这样的融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法生产。酰化和烷基化根据一个实施方案，对本文公开的胰岛素类似物进行修饰以包含酰基或烷基。酰化或烷基化可以延长胰岛素类似物在循环中的半衰期。酰化或烷基化可有利地延迟发作和/或延长在胰岛素受体和/或igf-1受体上的作用持续时间和/或提高对蛋白酶(诸如dpp-iv)的抗性和/或提高溶解度。可以在连接亲水部分的同一氨基酸位置上，或在不同的氨基酸位置上对胰岛素类似物进行酰化或烷基化。在一个实施方案中，本发明提供胰岛素类似物，其经修饰以包含与在对应于天然胰岛素a10、b28、b29的位置上，或者在a链或b链的c端或n端上的氨基酸共价连接的酰基或烷基。胰岛素类似物在胰岛素类似物氨基酸与酰基或烷基之间还可包含间隔物。在一个实施方案中，酰基为脂肪酸或胆汁酸或其盐，例如c4-c30脂肪酸、c8-c24脂肪酸、胆酸、c4-c30烷基、c8-c24烷基，或包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。间隔物是具有用于连接酰基或烷基的合适反应基的任何部分。在示例性实施方案中，间隔物包含氨基酸、二肽或三肽，或亲水双官能间隔物。在一个实施方案中，间隔物选自：trp、glu、asp、cys和包含nh2(ch2ch2o)n(ch2)mcooh的间隔物，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数。这样的酰化或烷基化胰岛素肽还可进一步包含亲水部分，任选为聚乙二醇。前述胰岛素类似物中的任一种可包含两个酰基或两个烷基，或其组合。可以在胰岛素类似物内的任何位置上进行酰化，条件是保持胰岛素类似物胰岛素激动剂活性。酰基可直接与胰岛素类似物的氨基酸共价连接，或通过间隔物间接与胰岛素类似物的氨基酸共价连接，其中所述间隔物位于胰岛素肽的氨基酸与酰基之间。在本发明的一个具体方面，通过对胰岛素肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接酰化，将胰岛素类似物修饰成包含酰基。在一个实施方案中，胰岛素类似物通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接酰化。在一个实施方案中，酰化位于对应于天然胰岛素的b3、b28、b29或者a链或b链的c端或n端。在这点上，酰化胰岛素类似物可包含seqidno:9和seqidno:2的氨基酸序列，或其修饰氨基酸序列，该序列包含一个或多个本文所述氨基酸修饰，其中在对应于天然胰岛素的b3、b28、b29的位置上或者在a链或b链的c端或n端上的至少一个氨基酸被修饰成包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在一些具体实施方案中，通过在对应于天然胰岛素的a10、b28、b29位上的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰岛素肽的直接酰化。根据一个实施方案，肽前药元件的氨基酸侧链之一被酰化。在一个实施方案中，待酰化的氨基酸为下式iv的氨基酸：其中n=1-4[式iv]在一些示例性实施方案中，式iv的氨基酸是其中n为4(lys)或n为3(orn)的氨基酸。在其它实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为下式v的氨基酸：其中n=1-4[式v]在一些示例性实施方案中，式v氨基酸是其中n为1的氨基酸(ser)。在其它实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸为下式vi的氨基酸：其中n=1-4[式vi]在一些示例性实施方案中，式vi氨基酸为其中n为1的氨基酸(cys)。在一些示例性实施方案中，通过对间隔物的胺、羟基或巯基的酰化来修饰胰岛素类似物以包含酰基，所述间隔物与在b3、b28或b29位(根据野生型胰岛素的氨基酸编号)上的氨基酸的侧链连接或与肽前药元件的a或b氨基酸连接。间隔物与之连接的氨基酸可以是包含允许与间隔物连接的部分的任何氨基酸。例如包含侧链nh2、-oh或-cooh的氨基酸(例如lys、orn、ser、asp或glu)是适宜的。在一个实施方案中，间隔物是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或者是包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。当通过间隔物的胺基团进行酰化时，酰化可通过氨基酸的α胺或侧链胺进行。在其中α胺被酰化的情况下，间隔物氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔物氨基酸可以是疏水氨基酸，例如gly、ala、val、leu、ile、trp、met、phe、tyr。可选地，间隔物氨基酸可以是酸性残基，例如asp和glu。在其中间隔物氨基酸的侧链胺被酰化的情况下，间隔物氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式i氨基酸(例如lys或orn)。在这种情况下，间隔物氨基酸的α胺和侧链胺两个都可能被酰化，使得胰岛素肽是二酰化的。本发明还考虑二酰化胰岛素类似物。当酰化通过间隔物的羟基进行时，所述氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以为式ii氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，该氨基酸为ser。当酰化通过间隔物的巯基进行时，所述氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可为式iii氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，该氨基酸为cys。在一个实施方案中，间隔物包含亲水双官能间隔物。在一个具体实施方案中，间隔物包含氨基聚(烷基氧基)羧酸酯。在这点上，间隔物可包含例如nh2(ch2ch2o)n(ch2)mcooh，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可购自peptidesinternational,inc.(louisville,ky)。通过胺、羟基和巯基进行肽酰化的合适方法是本领域已知的。参见例如miller,biochembiophysrescommun218:377-382(1996)；shimohigashi和stammer,intjpeptproteinres19:54-62(1982)；previero等,biochimbiophysacta263:7-13(1972)(用于通过羟基进行酰化的方法)；san和silvius,jpeptres66:169-180(2005)(用于通过巯基进行酰化的方法)；bioconjugatechem.“chemicalmodificationsofproteins:historyandapplications”第1,2-12页(1990)；hashimoto等,pharmacueticalres.“synthesisofpalmitoylderivativesofinsulinandtheirbiologicalactivity”第6卷,第2期第171-176页(1989)。酰化胰岛素肽的酰基可为任何大小，例如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的一些具体实施方案中，酰基为c4-c30脂肪酸。例如，酰基可为以下脂肪酸中的任一种：c4脂肪酸、c6脂肪酸、c8脂肪酸、c10脂肪酸、c12脂肪酸、c14脂肪酸、c16脂肪酸、c18脂肪酸、c20脂肪酸、c22脂肪酸、c24脂肪酸、c26脂肪酸、c28脂肪酸或c30脂肪酸。在一个实施方案中，酰基为c18-c20脂肪酸，例如c18脂肪酸、c19脂肪酸或c20脂肪酸。在一个替代实施方案中，酰基为胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸和胆固醇酸。在一个具体实施方案中，胰岛素类似物包含胆固醇酸，其通过烷基化脱氨基cys间隔物(即烷基化3-巯基丙酸间隔物)与胰岛素类似物的lys残基连接。烷基化脱氨基cys间隔物可以为例如包含十二乙二醇部分的脱氨基-cys间隔物。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含以下结构：。本文所述的酰化胰岛素类似物可进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(peg)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法，诸如本文所述的任何方法来完成。可选地，酰化胰岛素肽可包含间隔物，其中对间隔物进行酰化并且修饰以包含亲水部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含选自cys、lys、orn、高cys和ac-phe中的一个或多个氨基酸的间隔物。根据一个实施方案，对胰岛素类似物进行修饰以包含通过酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺键与胰岛素类似物连接的烷基，用于延长循环中的半衰期和/或延迟发作和/或延长作用持续时间和/或改善对蛋白酶(诸如dpp-iv)的抗性。烷基化胰岛素肽的烷基可以是任何大小，例如任何长度的碳链，且可以是直链或支链的。在本发明的一个实施方案中，烷基为c1-c30烷基。例如，烷基可以是以下烷基中的任一种：c1烷基、c2烷基、c3烷基、c4烷基、c6烷基、c8烷基、c10烷基、c12烷基、c14烷基、c16烷基、c18烷基、c20烷基、c22烷基、c24烷基、c26烷基、c28烷基或c30烷基。在一个实施方案中，烷基为c8-c20烷基，例如c18烷基、c19烷基或c20烷基。在一些具体实施方案中，烷基包含胆汁酸的类固醇部分，所述胆汁酸例如为胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸和胆固醇酸。根据一些实施方案，肽前药元件可以进一步修饰成包含亲水部分。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇链。根据一些实施方案，40k或更大的聚乙二醇链与肽前药元件的a或b氨基酸的侧链共价结合。在另一个实施方案中，肽前药元件的二肽(a-b)额外地或可选地被下述物质酰化或烷基化：脂肪酸或胆汁酸或其盐(例如c4-c30脂肪酸、c18-c24脂肪酸、胆酸)、c18-c30烷基、c18-c24烷基或包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。二肽前药元件的‘a’氨基酸可以包括，例如，通过它的侧链氨基与酰基或烷基共价结合的d-赖氨酸，或通过它的侧链硫氢基与peg分子共价结合的d-半胱氨酸。二肽前药元件可以与亲水部分、酰基或烷基直接结合，或通过如本文中所述的间隔物与亲水部分、酰基或烷基结合。可选地，二肽前药元件可与长效蛋白(诸如葡聚糖或大的peg分子(大于或等于80,000道尔顿))连接，所述长效蛋白用于使前药隔离(sequester)在注射部位，直到二肽的切割释放活性胰岛素肽(q)。二肽前药元件结构对切割速率的影响如前文所述，二肽前药元件a-b从生物活性肽(例如，胰岛素肽(q))切割并从而活化前药的速率，取决于二肽前药元件的氨基酸的结构(包括n-烷基化、取代基数目、长度或膨松度（bulkiness）)和立体化学。二肽前药元件a-b从生物活性肽(例如，胰岛素肽(q))切割的速率也取决于在二酮哌嗪形成过程中q的离去基团的位阻、亲核性和稳定性。一些这样的结构特征描述在下面的类别i、类别ii和类别iii中，它们形成本发明的部分内容。从这些类别中的任一个中明确地排除：在国际申请号pct/us2009/68745(于2009年12月18日提交)或它的序列表中公开的肽序列，和在国际申请号pct/us2009/68745(于2009年12月18日提交)中公开的(1)二肽前药元件、(2)a氨基酸和/或(3)b氨基酸的子类别，至它们完全落入本文所述的任一个子类别内和/或与本文所述的任一个子类别的部分内容重叠的程度，并且仅在赋予要求保护的主题新颖性所必需的范围内。根据一个实施方案，自切割的二肽元件(a-b)通过酰胺键与胰岛素肽(q)共价连接，所述酰胺键在a-b-c和q的脂族氨基之间。例如，脂族氨基可以是在a链或b链的n端氨基酸上的α氨基。可选地，脂族氨基可以是在q的侧链上的脂族氨基。在一个实施方案中，a-b-c与赖氨酸的侧链胺连接，包括例如在下述位置处的赖氨酸：b链序列fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)的b29位，或b链序列fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)的b28位。在一个实施方案中，q是包含a链和b链的胰岛素肽，其中所述a链包含序列giveqccx1sicslyqlenycx3(seqidno:3)，且所述b链包含选自以下的序列：fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt(seqidno:2)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytkpt(seqidno:9)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytdkt(seqidno:5)和fvkqhlcgshlvealylvcgergffytekt(seqidno:6)。类别i：二肽前药元件的氨基酸b的组成在一些实施方案中，前药的半衰期(例如，在生理条件下的pbs中，a-b-c从q化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周)取决于n-烷基取代基在b氨基酸上的存在和长度。例如，与具有在b氨基酸上的更长n-烷基取代基(例如，gly(n-己基))的前药相比，具有在b氨基酸上的更短n-烷基取代基(例如gly(n-甲基))的前药将经历更缓慢速率的a-b-c切割，并具有更长的半衰期。在一些实施方案中，前药的半衰期取决于二肽前药元件的b氨基酸的烷基侧链的存在与否和烷基侧链β位处的取代度。例如，与具有在β位处被单取代的n-烷基化的b氨基酸(例如，n-烷基化的亮氨酸)的前药相比，具有在β位处被二取代的n-烷基化的b氨基酸(例如，n-烷基化的异亮氨酸)的前药将经历更缓慢的a-b-c切割，并具有更长的半衰期。进一步，与具有在β位处未被取代的n-烷基化的b氨基酸(例如，n-烷基化的丙氨酸)的前药相比，具有在β位处被单取代的n-烷基化的b氨基酸(例如，n-烷基化的亮氨酸)的前药将经历更缓慢的a-b-c切割，并具有更长的半衰期。再进一步，与具有甘氨酸或n-烷基化的甘氨酸作为b氨基酸的前药相比，具有未被取代的β位的n-烷基化的b氨基酸(例如，n-烷基化的丙氨酸)的前药将经历更缓慢的a-b-c切割，并具有更长的半衰期。在一些实施方案中，前药的半衰期取决于b氨基酸的侧链的膨松度。例如，与具有在b氨基酸(例如，n-烷基化的丙氨酸)上的体积更不膨松的侧链的前药相比，具有在b氨基酸(例如，n-烷基化的苯丙氨酸)上的更膨松侧链的前药将经历更缓慢的a-b切割，并具有更长的半衰期。通过二肽所连接的药物(例如，胰岛素)的胺，可以进一步区分二肽的切割速率。更具体地，与连接n端胺相比，与芳族胺连接的相同的二肽将以更快的速率切割，而与二肽连接赖氨酸残基的侧链胺时相比，与n-端胺连接的二肽将以更快的速率切割。二肽前药元件的b氨基酸的组成可以分类为以下的子类别：ia、ib和ic。一般而言，在子类别ia中的二肽前药元件经历最快的切割，并且在子类别ic中的二肽前药元件经历最慢的切割。子类别ia：二肽前药元件的氨基酸b是n-烷基化的甘氨酸在一些实施方案中，胰岛素前药包含以下结构：a-b-c-q；其中q是胰岛素肽；其中a-b-c包含以下结构：其中r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9；r2选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基；r3为c1-c18烷基；r4和r8各自为h；r5为nhr6；r6为h或c1-c4烷基，或者r5和r2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r7选自h和oh；r9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一些实施方案中，b氨基酸选自甘氨酸(n-甲基)、甘氨酸(n-乙基)、甘氨酸(n-丙基)、甘氨酸(n-丁基)、甘氨酸(n-戊基)、甘氨酸(n-己基)、甘氨酸(n-庚基)和甘氨酸(n-辛基)。例如，b氨基酸可以是甘氨酸(n-甲基)或甘氨酸(n-己基)。在一些实施方案中，r2为氢，且r3为c1-c4烷基.子类别ib：二肽前药元件的氨基酸b是未被取代的或是在β位处被单取代的在一些实施方案中，胰岛素前药包含以下结构：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽；其中a-b-c包含以下结构：其中r1选自h、(c1-c6烷基)nh-r9、(c1-c6烷基)nh-s1-r9，r2选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基；r3为c1-c18烷基；r4选自ch3、ch2(c1-c10烷基)、ch2(c2-c10烯基)、ch2(c0-c10烷基)oh、ch2(c0-c10烷基)sh、ch2(c0-c3烷基)sch3、ch2(c0-c3烷基)conh2、ch2(c0-c3烷基)cooh、ch2(c0-c3烷基)nh2、(c1-c6烷基)nh-r9,(c1-c6烷基)nh-s1-r9、ch2(c0-c3烷基)nhc(nh2+)nh2、ch2(c0-c3烷基)(c3-c6环烷基)、ch2(c0-c3烷基)(c2-c5杂环基)、ch2(c0-c3烷基)(c6-c10芳基)r7、ch2(c1-c3烷基)(c3-c9杂芳基)和ch2(c0-c12烷基)(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子；或者r4和r3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r8是h，r5为nhr6，或者r5和r2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r6为h或c1-c4烷基；r7选自h和ohr9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，条件是当r4为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9时，r1为h。在一些实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9且r4选自ch3、ch2(c1-c4烷基)、ch2(c1-c4)烯基、ch2(c0-c4烷基)oh、ch2(c0-c4烷基)sh、ch2(c0-c3烷基)sch3、ch2(c0-c3烷基)conh2、ch2(c0-c3烷基)cooh、ch2(c0-c4烷基)nh2和ch2(c0-c3烷基)nhc(nh2+)nh2。在这些实施方案中的b氨基酸的非限制性实例包括丙氨酸(n-c1-c10烷基)、亮氨酸(n-c1-c10烷基)、甲硫氨酸(n-c1-c10烷基)、天冬酰胺(n-c1-c10烷基)、谷氨酸(n-c1-c10烷基)、天冬氨酸(n-c1-c10烷基)、谷氨酰胺(n-c1-c10烷基)、组氨酸(n-c1-c10烷基)、赖氨酸(n-c1-c10烷基)、精氨酸(n-c1-c10烷基)、丝氨酸(n-c1-c10烷基)和半胱氨酸(n-c1-c10烷基)。在一些实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-r9,或(c1-c6烷基)nh-s1-r9且b氨基酸选自丙氨酸(n-c1-c6烷基)、亮氨酸(n-c1-c6烷基)、甲硫氨酸(n-c1-c6烷基)、天冬酰胺(n-c1-c6烷基)、谷氨酸(n-c1-c6烷基)、天冬氨酸(n-c1-c6烷基)、谷氨酰胺(n-c1-c6烷基)、组氨酸(n-c1-c6烷基)、赖氨酸(n-c1-c6烷基)、精氨酸(n-c1-c6烷基)、丝氨酸(n-c1-c6烷基)和半胱氨酸(n-c1-c6烷基)。例如，b氨基酸可以包括丙氨酸(n-甲基)、亮氨酸(n-甲基)、甲硫氨酸(n-甲基)、天冬酰胺(n-甲基)、谷氨酸(n-甲基)、天冬氨酸(n-甲基)、谷氨酰胺(n-甲基)、组氨酸(n-甲基)、赖氨酸(n-甲基)、精氨酸(n-甲基)、丝氨酸(n-甲基)和半胱氨酸(n-甲基)。在一些实施方案中，r1为(c1-c6烷基)nh-r9,或(c1-c6烷基)nh-s1-r9且r4选自ch2(c0-c3烷基)(c3-c6环烷基)、ch2(c0-c3烷基)(c2-c5杂环基)、ch2(c0-c3烷基)(c6-c10芳基)r7、ch2(c1-c3烷基)(c3-c9杂芳基)和ch2(c0-c12烷基)(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，且其中r7选自h和oh。在这些实施方案中的b氨基酸的非限制性实例包括苯丙氨酸(n-c1-c10烷基)、酪氨酸(n-c1-c10烷基)和色氨酸(n-c1-c10烷基)。在一些实施方案中，b氨基酸选自苯丙氨酸(n-c1-c6烷基)、酪氨酸(n-c1-c6烷基)和色氨酸(n-c1-c6烷基)。例如，b氨基酸可以包括苯丙氨酸(n-甲基)、酪氨酸(n-甲基)和色氨酸(n-甲基)。在一些实施方案中，b氨基酸为脯氨酸。在一些实施方案中，从子类别ib中排除脯氨酸。子类别ic：二肽前药元件的氨基酸b在β位处被二取代在一些实施方案中，胰岛素前药包含以下结构：a-b-c-q；其中q为胰岛素肽；其中a-b-c包含以下结构：其中r1为(c1-c6烷基)nh-r9或(c1-c6烷基)nh-s1-r9;r2选自h、c1-c18烷基、c2-c18烯基、(c1-c18烷基)oh、(c1-c18烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基；或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基；r3为c1-c18烷基；r4独立地选自ch(c1-c8烷基)2、ch(c2-c8烯基)2、ch(c1-c8烷基)(oh)、ch(c1-c8烷基)((c1-c8烷基)sh)、ch(c1-c3烷基)((c1-c8烷基)(nh2)；r8是h或c1-c18烷基；r5为nhr6，或者r5和r2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；r6为h或c1-c4烷基；且，r7选自h和ohr9选自c16-c30酰基和c16-c30烷基；r11和r13各自为h；r10和r12独立地选自(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2和ch2(c3-n2杂环基)；且s1是键或由一个或两个带电氨基酸组成的间隔物，所述带电氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、磺基丙氨酸、高磺基丙氨酸、高谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。在一些实施方案中，r4是ch(c1-c8烷基)2或ch(c1-c8烷基)oh。b氨基酸的非限制性实例包括异亮氨酸(n-c1-c10烷基)、缬氨酸(n-c1-c10烷基)和苏氨酸(n-c1-c10烷基)。在一些实施方案中，b氨基酸选自异亮氨酸(n-c1-c6烷基)、缬氨酸(n-c1-c6烷基)和苏氨酸(n-c1-c6烷基)。例如，b氨基酸可以包括异亮氨酸(n-甲基)、缬氨酸(n-甲基)和苏氨酸(n-甲基)。类别ii：二肽前药元件的氨基酸a的组成在一些实施方案中，前药的半衰期取决于在a氨基酸的α位处的取代基的数目。例如，与包含作为α,α-二取代的氨基酸(例如，aib)的a氨基酸的前药相比，包含作为α-单取代的氨基酸(例如，ala)的a氨基酸的前药将经历更缓慢的切割，并具有更长的半衰期。在一些实施方案中，前药的半衰期取决于在a氨基酸的α氨基上的烷基化程度。通常，烷基化程度越大，切割速率越慢，并且前药的半衰期越长。例如，与ala相比，具有n-烷基化的ala的二肽前药元件将以更慢的速率切割，并具有更长的半衰期。二肽前药元件的a氨基酸的组成可以分类为以下子类别iia和iib。通常，子类别iia中的二肽前药元件比在子类别iib中的二肽前药元件更快地切割。子类别iia：二肽前药元件的氨基酸a在α位处被二取代在一些实施方案中，二肽前药元件的a氨基酸在α位处被二取代。在这些实施方案中，在子类别ia、ib和ic中描述的结构的r1和r2独立地选自c1-c10烷基、c2-c10烯基、(c1-c10烷基)oh、(c1-c10烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基，且其中r7选自h和oh。例如，a氨基酸可以包括氨基异丁酸(aib)。子类别iib：二肽前药元件的氨基酸a是未被取代的或是在α位处被单取代的在一些实施方案中，二肽前药元件的a氨基酸是未被取代的或是在α位处被单取代的。在这些实施方案中，在子类别ia、ib和ic中描述的结构的r1为h，且在子类别ia、ib和ic中描述的结构的r2选自h、c1-c10烷基、c2-c10烯基、(c1-c10烷基)oh、(c1-c10烷基)sh、(c2-c3烷基)sch3、(c1-c4烷基)conh2、(c1-c4烷基)cooh、(c1-c4烷基)nh2、(c1-c4烷基)nhc(nh2+)nh2、(c0-c4烷基)(c3-c6环烷基)、(c0-c4烷基)(c2-c5杂环基)、(c0-c4烷基)(c6-c10芳基)r7、(c1-c4烷基)(c3-c9杂芳基)和c1-c12烷基(w1)c1-c12烷基，其中r7选自h和oh，其中w1为选自n、s和o的杂原子，或者r1和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基，或者r2和r5与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环。在一些实施方案中，二肽前药元件的a氨基酸具有‘d’立体化学。在这些实施方案中的a氨基酸的非限制性实例包括赖氨酸、半胱氨酸和丙氨酸。例如，d-赖氨酸、d-半胱氨酸和d-丙氨酸。在一些实施方案中，d-立体化学可以通过减慢前药肽的蛋白水解性降解而增加半衰期。在一些实施方案中，a氨基酸被具有1-4个碳原子的基团n-烷基化，诸如ala(n-c1-c4烷基)、lys(n-c1-c4烷基)和cys(n-c1-c4烷基)。例如，a氨基酸可以是ala(n-甲基)、lys(n-甲基)和cys(n-甲基)。a氨基酸的n-烷基化会降低二肽前药元件从q切割的速率，并提供更长的半衰期。类别iii：二肽前药元件(a-b)与肽药物(q)的缀合位点在一些实施方案中，前药的半衰期取决于在二酮哌嗪形成过程中在q上的离去基团的位阻、亲核性和稳定性。离去基团的位阻越小，离去基团的亲核性越小，或切割以后离去基团的稳定性越高，前药的半衰期越短。在q上的离去基团的类型可以由a-b-c和q的氨基之间的连接的类型(如在下面的子类别iiia和iiib中所述)决定。一般而言，与在子类别iiia中的二肽前药元件相比，在子类别iiib中的二肽前药元件从q更快地切割，且具有更短的半衰期。子类别iiia：a-b与q的脂族氨基连接在一些实施方案中，a-b-c通过在a-b-c和q的脂族氨基之间的酰胺键与q连接，以得到这样的前药：在生理条件下的pbs中，a-b从q化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周，如前文所述。在一些实施方案中，a-b-c通过在a-b-c和q的n端氨基酸的α氨基之间的酰胺键与q连接。例如，具有来自子类别ia、ib和ic中任一个的b氨基酸和来自子类别iia和iib中任一个的a氨基酸的二肽前药元件可以与q的n端氨基酸、更具体地与胰岛素a或b链的n端氨基连接，以得到这样的前药：在生理条件下的pbs中，a-b从q化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。在一些实施方案中，a-b-c通过在a-b和q的氨基酸的侧链的脂族氨基之间的酰胺键与q连接。例如，具有来自子类别ia、ib和ic中任一个的b氨基酸和来自子类别iia和iib中任一个的a氨基酸的二肽前药元件可以与q的氨基酸的侧链的脂族氨基连接，以得到这样的前药：在生理条件下的pbs中，a-b从q化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。在一些实施方案中，当a-b-c通过在a-b-c和q的脂族氨基之间的酰胺键与q连接时，要么a应当是α,α-二取代的氨基酸(子类别iia)，要么b应当是n-烷基化的(子类别ia、ib或ic中的任一个)，要么前二者都成立。例如，当a是α-单取代的氨基酸(例如，ala)、b是未n-烷基化的、并且a-b通过q的脂族氨基与q连接时，那么a-b-c将不会显著切割。在其它实施方案中，当a-b-c通过在a-b-c和q的脂族氨基之间的酰胺键与q连接、a是在α位未被取代的氨基酸(例如甘氨酸)、并且b是来自子类别ia的氨基酸(n-烷基化的甘氨酸)时，b氨基酸的n-烷基取代基具有至少5个碳原子的长度(例如，n-c5-c8烷基)。在其它实施方案中，当a-b-c通过在a-b-c和q的脂族氨基之间的酰胺键与q连接、并且a氨基酸是未被取代的或是在α位被单取代的(子类别iib)时，b氨基酸不是脯氨酸。子类别iiib：a-b与q的芳族氨基连接在一些实施方案中，a-b-c通过酰胺键与q连接，所述酰胺键在a-b-c和q的氨基酸的侧链的芳族氨基之间，以得到这样的前药：在生理条件下的pbs中，a-b从q化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周，如前文所述。例如，具有来自子类别ia、ib和ic中任一个的b氨基酸和来自子类别iia和iib中任一个的a氨基酸的二肽前药元件可以与q的氨基酸的侧链的芳族氨基连接，以得到这样的前药：在生理条件下的pbs中，a-b从q化学切割的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。由类别i定义的任意b氨基酸可以与由类别ii定义的任意a氨基酸相组合，以形成二肽前药元件。该二肽前药元件可以与在类别iii中描述的任意位置相连。通过选择下述参数，可以调节前药的半衰期：(i)在a氨基酸的α位上的取代基的数目；(ii)a氨基酸和b氨基酸的n-烷基化程度；(iii)在b氨基酸的β位上的取代基的数目；(iv)b氨基酸的侧链的体积；和，(v)在二酮哌嗪形成过程中在q上的离去基团的位阻、亲核性和稳定性。二肽前药元件a-b的修饰可以进一步修饰上述的二肽前药元件以包含如前文所述的亲水部分、酰基或烷基。在一些实施方案中，二肽前药元件包括赖氨酸，所述赖氨酸通过它的侧链氨基与酰基或烷基缀合。在一些实施方案中，二肽前药元件包括半胱氨酸，所述半胱氨酸通过侧链硫氢基与亲水部分(例如，40kdpeg)缀合。亲水部分、酰基或烷基可以与二肽前药元件直接缀合，或通过间隔物缀合。在一些示例性实施方案中，亲水基团、烷基和/或酰基与二肽前药元件的a氨基酸缀合。在一些实施方案中，将下述二肽前药元件聚乙二醇化：dcys-gly(n-己基)dcys-gly(n-甲基)和dcys-phe(n-甲基)。在一些实施方案中，下述二肽前药元件包括酰基：dlys-gly(n-己基)、dlys-gly(n-甲基)和dlys-phe(n-甲基)。在一些实施方案中，下述二肽前药元件包括烷基：dlys-gly(n-己基)、dlys-gly(n-甲基)和dlys-phe(n-甲基)。示例性实施方案本发明的二肽前药元件可以包括来自类别i的任意b氨基酸与来自类别ii的任意a氨基酸的组合。适用于二肽前药元件的a氨基酸和b氨基酸的氨基酸的非限制性实例列出在下表中：氨基酸编号氨基酸‘a’氨基酸‘b’1aibgly(n-c1-c8烷基)2glyala(n-c1-c8烷基)3alaleu(n-c1-c8烷基)4leumet(n-c1-c8烷基)5metasn(n-c1-c8烷基)6asnglu(n-c1-c8烷基)7gluasp(n-c1-c8烷基)8aspgln(n-c1-c8烷基)9glnhis(n-c1-c8烷基)10hislys(n-c1-c8烷基)11lysarg(n-c1-c8烷基)12argser(n-c1-c8烷基)13sercys(n-c1-c8烷基)14cyspro15prophe(n-c1-c8烷基)16phetyr(n-c1-c8烷基)17tyrtrp(n-c1-c8烷基)18trpile(n-c1-c8烷基)19ileval(n-c1-c8烷基)20valthr(n-c1-c8烷基)21thrd-ala(n-c1-c8烷基)22d-alad-leu(n-c1-c8烷基)23d-leud-met(n-c1-c8烷基)24d-metd-asn(n-c1-c8烷基)25d-asnd-glu(n-c1-c8烷基)26d-glud-asp(n-c1-c8烷基)27d-aspd-gln(n-c1-c8烷基)28d-glnd-his(n-c1-c8烷基)29d-hisd-lys(n-c1-c8烷基)30d-lysd-arg(n-c1-c8烷基)31d-argd-ser(n-c1-c8烷基)32d-serd-cys(n-c1-c8烷基)33d-cysd-pro34d-prod-phe(n-c1-c8烷基)35d-phed-tyr(n-c1-c8烷基)36d-tyrd-trp(n-c1-c8烷基)37d-trpd-ile(n-c1-c8烷基)38d-iled-val(n-c1-c8烷基)39d-vald-thr(n-c1-c8烷基)40d-thrgly(n-甲基)41gly(n-甲基)ala(n-甲基)42ala(n-甲基)leu(n-甲基)43leu(n-甲基)met(n-甲基)44met(n-甲基)asn(n-甲基)45asn(n-甲基)glu(n-甲基)46glu(n-甲基)asp(n-甲基)47asp(n-甲基)gln(n-甲基)48gln(n-甲基)his(n-甲基)49his(n-甲基)lys(n-甲基)50lys(n-甲基)arg(n-甲基)51arg(n-甲基)ser(n-甲基)52ser(n-甲基)cys(n-甲基)53cys(n-甲基)phe(n-甲基)54phe(n-甲基)tyr(n-甲基)55tyr(n-甲基)trp(n-甲基)56trp(n-甲基)ile(n-甲基)57ile(n-甲基)val(n-甲基)58val(n-甲基)thr(n-甲基)59thr(n-甲基)d-ala(n-甲基)60d-ala(n-甲基)d-leu(n-甲基)61d-leu(n-甲基)d-met(n-甲基)62d-met(n-甲基)d-asn(n-甲基)63d-asn(n-甲基)d-glu(n-甲基)64d-glu(n-甲基)d-asp(n-甲基)65d-asp(n-甲基)d-gln(n-甲基)66d-gln(n-甲基)d-his(n-甲基)67d-his(n-甲基)d-lys(n-甲基)68d-lys(n-甲基)d-arg(n-甲基)69d-arg(n-甲基)d-ser(n-甲基)70d-ser(n-甲基)d-cys(n-甲基)71d-cys(n-甲基)d-phe(n-甲基)72d-phe(n-甲基)d-tyr(n-甲基)73d-tyr(n-甲基)d-trp(n-甲基)74d-trp(n-甲基)d-ile(n-甲基)75d-ile(n-甲基)d-val(n-甲基)76d-val(n-甲基)d-thr(n-甲基)77d-thr(n-甲基)gly(n-己基)78ala(n-己基)79leu(n-己基)80met(n-己基)81asn(n-己基)82glu(n-己基)83asp(n-己基)84gln(n-己基)85his(n-己基)86lys(n-己基)87arg(n-己基)88ser(n-己基)89cys(n-己基)90phe(n-己基)91tyr(n-己基)92trp(n-己基)93ile(n-己基)94val(n-己基)95thr(n-己基)96d-ala(n-己基)97d-leu(n-己基)98d-met(n-己基)99d-asn(n-己基)100d-glu(n-己基)101d-asp(n-己基)102d-gln(n-己基)103d-his(n-己基)104d-lys(n-己基)105d-arg(n-己基)106d-ser(n-己基)107d-cys(n-己基)108d-phe(n-己基)109d-tyr(n-己基)110d-trp(n-己基)111d-ile(n-己基)112d-val(n-己基)113d-thr(n-己基)子类别ia：二肽前药元件的氨基酸b是n-烷基化的甘氨酸在一些实施方案中，二肽前药元件的b氨基酸是n-烷基化的甘氨酸。具有n-烷基化的甘氨酸作为b氨基酸的二肽前药元件的非限制性实例显示在下表中：二肽前药元件编号氨基酸‘a’氨基酸‘b’1aibgly(n-c1-c8烷基)2d-alagly(n-c1-c8烷基)3d-lysgly(n-c1-c8烷基)4d-cysgly(n-c1-c8烷基)5aibgly(n-甲基)6d-alagly(n-甲基)7d-lysgly(n-甲基)8d-cysgly(n-甲基)9aibgly(n-己基)10d-alagly(n-己基)11d-lysgly(n-己基)12d-cysgly(n-己基)子类别ib：二肽前药元件的氨基酸b是未被取代的或是在β位处被单取代的在一些实施方案中，二肽前药元件的b氨基酸是未被取代的或是在β位处被单取代的，且具有相对不膨松的侧链。具有未被取代的或在β位处被单取代的且具有相对不膨松的侧链的b氨基酸的二肽前药元件的非限制性实例显示在下表中：二肽前药元件编号氨基酸‘a’氨基酸‘b’13aibala(n-c1-c8烷基)14d-alaala(n-c1-c8烷基)15d-lysala(n-c1-c8烷基)16d-cysala(n-c1-c8烷基)17aibleu(n-c1-c8烷基)18d-alaleu(n-c1-c8烷基)19d-lysleu(n-c1-c8烷基)20d-cysleu(n-c1-c8烷基)21aibmet(n-c1-c8烷基)22d-alamet(n-c1-c8烷基)23d-lysmet(n-c1-c8烷基)24d-cysmet(n-c1-c8烷基)25aibasn(n-c1-c8烷基)26d-alaasn(n-c1-c8烷基)27d-lysasn(n-c1-c8烷基)28d-cysasn(n-c1-c8烷基)29aibglu(n-c1-c8烷基)30d-alaglu(n-c1-c8烷基)31d-lysglu(n-c1-c8烷基)32d-cysglu(n-c1-c8烷基)33aibasp(n-c1-c8烷基)34d-alaasp(n-c1-c8烷基)35d-lysasp(n-c1-c8烷基)36d-cysasp(n-c1-c8烷基)37aibgln(n-c1-c8烷基)38d-alagln(n-c1-c8烷基)39d-lysgln(n-c1-c8烷基)40d-cysgln(n-c1-c8烷基)41aibhis(n-c1-c8烷基)42d-alahis(n-c1-c8烷基)43d-lyshis(n-c1-c8烷基)44d-cyshis(n-c1-c8烷基)45aiblys(n-c1-c8烷基)46d-alalys(n-c1-c8烷基)47d-lyslys(n-c1-c8烷基)48d-cyslys(n-c1-c8烷基)49aibarg(n-c1-c8烷基)50d-alaarg(n-c1-c8烷基)51d-lysarg(n-c1-c8烷基)52d-cysarg(n-c1-c8烷基)53aibser(n-c1-c8烷基)54d-alaser(n-c1-c8烷基)55d-lysser(n-c1-c8烷基)56d-cysser(n-c1-c8烷基)57aibcys(n-c1-c8烷基)58d-alacys(n-c1-c8烷基)59d-lyscys(n-c1-c8烷基)60d-cyscys(n-c1-c8烷基)61aibpro62d-alapro63d-lyspro64d-cyspro65aibala(n-甲基)66d-alaala(n-甲基)67d-lysala(n-甲基)68d-cysala(n-甲基)69aibleu(n-甲基)70d-alaleu(n-甲基)71d-lysleu(n-甲基)72d-cysleu(n-甲基)73aibmet(n-甲基)74d-alamet(n-甲基)75d-lysmet(n-甲基)76d-cysmet(n-甲基)77aibasn(n-甲基)78d-alaasn(n-甲基)79d-lysasn(n-甲基)80d-cysasn(n-甲基)81aibglu(n-甲基)82d-alaglu(n-甲基)83d-lysglu(n-甲基)84d-cysglu(n-甲基)85aibasp(n-甲基)86d-alaasp(n-甲基)87d-lysasp(n-甲基)88d-cysasp(n-甲基)89aibgln(n-甲基)90d-alagln(n-甲基)91d-lysgln(n-甲基)92d-cysgln(n-甲基)93aibhis(n-甲基)94d-alahis(n-甲基)95d-lyshis(n-甲基)96d-cyshis(n-甲基)97aiblys(n-甲基)98d-alalys(n-甲基)99d-lyslys(n-甲基)100d-cyslys(n-甲基)101aibarg(n-甲基)102d-alaarg(n-甲基)103d-lysarg(n-甲基)104d-cysarg(n-甲基)105aibser(n-甲基)106d-alaser(n-甲基)107d-lysser(n-甲基)108d-cysser(n-甲基)109aibcys(n-甲基)110d-alacys(n-甲基)111d-lyscys(n-甲基)112d-cyscys(n-甲基)113aibala(n-己基)114d-alaala(n-己基)115d-lysala(n-己基)116d-cysala(n-己基)117aibleu(n-己基)118d-alaleu(n-己基)119d-lysleu(n-己基)120d-cysleu(n-己基)121aibmet(n-己基)122d-alamet(n-己基)123d-lysmet(n-己基)124d-cysmet(n-己基)125aibasn(n-己基)126d-alaasn(n-己基)127d-lysasn(n-己基)128d-cysasn(n-己基)129aibglu(n-己基)130d-alaglu(n-己基)131d-lysglu(n-己基)132d-cysglu(n-己基)133aibasp(n-己基)134d-alaasp(n-己基)135d-lysasp(n-己基)136d-cysasp(n-己基)137aibgln(n-己基)138d-alagln(n-己基)139d-lysgln(n-己基)140d-cysgln(n-己基)141aibhis(n-己基)142d-alahis(n-己基)143d-lyshis(n-己基)144d-cyshis(n-己基)145aiblys(n-己基)146d-alalys(n-己基)147d-lyslys(n-己基)148d-cyslys(n-己基)149aibarg(n-己基)150d-alaarg(n-己基)151d-lysarg(n-己基)152d-cysarg(n-己基)153aibser(n-己基)154d-alaser(n-己基)155d-lysser(n-己基)156d-cysser(n-己基)157aibcys(n-己基)158d-alacys(n-己基)159d-lyscys(n-己基)160d-cyscys(n-己基)在一些实施方案中，二肽前药元件的b氨基酸在β位处被单取代，且具有想对膨松的侧链，如下表所示：二肽前药元件编号氨基酸‘a’氨基酸‘b’161aibphe(n-c1-c8烷基)162d-alaphe(n-c1-c8烷基)163d-lysphe(n-c1-c8烷基)164d-cysphe(n-c1-c8烷基)165aibtyr(n-c1-c8烷基)166d-alatyr(n-c1-c8烷基)167d-lystyr(n-c1-c8烷基)168d-cystyr(n-c1-c8烷基)169aibtrp(n-c1-c8烷基)170d-alatrp(n-c1-c8烷基)171d-lystrp(n-c1-c8烷基)172d-cystrp(n-c1-c8烷基)173aibphe(n-甲基)174d-alaphe(n-甲基)175d-lysphe(n-甲基)176d-cysphe(n-甲基)177aibtyr(n-甲基)178d-alatyr(n-甲基)179d-lystyr(n-甲基)180d-cystyr(n-甲基)181aibtrp(n-甲基)182d-alatrp(n-甲基)183d-lystrp(n-甲基)184d-cystrp(n-甲基)185aibphe(n-己基)186d-alaphe(n-己基)187d-lysphe(n-己基)188d-cysphe(n-己基)189aibtyr(n-己基)190d-alatyr(n-己基)191d-lystyr(n-己基)192d-cystyr(n-己基)193aibtrp(n-己基)194d-alatrp(n-己基)195d-lystrp(n-己基)196d-cystrp(n-己基)子类别ic：二肽前药元件的氨基酸b在β位处被二取代在一些实施方案中，二肽前药元件的b氨基酸在β位处被二取代。具有在β位处被二取代的b氨基酸的二肽前药元件的非限制性实例显示在下表中。二肽前药元件编号氨基酸‘a’氨基酸‘b’197aibile(n-c1-c8烷基)198d-alaile(n-c1-c8烷基)199d-lysile(n-c1-c8烷基)200d-cysile(n-c1-c8烷基))201aibval(n-c1-c8烷基)202d-alaval(n-c1-c8烷基)203d-lysval(n-c1-c8烷基)204d-cysval(n-c1-c8烷基)205aibthr(n-c1-c8烷基)206d-alathr(n-c1-c8烷基)207d-lysthr(n-c1-c8烷基)208d-cysthr(n-c1-c8烷基)209aibile(n-甲基)210d-alaile(n-甲基)211d-lysile(n-甲基)212d-cysile(n-甲基))213aibval(n-甲基)214d-alaval(n-甲基)215d-lysval(n-甲基)216d-cysval(n-甲基)217aibthr(n-甲基)218d-alathr(n-甲基)219d-lysthr(n-甲基)220d-cysthr(n-甲基)221aibile(n-己基)222d-alaile(n-己基)223d-lysile(n-己基)224d-cysile(n-己基)225aibval(n-己基)226d-alaval(n-己基)227d-lysval(n-己基)228d-cysval(n-己基)229aibthr(n-己基)230d-alathr(n-己基)231d-lysthr(n-己基)232d-cysthr(n-己基))在一些示例性实施方案中，aib-gly(n-己基)、dlys-gly(n-己基)、dcys-gly(n-己基)、dala-gly(n-己基)、aib-gly(n-甲基)、dlys-gly(n-甲基)、dcys-gly(n-甲基)、dala-gly(n-己基)、aib-phe(n-甲基)、dlys-phe(n-甲基)、dcys-phe(n-甲基)或dala-phe(n-甲基)与胰岛素肽的n端α氨基通过结构a-b-c缀合。根据一个实施方案，二肽元件包含在a-b二肽的b处的3种氨基酸之一：gly(n-己基)、gly(n-甲基)或phe(n-甲基)。选自这3组二肽之一的二肽具有下述相对切割速率：其中gly(n-己基)>gly(n-甲基)>phe(n-甲基)，所有其它因素相同。在一个实施方案中，cys或lys提供在第1个位置(即，a氨基酸)，以提供用于酰化或聚乙二醇化的位置。在不需要酰化或聚乙二醇化的一个实施方案中，将ala用作a氨基酸。在一个实施方案中，与天然氨基酸诸如ala、cys和lys相比，在第1个位置(即，a氨基酸)的aib会增加切割速率。示例性二肽包括：dala-phe(n-甲基)dcys-phe(n-甲基)dlys-phe(n-甲基)aib-phe(n-甲基)dala-gly(n-甲基)dcys-gly(n-甲基)dlys-gly(n-甲基)aib-gly(n-甲基)dala-gly(n-己基)dcys-gly(n-己基)dlys-gly(n-己基)aib-gly(n-己基)。根据一个实施方案，提供包含本文公开的任何新型胰岛素前药类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述胰岛素前药类似物的纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这样的组合物可含有本文公开的a19胰岛素类似物，其浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌的水溶液剂，任选装入各种包装容器中保存。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉末。药物组合物还可作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将所述组合物施用于患者的一次性装置。容器或试剂盒可标上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。在一个实施方案中，提供包含第一和第二胰岛素前药类似物的混合物的组合物，其中第一和第二胰岛素前药类似物根据前药元件结构而彼此不同。更具体地，第一胰岛素前药类似物可包含半衰期与第二胰岛素前药类似物的二肽前药元件的半衰期显著不同的二肽前药元件。因此，选择二肽元件上取代基的不同组合将可供制备以下组合物，其包含在所需时间段和特定的时间间隔内以受控方式活化的胰岛素前药类似物的混合物。例如，可将组合物配制成餐时释放活性胰岛素，随后在夜间根据活化时间释放适当剂量的活化胰岛素。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文公开的胰岛素前药类似物和天然胰岛素或胰岛素的已知生物活性衍生物的混合物。所公开的胰岛素前药类似物被认为适合于之前已对胰岛素肽所述的任何用途。因此，本文所述的胰岛素前药类似物可用于治疗高血糖症，或治疗由高血糖水平所致的其它代谢病。因此，本发明包括包含本发明的胰岛素前药类似物和药学上可接受的载体的药物组合物，其用于治疗患有高血糖水平的患者。根据一个实施方案，待使用本文公开的胰岛素前药类似物治疗的患者为家养动物，而在另一个实施方案中，待治疗的患者为人。根据本发明治疗高血糖症的一种方法包括采用任何标准施用途径将本发明公开的胰岛素前药类似物施用于患者的步骤，所述施用途径包括胃肠外，诸如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、透皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一个实施方案中，皮下或肌内施用组合物。在一个实施方案中，胃肠外施用组合物，且将胰岛素前药类似物组合物预先包装在注射器中。本文公开的胰岛素前药类似物可单独或与其它抗糖尿病药组合施用。本领域已知的或正在研究中的抗糖尿病药包括天然胰岛素；天然胰高血糖素及其功能衍生物；磺酰脲类，诸如甲苯磺丁脲(orinase®)、醋酸己脲(dymelor™)、妥拉磺脲(tolinase™)、氯磺丙脲(diabinese®)、格列吡嗪(glucotrol®)、格列本脲(diabeta®、micronase®、glynase®)、格列美脲(amaryl®)或格列齐特(diamicron®)；氯茴苯酸类，诸如瑞格列奈(repaglinide)(prandin®)或那格列奈(nateglinide)(starlix®)；双胍类，诸如二甲双胍(glucophage®)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类，诸如罗格列酮(avandia®)、吡格列酮(pioglitazone)(actos®)或曲格列酮(rezulin™)或其它pparγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡糖苷酶抑制剂，诸如米格列醇(glyset®)、阿卡波糖(precose/glucobay)；艾塞那肽(byetta®)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂，诸如维格列汀或西他列汀；sglt(钠依赖性葡萄糖载体1)抑制剂；或fbp酶(果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。可采用标准的药学上可接受的载体和本领域技术人员已知的施用途径，配制包含本文公开的胰岛素前药类似物的药物组合物并将其施用于患者。因此，本发明还包括包含一种或多种本文公开的胰岛素前药类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含在磷酸盐缓冲系统中的ph为约4.0至约7.0、浓度为1mg/ml的胰岛素前药类似物。药物组合物可包含作为唯一的药学活性组分的胰岛素前药类似物，或者胰岛素前药类似物可与一种或多种其它活性剂组合。根据一个实施方案，提供包含本文公开的胰岛素前药类似物之一和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述胰岛素前药类似物优选为无菌的，且优选纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这样的组合物可含有胰岛素前药类似物，其中所得活性肽存在的浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌的水溶液剂，任选保存在各种容器内。根据一个实施方案，可使用本发明的化合物制备可即用于注射的预制溶液。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉末。药物组合物还可作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将组合物施用于患者的一次性装置。容器或试剂盒可标上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。本文描述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒和其它类似实施方案均考虑胰岛素前药类似物包括其所有的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供具有将胰岛素前药类似物组合物施用于患者的装置的试剂盒。试剂盒还可包括各种容器，例如小瓶、管、瓶等。优选试剂盒还将包括使用说明书。根据一个实施方案，试剂盒的装置为气雾剂分配装置，其中组合物预包装在气雾剂装置内。在另一个实施方案中，试剂盒包含注射器和针，而在一个实施方案中，胰岛素类似物组合物预包装在注射器中。可通过标准合成方法、重组dna技术或制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备本发明的化合物。虽然通过标准重组dna技术无法表达某些非天然氨基酸，但其制备技术是本领域已知的。除标准肽化学反应以外，适用时可通过标准有机化学反应合成包含非肽部分的本发明化合物。实施例1胰岛素a链和b链的合成采用boc化学法，在4-甲基二苯甲基胺(mbha)树脂或4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基(pam)树脂上合成胰岛素a链和b链。使用95:5hf/对甲酚于0℃达1小时，使肽从树脂上切割。在除去hf且乙醚沉淀后，将肽溶解于50%乙酸水溶液，并冻干。可选地，用fmoc化学法合成肽。使用三氟乙酸(tfa)/三异丙基甲硅烷(tis)/h2o(95:2.5:2.5)于室温达2小时，使肽从树脂切割。通过加入过量的乙醚使肽沉淀，并将沉淀溶解于酸性缓冲水溶液。通过rp-hplc监测肽的质量，并通过质谱法(esi或maldi)证实。合成在氨基酸7上具有单个游离半胱氨酸且所有其它半胱氨酸作为乙酰氨基甲基a-(sh)7(acm)6,11,20保护的胰岛素a链。合成在7位上具有一个游离半胱氨酸且其它半胱氨酸作为乙酰氨基甲基b-(sh)7(acm)19保护的胰岛素b链。粗制肽通过常规rp-hplc纯化。如先前us-2011-0257076(其公开内容通过引用并入本文)中所公开，将合成的a链和b链通过其天然二硫键连接来彼此连接。在室温下，通过溶解于dmf或dmso，并以1:1摩尔比率与2,2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(npys)反应，使相应的b链活化成cys7-npys衍生物。活化用rp-hplc监测，且产物用esi-ms证实。通过以1:1摩尔比率，使a-(sh)7(acm)6,11,20和b-(npys)7(acm)19分别溶解至总的肽浓度为10mg/ml，来形成第一个b7-a7二硫键。当链结合反应完成时，将混合物稀释至50%乙酸水溶液的浓度。通过加入碘，同时形成最后的两个二硫键。将40倍摩尔过量的碘加入溶液中，并将混合物在室温下再搅拌1小时。加入抗坏血酸水溶液终止反应。混合物用rp-hplc纯化，最终的化合物用maldi-ms证实。如表1数据所示，对于胰岛素受体结合，根据该方法制备的合成胰岛素与纯化的胰岛素不相上下。还可以采用允许将非编码氨基酸掺入蛋白中的系统，在体内合成包含修饰氨基酸(诸如a19位上的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽，所述系统包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970教导的系统。表1：合成胰岛素相对于天然胰岛素的活性实施例2通过还原性烷基化的胺基(n端和赖氨酸)的聚乙二醇化a.合成以1:2:30摩尔比率，将胰岛素(或胰岛素类似物)、mpeg20k-醛(aldyhyde)和nabh3cn溶解于乙酸缓冲液(ph4.1-4.4)。反应溶液由0.1nnacl、0.2n乙酸和0.1nna2co3组成。胰岛素肽浓度为约0.5mg/ml。反应在室温下经6小时进行。反应程度用rp-hplc监测，反应的收率约为50%。b.纯化将反应混合物用0.1%tfa稀释2-5倍，并上样至制备型rp-hplc柱中。hplc条件：c4柱；流速10ml/分钟；a缓冲液：含10%acn和0.1%tfa的水溶液；b缓冲液：含0.1%tfa的acn溶液；线性梯度：b%0-40%(0-80分钟)；将peg-胰岛素或类似物在约35%缓冲液b中洗脱。所需化合物用maldi-tof证实，随后通过亚硫酸盐解(sulftolysis)或胰蛋白酶降解进行化学修饰。通过n-羟基琥珀酰亚胺酰化进行的胺基(n端和赖氨酸)的聚乙二醇化a.合成将胰岛素(或胰岛素类似物)与mpeg20k-nhs以1:1的摩尔比率一起溶解于0.1nn,n-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(ph8.0)。胰岛素肽浓度约为0.5mg/ml。反应进程用hplc监测。在室温下2小时后，反应的收率约为90%。b.纯化将反应混合物稀释2-5倍，并加样至rp-hplc。hplc条件：c4柱；流速10ml/分钟；a缓冲液：含10%acn和0.1%tfa的水溶液；b缓冲液：含0.1%tfa的acn溶液；线性梯度：b%0-40%(0-80分钟)；在约35%b时收集peg-胰岛素或类似物。所需化合物通过maidi-tof证实，随后通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰。苯丙氨酸芳环上乙酰基的还原性胺化聚乙二醇化a.合成将胰岛素(或胰岛素类似物)、mpeg20k-酰肼和nabh3cn按1:2:20的摩尔比率溶解于乙酸缓冲液(ph4.1-4.4)。反应溶液由0.1nnacl、0.2n乙酸和0.1nna2co3组成。在室温下经过24小时，胰岛素或胰岛素类似物的浓度约为0.5mg/ml。反应进程用hplc监测。反应的转化约为50%。(通过hplc计算)b.纯化将反应混合物稀释2-5倍，并加样至rp-hplc。hplc条件：c4柱；流速10ml/分钟；a缓冲液：含10%acn和0.1%tfa的水溶液；b缓冲液：含0.1%tfa的acn溶液；线性梯度：b%0-40%(0-80分钟)；在约35%b时收集peg-胰岛素或peg-胰岛素类似物。所需化合物通过maidi-tof证实，随后通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰。实施例3胰岛素受体结合测定：在竞争结合测定中，采用闪烁迫近技术(scintillationproximitytechnology)，测量了每种肽对胰岛素或igf-1受体的亲和力。在tris-cl缓冲液(0.05mtris-hcl(ph7.5)、0.15mnacl、0.1%w/v牛血清白蛋白)中对肽进行连续的3倍稀释，并在96孔板(corninginc.，acton，ma)中与0.05nm(3-[125i]-碘酪氨酰基)atyra14胰岛素或(3-[125i]-碘酪氨酰基)igf-1(amershambiosciences，piscataway，nj)混合。将从过量表达人胰岛素或igf-1受体的细胞中制备的等分量的1-6微克质膜片段加入各孔中，并加入0.25mg/孔的聚乙烯亚胺处理的麦胚凝集素a型闪烁迫近测定珠粒(amershambiosciences，piscataway，nj)。以800rpm振摇5分钟后，将板于室温温育12小时，并用microbeta1450液体闪烁计数器(perkin-elmer,wellesley,ma)测量放射性。在各孔中，用浓度比测试样品最高浓度高4倍的过量“非放射性”天然配体测量非特异性结合(nsb)的放射性。在无竞争剂的各孔中检测总的结合放射性。如下计算百分比特异性结合：%特异性结合=(结合的nsb/总的结合的nsb)x100。应用origin软件(originlab，northampton，ma)确定ic50值。实施例4胰岛素受体磷酸化测定：为了测量胰岛素或胰岛素类似物的受体磷酸化，将受体转染的hek293细胞接种到96孔组织培养板(costar#3596，cambridge，ma)中，并在补充了100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10mmhepes和0.25%牛生长血清的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)(hyclonesh30541，logan，ut)中在37℃、5%co2和90%湿度下培养16-20小时。在补充了0.5%牛血清白蛋白的dmem(rocheappliedscience#100350，indianapolis，in)中制备连续稀释的胰岛素或胰岛素类似物，并加入到具有贴壁细胞的各孔中。在潮湿环境与5%co2下于37℃温育15分钟后，细胞用5%低聚甲醛于室温固定20分钟，用磷酸缓冲盐水(ph7.4)洗涤两次，并用2%牛血清白蛋白在pbs中的溶液封闭(block)1小时。然后，将板洗涤三次，并根据生产商的建议加入在pbs(含有2%牛血清白蛋白)中复溶的抗磷酸酪氨酸的辣根过氧化物酶缀合的抗体(upstatebiotechnology#16-105，temecula，ca)。在室温下温育温3小时后，将板洗涤4次，并将0.1mltmb单一溶液底物(invitrogen，#00-2023，carlbad，ca)加入各孔中。5分钟后通过加入0.05ml1nhcl停止显色。在titertekmultiscanmcc340(thermofisher，pittsburgh，pa)中测量450nm下的吸光度。绘制吸光度相对于肽浓度的剂量反应曲线，并应用origin软件(originlab，northampton，ma)确定ec50值。实施例5测定模型二肽切割(在pbs中)的速率将一种特殊的六肽(hsrgtf-nh2；seqidno:17)用作模型肽，在该模型肽上可研究二肽n端延伸物的切割速率。制备二肽延伸的模型肽，将boc保护的肌氨酸和赖氨酸相继加入模型肽结合的树脂上以产生肽a(lys-sar-hsrgtf-nh2；seqidno:18)。通过hf使肽a切割，并用制备型hplc纯化。测定各个前肽的切割速率。通过其各自的峰面积确定前肽和模型母体肽的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，来确定前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。用式t1/2=.693/k计算各种前药切割的半衰期。测出该模型肽hsrgtf-nh2(seqidno:17)的lys-sar延伸物的半衰期为14.0小时。实施例6用全d-同工型模型肽测定的血浆中二肽切割半衰期的速率使用另外的模型六肽(dhdtdrgdtdf-nh2seqidno:21)测定血浆中二肽切割的速率。使用各氨基酸的d-异构体以防止除前药延伸物以外的模型肽的酶促切割。这种模型d-异构体六肽以类似于l-异构体的方式合成。如先前对肽a所报道，将肌氨酸和赖氨酸相继添加至n端以制备肽b(dlys-dsar-dhdtdrgdtdf-nh2seqidno:59)。测定各个前肽的切割速率。通过其各自的峰面积确定前肽和模型母体肽的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，来确定前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。测出这个模型肽dhdtdrgdtdf-nh2(seqidno:21)的lys-sar延伸物的半衰期为18.6小时。实施例7采用实施例5中所述方法，测定与模型六肽(hsrgtf-nh2；seqidno:17)连接的其它二肽的切割速率。在这些实验中得到的结果见表2和表3。表2：在pbs中与n端对氨基-phe侧链连接的二肽o-u自模型六肽(hsrgtf-nh2；seqidno:17)的切割表3：在pbs中与1位(x)上的组氨酸(或组氨酸衍生物)连接的二肽u-o自模型六肽(xsrgtf-nh2；seqidno:17)的切割nh2-u-o-xsrgtf-nh2化合物u(氨基酸)o(氨基酸)x(氨基酸)t½1fph未切割2羟基-fph未切割3gph未切割4羟基-gph未切割5aph未切割6cph未切割7sph未切割8pph未切割9kph未切割10eph未切割11脱氢vph未切割12pd-ph未切割13d-pph未切割14aibph32h15aibd-ph20h16aibpd-h16h17环己基-ph5h18环丙基-ph10h19n-me-aibph>500h20α,α-二乙基-glyph46h21羟基-aibph6122aibpa5823aibpn-甲基-his30h24aibn-甲基-glyh49min25aibn-己基-glyh10min26aib氮杂环丁烷-2-甲酸h>500h27gn-甲基-glyh104h28羟基-gn-甲基-glyh149h29gn-己基-glyh70h30dkn-甲基-glyh27h31dkn-甲基-alah14h32dkn-甲基-pheh57h33kn-甲基-glyh14h34fn-甲基-glyh29h35sn-甲基-glyh17h36pn-甲基-glyh181h此外，已经制备了igf1yl胰岛素类似物的各种前药衍生物，其中二肽元件已经经由酰胺键连接至存在于igf1yl的a19处的4-氨基-苯丙氨酸残基。使用实施例5的方法对这些化合物的体外分析揭示，这些化合物的活性随着在pbs缓冲液中或在20%血浆中温育的时间增加而增加。此外，测量了igf类似物前药miu30:a1(af19‐dlys(ac),sar)(二肽通过酰胺键与a194-氨基phe连接)在胰岛素受体结合方面相对于天然胰岛素的体外活性随着在20%血浆中温育的时间(1小时、3小时、6小时、9小时和10.5小时)的变化。表3a对比了随着在37℃的20%血浆/pbs中温育的时间而变化的相对胰岛素受体结合。如在体外结合测定(参见表3a)和体外磷酸化测定(参见表3b)中呈现的数据所示，随着前药形式转化成活性igf1yl肽，从a19igf前药衍生物样品恢复的活性随时间增加。表3a时间(小时)%胰岛素活性034.44%9100.09%95115.42%表3b时间(小时)%胰岛素活性123.0326.8632.5941.110.543.2体内葡萄糖耐量测试使用施用过胰岛素类似物miu-30a(b1(y16,l17,y25)29a:a1(dlys(ac),sar-af19)(二肽通过酰胺键与a194-氨基phe连接))的c57/blk小鼠，将miu30溶解在含有20%血浆的pbs(ph7.4)中，并在37℃温育48小时(产生“miu-30c”)。抽取温育0小时(miu30a)和48小时(miu30c)的样品，并以90nmol/kg和270nmol/kg注射给c57/blk小鼠，以测量葡萄糖降低(胰岛素耐量测试)。在图1a中显示了miu30a和miu30c在8小时内的不同时间的葡萄糖降低曲线。母体化合物具有低效力，但是在20%血浆中温育48小时(产生“miu-30c”)以后，效力增加(参见图1a)。在图1b中，将miu30a和miu30c的总血糖与媒介物的对比报告为有差别的曲线下面积(auc)。在90nmol/kg，miu30a指示葡萄糖几乎没有变化，而miu30c造成相当大的下降。在270nmol/kg，miu30a和miu30c都表现出葡萄糖降低，但是后一样品具有显著更高的降血糖效力。总之，在注射后，在生理条件下离体转化成母体胰岛素类似物之前，胰岛素类似物miu30的前药形式显示出明显更低的葡萄糖降低效力。这些体内结果与体外分析相一致。据估计，所述前药的半衰期为大约20小时。实施例8胰岛素前药类似物的比较性胰岛素耐量给正常小鼠施用胰岛素异源二聚体类似物[b1(y16,l17,y25)29a:a1(af19-nh2)]或其前药衍生物。前药衍生物miu-29:[b1(y16,l17,y25)29a:a1(af19-dlys(ac),nleu)]包含在a19位处的4-氨基-苯丙氨酸置换，其中二肽dlys(ac),nleu已经共价连接在a19残基的4-氨基位置处。该二肽将在生理条件下自切割，半衰期为大约4.4小时。离体温育前药衍生物[b1(y16,l17,y25)29a:a1(af19-dlys(ac),nleu)]24小时以后，将得到的化合物施用于小鼠，并将它的降血糖能力与母体化合物进行对比。两种化合物的表现几乎相同。研究了胰岛素前药类似物的酰化，以确定是否可以增加体内保留时间。与未酰化的前药相比，具有酰化二肽前药元件的miu42[b1(y16,l17,y25)29a:a1(dlys(re-c14),sar-af19)]的体外活性随着在30%acn/pbs(ph7.4，37℃)中离体温育时间(提供用于前药转化的时间)增加而增加(参见图2)。使用在没有预温育步骤下施用的miu42前药进行的比较性胰岛素效力测试表明，所述前药与非前药母体化合物(miu-27)相比不是非常有效。就具有在b29位处的酰化的酰化胰岛素类似物miu-46[b1(h5,10y16,l17,y25,k29-c14)28a:a1(n18,21,af19nh2)]而言，也是如此。当在小鼠中体内测试时，所述化合物没有表现出希望的体内效力或基础特性。因此，至少在小鼠中，酰化不会产生期望的特性。实施例9聚乙二醇化胰岛素前药类似物的生物合成和纯化使用固相boc-化学法，在mbha树脂上合成了igf1b链(2-25)h5,10y16l17sh7acm19酰胺。在从树脂切割肽并同时除去氨基酸侧链保护以后，在dmso中将粗制的b链与2,2’-二硫代双(5-硝基吡啶)混合，得到在cys7处的磺基丙氨酸-npys衍生物。通过b链和boc-aoa-osu之间的反应，将boc-氨基氧基乙酰基(aoa)添加至b链的n-端。使用us-2011-0257076(其公开内容通过引用并入本文)中所述的“1+2”方法，将纯化的igf1b链(2-25)(bocaoa)0h5,10y16l17sh7acm19酰胺与igf1a链acm6,7,11n18,21(aa1aa2)-pnh-f19酸相混合，得到具有在b链的n端处的boc-aoa的胰岛素类似物。通过在有作为清除剂的o-(羧甲基)羟胺半盐酸盐存在下用6nhcl短暂地处理肽，除去boc。除去boc并纯化以后，将所述肽以3mg/ml的浓度溶解在1%苯胺/30%acn/0.2mnaoac(ph4.6)中。将2倍过量的量的20kdpeg-丙醛加入该溶液中，在搅拌下在室温进行反应1小时，随后最终纯化，得到聚乙二醇化胰岛素类似物。20kdapeg向二链胰岛素类似物的氨基端的添加会降低胰岛素类似物的效力。可自切割的二肽前药元件(dlys(re-c14),nleu)在a19位的添加，使化合物的效力进一步降低了大约100倍。但是，将前药在37℃的pbs中预温育78小时(二肽具有大约4.4小时的半衰期)，会将效力恢复至与聚乙二醇化的母体化合物接近的值。参见表4，该表列出了通过体外磷酸化测定法测得的所述类似物在胰岛素受体a和b亚型处的ec50。表4.聚乙二醇化胰岛素前药的活性实施例10单链胰岛素类似物的生物合成和纯化将包含经由igf-ic链(b0-c1-a0)相连的天然胰岛素b链和a链的胰岛素-igf-i微基因克隆进在gap启动子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的启动子)控制下的表达载体pgapzαa(购自invitrogen)中，用于在酵母巴氏毕赤酵母(pichiapastoris)中组成型表达和纯化重组蛋白。为了将重组蛋白分泌进培养基中，使所述微基因与编码酿酒酵母α-交配因子前导信号的n-端肽融合。使用在所述微基因和α-交配因子前导序列之间的kex2切割位点来切割所述前导序列，以便分泌具有天然氨基端的微基因。将单位点丙氨酸突变引入在b0-c1-a0微基因的1位(g1a)、2位(y2a)、3位(g3a)、4位(s4a)、5位(s5a)、6位(s6a)、7位(r7a)、8位(r8a)、10位(p10a)、11位(q11a)和12位(t12a)处的c肽中。通过电穿孔，将包括b0-c1-a0、11种丙氨酸突变体和其它选择的衍生物的微基因转化进酵母巴氏毕赤酵母中。在最低限度甲醇平板上选择阳性的转化体，并制备每个毕赤酵母分离物的基因组，通过pcr证实所述构建体向酵母基因组中的整合。使833个碱基对的pcr产物在琼脂糖dna凝胶上显影。通过发酵对应的酵母系，生产胰岛素类似物。通过在500mlbeckman离心管中在5k离心20分钟，沉淀出酵母细胞，并保留培养基用于随后的蛋白纯化。通过0.2μmmillipore滤器，过滤生长培养基上清液。将乙腈(acn)加入上清液中，至20%的终体积。在得自sigma的amberlitexad7hp树脂上纯化上清液，所述树脂用20%acn水溶液预平衡。然后用30ml20%acn水溶液冲洗树脂2次，并用含有0.1%tfa的30%acn水溶液除去污染物。用含有0.1%tfa的54%acn水溶液从柱洗脱部分纯化的胰岛素类似物，并低压冻干。将低压冻干的样品再悬浮于0.025mnh3hco3(ph8)中，并在lunac18柱(10μm粒度,300å孔径)上纯化。使用20-60%acn水溶液的线性梯度，从柱洗脱蛋白。合并maldi-ms阳性级分，并转移至一次用弃的闪烁瓶中，用于随后的低压冻干。然后将低压冻干的样品再悬浮于含有0.1%tfa的20%acn水溶液中，并在lunac18柱(10μm粒度,300å孔径)上纯化。使用18-54%acn水溶液(含有0.1%tfa)的线性梯度，从柱洗脱蛋白。在吸光度280nm监测蛋白洗脱。通过c8分析柱，分析maldi-tofms阳性级分，以确保纯度。b0-c1-a0类似物表现出在胰岛素受体亚型(isoforms)和igf-1受体处同样有效的效力。在2位处的酪氨酸向丙氨酸的突变，或通过删除c9-12使c-肽缩短至8个氨基酸，会通过显著降低的igf-1受体活性来提供在胰岛素作用特异性方面的选择性增强。参见在表5a和5b中提供的数据：表5a胰岛素结合和磷酸化分析(b0c1a0)表5bigf-1结合和磷酸化分析(b0c1a0)2位和3位对在igf-1受体处的修饰最敏感，而胰岛素受体被证实对修饰相对不敏感。所有类似物维持单单位纳摩尔活性，某些特定类似物被证实具有轻微增强的效力(较低的单单位纳摩尔)。最具有胰岛素选择性的类似物是下述的那些类似物：我们给删除了c-肽的最后4个残基，具有在c-肽的2位处的丙氨酸突变，或2种变化的组合。通过将胰岛素类似物暴露于胰岛素特异性的降解酶(ide)并测定活性，研究了胰岛素/igf嵌合体的稳定性。胰岛素降解测定：从emdchemicalsinc.得到rdna大鼠ide。在碳酸氢铵缓冲液中，将肽制成15mm等分试样。基于在276nm的紫外吸光度，估计初始浓度，并使用内部标准品通过hplc分析进一步确认。使溶液的ph保持在7.8-8.4之间。加入ide，并在37℃消化一段时间(12-48小时)。根据实验，使用比率1:350-450(酶:底物)。根据时间间隔取出等分试样放入含有内部参照肽的tfa缓冲溶液中，用于hplc分析。取出额外的等分试样放入dmem测定培养基中，用于活性评价。立即在干冰上冷冻所有等分试样，并在分析之前在-55℃保存。hplc测定：在hplc测定中评价了研究的肽的降解特性。对于每个等分试样，使用tfa缓冲液，在与beckman-coulter系统相连的agilantzorbaxc8柱上运行2次(经10min的梯度20-60%b，其中b=90%acn)。生物活性：将与ide一起温育以后的类似物的残余效力确定为在胰岛素受体磷酸化elisa测定法中的半数最大有效浓度(ec50)。当通过胰岛素受体磷酸化对在酶促降解过程中制备的肽进行生物活性测定时，我们观察到所有胰岛素和igf-2a-链类似物丧失基本上所有的活性，而所有igf-1a-链类似物保留活性。胰岛素特异性的降解酶(ide)对胰岛素类似物的切割是非常稳健的，且可以在其中的a-链源自天然胰岛素序列的那些胰岛素类似物中容易地检测出。相反，其中的a-链源自igf-1序列的那些类似物似乎非常耐受蛋白酶解。展望增加的稳定性可能引起增加的促有丝分裂性，然而，并未显示出更高的胰岛素效力的类似物与增加的增殖之间存在关联。此外，且对于蛋白水解稳定性特别重要的是，更耐受ide的类似物未显示出具有任何更大的促有丝分裂的潜力。对一组胰岛素类似物进行在正常小鼠(meliorresearchlabs)中的体内测试。与标准的胰岛素治疗相比，所有的目标肽表现出类似的或增强的葡萄糖降低效力。但是，当对比含有相同b-链且含有胰岛素a或igf1a-链的类似物时，没有观察到效力的显著差异。这支持了下述结论：ide降解和胰岛素的清除不是主要的或生理学上相关的机理。实施例11n-烷基化和脂质化胰岛素前体的生物合成和纯化1.如图14a中所概述的三肽的液相合成。ugi反应的一般程序(8a,8b)将伯胺和醛于meoh中的溶液在室温下搅拌1小时，然后加入t-boc-d-lys(fmoc)或fmoc-d-lys(t-boc)和异氰基乙酸甲酯。将反应混合物在室温下搅拌10小时，并在减压下浓缩。将残余物用快速柱色谱法纯化，以得到产物。脂肪酸酰化的一般方法(9a,9b)用1％哌啶/1％1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯(dbu)/二氯甲烷(对于8a)或50%tfa/dcm(对于8b)除去赖氨酸侧链上的保护基。在dcm中的n-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺盐酸盐/6-氯-1-羟基苯并三唑无水物存在下用适当的脂肪酸酰化游离胺，并通过快速色谱法纯化所得产物。水解甲酯的一般方法(10a,10b)在碱性条件下在氢氧化锂于thf/水中的溶液中水解甲基酯。然后通过加入hcl溶液来将反应物调节至ph2，用dcm萃取反应混合物，并通过快速柱色谱法回收产物。羧酸活化的一般方法(11a,11b)将羧酸使用nmp中的dic/nhs来nmp活化，或由dic/nhs/nmp活化，并用于下一步骤中。2.三肽的固相合成(图14b)负载fmoc保护的氨基酸的一般程序(1)将1.0g(1.1mmol)2-氯三苯甲基氯化物树脂(100-200目；1%dvb；负载量1.1mmol/g)、fmoc-保护的氨基酸(2.2mmol，2当量)和350μln,n-二异丙基乙胺mmol，2当量)悬浮于dcm(10ml)中，并在室温下振荡过夜。将树脂排干，用dmf(10ml)洗涤3次，并用dcm(10ml)洗涤3次，然后用dcm(10ml)、meoh(2ml)和n,n-二异丙基乙胺(1ml)的溶液处理以失活未反应的2-氯三苯甲基氯化物位点。最后，将树脂用dmf(10ml)洗涤3次，并用dcm(10ml)洗涤3次，并真空干燥。树脂结合的α-溴代酰基-gly-氨基酸的一般程序(2)将树脂结合的1用dmf中的20％哌啶处理两次15分钟，再次将树脂用dmf(10ml)、dcm(10ml)和dmf(10ml)重复洗涤。在室温下将0.2g(0.22mmol)树脂的部分用dmf(3ml)中的146mga-溴乙酸(1.1mmol,5当量)、187mg6-氯-1-羟基苯并三唑脱水物(1.1mmol，5当量)和154μln,n-二异丙基碳二亚胺处理。2小时后，将树脂排干，用dmf(10ml)和dcm(10ml)洗涤3次。树脂结合的a-n-(r1)-gly的一般程序(3)在室温下将0.2g树脂用3mldmso中的3.0mmol伯胺和525µl(3mmol)diea处理过夜。然后将树脂排干，用dmf和dcm洗涤。树脂结合的t-boc-d-lys(fmoc)-n-(r1)-gly(4)将0.2g(0.22mmol)树脂3用dmf中的20％哌啶(10ml)处理，将树脂用dmf(10ml)、dcm(10ml)和dmf(10ml)再次洗涤，然后与dmf中的515mgt-boc-d-lys(fmocl)-oh(1.1mmol,5当量)、330mg3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3h)-酮(depbt)(1.1mmol,5当量)和192µldiea(1.1mmol,5当量)(3ml)在室温下混合过夜。将树脂排干，用dmf(10ml)和dcm(10ml)洗涤。树脂结合的t-boc-d-lys(脂肪酰基)-n-r1-gly-氨基酸(5)将树脂结合的4用dmf中的20％哌啶脱保护，再次将树脂用dmf(10ml)、dcm(10ml)和dmf(10ml)洗涤。在室温下将0.2g(0.22mmol)树脂部分用dcm(2ml)和dmf(2ml)中的长链脂肪酸(1.1mmol,5当量)、399mg1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(hatu)(1.05mmol,4.75当量)和193µlofdiea(1.05mmol,4.75当量)处理过夜。将树脂排干，用dmf(10ml)和dcm(10ml)洗涤并在真空下干燥。t-boc-d-lys(脂肪酰基)-n-r1-gly-氨基酸(6)将树脂结合的5在10mldcm中的0.1%tfa，20％三氟乙醇(tfe)中切割。1小时后，收集滤液，并用5mldcm冲洗树脂。将合并的滤液和dcm洗涤液合并，并在减压下蒸发，以得到黄色油状物。通过快速柱色谱法(dcm中的4％-12％meoh作为洗脱液)纯化该粗物质，以得到作为白色固体或淡黄色油状物的产物。t-boc-d-lys(脂肪酰基)-n-r1-gly-氨基酸-nhs酯(7)12.8mg游离酸6(0.02mmol)使用1mlnmp中的4.6mgnhs(0.04mmol,2当量)和5.6µldic(0.04mmol,2当量)活化过夜，且不经进一步纯化即使用。3.脂质化三肽与胰岛素的连接(参见图14c和14d)使用a1,b29-二-tboc-胰岛素合成脂质化胰岛素前药(图14c)制备a1,b29-二-tboc-胰岛素(12)将胰岛素(150mg,0.026mmol)悬浮于2%diea/dmf(15ml)中，并将12.7mg2-(叔丁氧基羰基-氧基亚氨基)-2-苯基乙腈(0.052mmol,2当量)加入浑浊溶液并在室温下搅拌4小时。4小时后，溶液变澄清，然后用135ml1%acoh和20%acn缓冲液淬灭反应。制备型hplc得到作为白色粉末的所需产物(60.2mg，38.5％产率)。将三肽与a1,b29-二-tboc-胰岛素偶联的一般程序(14)向a1,b29-二-tboc-胰岛素于nmp/n-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(ph8.2)(3:1)的混合物中的溶液中加入nmp中的2当量的三肽琥珀酸酯(2当量)。用lc-ms监测反应进程。在室温下4小时后，将反应混合物用过量的85％磷酸处理，通过用水稀释来淬灭并通过制备型hplc纯化，以得到产物。使用a1,b29-二-(fmoc)-胰岛素合成脂质化胰岛素前药(图14d)a1,b29-二-(fmoc)-胰岛素(15)将胰岛素(116mg,0.02mmol)溶解于5mlnmp(4ml)和n-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(ph8.2)(1ml)的混合物中。将fmoc-nhs酯(13.5mg,0.04mmol,2当量)缓慢加入所得溶液中，并将反应混合物在室温下用lc-ms监测进行搅拌。完成后，用135ml1%acoh和20%acn缓冲液淬灭反应。制备型hplc提供作为白色粉末的所需产物(25.2mg,20.5%产率)。将三肽部分与a1,b29-二-fmoc胰岛素偶联的一般程序(17)将a1,b29-二-fmoc-胰岛素于nmp/n-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(ph8.2)(3:1)中的溶液用nmp中的三肽琥珀酸酯(2当量)处理，并用lc-ms监测反应。在室温下4小时后，将反应混合物用dmf中的20％哌啶处理，通过加入0.1n盐酸溶液来淬灭并通过制备型hplc纯化，以得到最终前药。序列表<110>dimarchi,richardd.kou,binbinzhang,famayer,johnphilip<120>脂质化的基于酰胺的胰岛素前药<130>32993-242706<140>62/054,670<141>2014-09-24<160>67<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>prt<213>智人<400>1glyilevalgluglncyscysthrserilecysserleutyrglnleu151015gluasntyrcysasn20<210>2<211>30<212>prt<213>智人<400>2phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrprolysthr202530<210>3<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>胰岛素a链的类似物<220><221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>8位的xaa为苏氨酸或组氨酸<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>21位的xaa为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸<400>3glyilevalgluglncyscysxaaserilecysserleutyrglnleu151015gluasntyrcysxaa20<210>4<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>胰岛素b链的类似物<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为组氨酸或苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>6位的xaa为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸<400>4xaaleucysglyxaaxaaleuvalglualaleutyrleuvalcysgly151015gluargglyphephe20<210>5<211>30<212>prt<213>智人<400>5phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrasplysthr202530<210>6<211>30<212>prt<213>智人<400>6phevallysglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrglulysthr202530<210>7<211>21<212>prt<213>智人<400>7hisleucysglyserhisleuvalglualaleutyrleuvalcysgly151015gluargglyphephe20<210>8<211>4<212>prt<213>智人<400>8phevallysgln1<210>9<211>30<212>prt<213>智人<400>9phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrlysprothr202530<210>10<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>胰岛素b链的类似物<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸.<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为组氨酸和苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>9位的xaa为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>10位的xaa为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸<400>10xaavalasnglnxaaleucysglyxaaxaaleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrprolysthr202530<210>11<211>4<212>prt<213>智人<400>11proglyproglu1<210>12<211>4<212>prt<213>智人<400>12phevalasngln1<210>13<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>胰岛素b链的类似物<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸.<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为组氨酸和苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>9位的xaa为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>10位的xaa为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸<400>13xaavalasnglnxaaleucysglyxaaxaaleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrlysprothr202530<210>14<211>6<212>prt<213>智人<400>14alatyrargproserglu15<210>15<211>21<212>prt<213>智人<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>21位的xaa为组氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸<400>15hisleucysglyserhisleuvalglualaleutyrleuvalcysgly151015gluargglyphexaa20<210>16<211>21<212>prt<213>智人<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为组氨酸或苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为丙氨酸,甘氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>6位的xaa为组氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,高半胱氨酸或半胱氨酸<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>21位的xaa为组氨酸,酪氨酸或苯丙氨酸<400>16xaaleucysglyxaaxaaleuvalglualaleutyrleuvalcysgly151015gluargglyphexaa20<210>17<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为组氨酸或组氨酸类似物<220><221>mod_res<222>(6)..(6)<223>酰胺化<400>17xaaserargglythrphe15<210>18<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>模型合成肽<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>2位的xaa为肌氨酸<220><221>mod_res<222>(8)..(8)<223>酰胺化<400>18lysxaahisserargglythrphe15<210>19<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>胰岛素a链的类似物<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>5位的xaa为天冬氨酸或谷氨酸<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为谷氨酰胺或谷氨酸<220><221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>8位的xaa为组氨酸,苏氨酸或苯丙氨酸<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>9位的xaa为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或丙氨酸<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>10位的xaa为异亮氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>12位的xaa为天冬氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>14位的xaa为酪氨酸、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或丙氨酸<220><221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>15位的xaa为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、赖氨酸或亮氨酸<220><221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>17位的xaa为谷氨酰胺或谷氨酸<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>18位的xaa为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>21位的xaa为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸<400>19glyilevalxaaxaacyscysxaaxaaxaacysxaaleuxaaxaaleu151015xaaxaatyrcysxaa20<210>20<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>胰岛素b链的类似物<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为组氨酸或苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>6位的xaa为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>9位的xaa为天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>10位的xaa为丙氨酸或苏氨酸<220><221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>12位的xaa为谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>18位的xaa为丙氨酸,鸟氨酸,赖氨酸或精氨酸<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>21位的xaa为酪氨酸或4-氨基-苯丙氨酸<400>20xaaleucysglyxaaxaaleuvalxaaxaaleutyrleuvalcysgly151015xaaxaaglyphexaa20<210>21<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>胰高血糖素类似物<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>1位的xaa为d-组氨酸<220><221>mod_res<222>(2)..(2)<223>2位的xaa为d-苏氨酸<220><221>mod_res<222>(3)..(3)<223>3位的xaa为d-精氨酸<220><221>mod_res<222>(5)..(5)<223>5位的xaa为d-苏氨酸<220><221>mod_res<222>(6)..(6)<223>6位的xaa为d-苯丙氨酸<400>21xaaxaaxaaglyxaaxaa15<210>22<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>22glyglyglyproglylysarg15<210>23<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>23glytyrglyserserserargargalaproglnthr1510<210>24<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>24glyglyglyglyglylysarg15<210>25<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>25argargglyglyglyglygly15<210>26<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>26glyglyalaproglyaspvallysarg15<210>27<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>27argargalaproglyaspvalglygly15<210>28<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>28glyglytyrproglyaspvallysarg15<210>29<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>29argargtyrproglyaspvalglygly15<210>30<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>30glyglyhisproglyaspvallysarg15<210>31<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>31argarghisproglyaspvalglygly15<210>32<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>32argargglyproglyglygly15<210>33<211>51<212>prt<213>人工序列<220><223>单链人胰岛素类似物<220><221>misc_feature<222>(49)..(49)<223>49位的xaa为4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸<400>33phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrprolysthrglyile202530valgluglncyscysthrserilecysserleutyrglnleugluasn354045xaacysasn50<210>34<211>63<212>prt<213>人工序列<220><223>单链人胰岛素类似物<220><221>misc_feature<222>(61)..(61)<223>61位的xaa为4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸<400>34phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr151015leuvalcysglygluargglyphephetyrthrprolysthrglnpro202530leualaleugluglyserleuglnlysargglyilevalgluglncys354045cysthrserilecysserleutyrglnleugluasnxaacysasn505560<210>35<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>35alaglyargglyserglylys15<210>36<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>36alaglyleuglyserglylys15<210>37<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>37alaglymetglyserglylys15<210>38<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>38alasertrpglyserglylys15<210>39<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>39thrglyleuglyserglygln15<210>40<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>40thrglyleuglyargglylys15<210>41<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>41thrglyleuglyserglylys15<210>42<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>42hisglyleutyrserglylys15<210>43<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>43lysglyleuglyserglygln15<210>44<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>44valglyleumetserglylys15<210>45<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>45valglyleuserserglygln15<210>4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