一种绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的制作方法与工艺

本发明涉及一种体胚诱导培养基，尤其涉及一种从绒毛白蜡胚性愈伤组织诱导出体细胞胚的培养基，即绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基；属于白蜡组织培养技术。

背景技术：
绒毛白蜡(FraxinusvelutinaTorr.)为木犀科(oleaceae)白蜡属(Fraxinus)落叶乔木，是我国北方重要的造林树种，尤其在盐碱地区是重要的耐盐碱乔木树种，耐盐碱，抗旱涝，耐瘠薄，抗逆性强，适应范围广，且具有美观、速生、材优等特性，在园林绿化、用材林、防护林建设中广泛应用。近年来，初步建立了绒毛白蜡植物组织培养技术体系，陈之群等(2006)以绒毛白蜡茎段为外植体，通过腋芽增殖途径获得再生植株；王磊等(2008)以绒毛白蜡成熟胚和茎段为外植体，研究了其组织培养和植株再生技术，平均增殖系数为3.59，存在繁育增殖率低及生根率低等缺陷。迄今为止，有关植物组织培养技术的各类文献中，尚未见关于绒毛白蜡体胚诱导的研究报道。体胚诱导组织培养技术体系不仅是转基因最理想的受体系统，也是种苗快速繁育的有效方法之一。开发一种从绒毛白蜡胚性愈伤组织诱导出体细胞胚的培养基，即绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基有望为快速繁育和创制绒毛白蜡优良新种质提了新途径。

技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种绒毛白蜡离体叶片体胚诱导的培养基，用于绒毛白蜡优良种质大规模繁育生产和新种质创制研究。本发明所述的绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基，是将6-苄基腺嘌呤(6-BA)，萘乙酸(NAA)，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，蔗糖和琼脂，溶解于MS盐分+B5有机基本培养基中制得，其pH值为5.2–5.4；其特征在于：所述绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的组分用量以1L有机基本培养基的加入量计为：其中，上述MS盐分+B5有机基本培养基的组分为：KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，MgSO4·7H2O370mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，CaCl2·2H20440mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，KI0.83mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，FeSO4·7H2027.8mg·L-1，维生素B110mg·L-1，维生素B61mg·L-1，叶酸0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1。上述的绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基优选的实施方式是：所述绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的组分用量以1L有机基本培养基的加入量计为：本发明公开的绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基中，MS盐分+B5有机为基本培养基，提供植物组织生长的所需无机和有机营养元素，添加植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤(BA)，萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)促进形成体胚的作用；添加高浓度的蔗糖提供组织生长发育的碳素营养；添加琼脂是固化培养基，起支撑作用。上述绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基各组分的用量配比是发明人进行大量试验摸索总结得出的，实验证实：该培养基具有较好的诱导效果，利用本培养基绒毛白蜡离体叶片体胚的诱导率可达到79％，适合绒毛白工厂化育苗生产，有望为快速繁育和创制绒毛白蜡优良新种质提供新途径。附图说明图1.叶片。图2.体胚和体胚萌发苗。具体实施方式下面结合实施例对本发明内容作进一步阐明：实施例1：绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的组分用量以1L有机基本培养基的加入量计为：将上述6-苄基腺嘌呤(6-BA)，萘乙酸(NAA)，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，蔗糖和琼脂，溶解于MS盐分+B5有机基本培养基中即制得绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基，其pH值为5.2–5.4。实施例2：绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的组分用量以1L有机基本培养基的加入量计为：将上述6-苄基腺嘌呤(6-BA)，萘乙酸(NAA)，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，蔗糖和琼脂，溶解于MS盐分+B5有机基本培养基中即制得绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基，其pH值为5.2–5.4。实施例3：绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的组分用量以1L有机基本培养基的加入量计为：将上述6-苄基腺嘌呤(6-BA)，萘乙酸(NAA)，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，蔗糖和琼脂，溶解于MS盐分+B5有机基本培养基中即制得绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基，其pH值为5.2–5.4。上述实施例1-3中，MS盐分+B5有机基本培养基的组分为：KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，MgSO4·7H2O370mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，CaCl2·2H20440mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，KI0.83mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，FeSO4·7H2027.8mg·L-1，维生素B110mg·L-1，维生素B61mg·L-1，叶酸0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1。实施例4：绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基效果验证试验方法及结果：试验材料：以山东省林业科学研究院林木遗传育种所培养的无菌试管苗绒毛白蜡叶片作为外植体供体。叶片处理：将叶片从基部剪下，在每个叶片上剪2-3个伤口，近轴面朝上置于上述实施例1-3所述3种体胚诱导培养基上，每一培养皿(直径60mm)中放入6-10片叶片。培养条件：暗培养，昼温度25±2℃，夜温度18±2℃。培养20天后，绝大多数绒毛白蜡离体叶片生成体胚，此时转入体胚萌发培养基为MS盐分+B5有机+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.8，转入光照培养(昼温度25±2℃，夜温度18±2℃，14小时光照/10小时黑暗，光密度为100–120μmol·m-2·s-1)，培养4周后，统计结果如下：由表中结果分析得出如下结论：实施例2中的体胚诱导率最高为78％；实施例1和实施例3的体胚诱导率分别为42％和56％。综合以上分析，得出绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基优选的实施方式是：所述绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基的组分用量以1L有机基本培养基的加入量计为：