一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法与流程

本发明属于动物繁殖领域，具体地说，涉及一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法。

背景技术：

我国作为世界养鹅大国，虽近年来养鹅业呈现上升趋势，但市场仍处于供不应求的状况。这主要与鹅的繁殖特性有关，鹅的卵泡发育具有严格的等级，在数以千计的卵泡中只有少数(1％)卵泡会发育完全并排卵。

颗粒细胞作为卵巢的主要功能细胞，从原始卵泡的生成到成熟卵泡的排出这整个发育过程中都起着重要作用。颗粒细胞可以作为媒介通过间隙连接来弥补卵母细胞对小分子物质摄取能力的不足。同时颗粒细胞的生长分化是原始卵泡启动、生长的关键。而当颗粒细胞发生凋亡就会引起卵泡的闭锁，卵泡一旦闭锁就无法正常发育。所以为明确卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的分子机制对卵泡发育的调控机制就需对颗粒细胞进行分离培养。目前颗粒细胞分离技术在哺乳动物猪，牛，鼠上的应用较多。但对于禽类来说成熟的实验技术方案还是空白。

目前，牛，猪卵泡颗粒细胞分离大都采用无菌注射器抽取卵泡液,后进行离心分离颗粒细胞的方法，绵羊的颗粒细胞分离采用刮刀刮取后离心分离，鼠卵泡颗粒细胞分离大都采用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞流出至培养基中。

鸡颗粒细胞分离方法如下：1)产蛋高峰期母鸡，颈静脉放血处死，剖开腹腔，用灭菌剪刀完整取下整个卵巢，投入添加了3×双抗的PBS液的无菌烧杯中，带入无菌间进行分离。注意取卵巢时不要将卵泡弄破。2)对直径6mm以上的各级卵泡，逐个取下放于盛有3×双抗的PBS的灭菌的平皿中，左手用尖头的眼科镊子夹住卵泡最外边的膜层，右手用解剖针或尖头镊子将膜层与颗粒层进行剥离，确保外层膜剥离干净后，用小剪刀剪破卵泡放出卵黄，剩余组织于PBS中洗2-3次，放入灭菌1.5mL离心管中，用眼科剪剪碎。3)剪完后，加入1mL0.1％Ⅱ型胶原酶，放入38℃CO₂培养箱中消化7-8min。4)在超净台中，用灭菌200目铜网过滤至新离心管中，4000rpm离心5min。收集细胞沉淀，每管加500μLM199工作液轻轻吹打重悬细胞沉淀，暂时放入38℃CO₂培养箱中。5)待所有的细胞沉淀消化完毕后，统一收集到15mL离心管中，吹匀细胞，吸出10μL加990μLM199工作液稀释混匀进行细胞计数。6)按所需的细胞量接种24孔培养板，没孔细胞数1-2×106为宜。7)接种好的板放入CO₂培养箱中38℃静置培养，CO₂浓度5％。

鹅颗粒细胞分离方法目前还未有报导。鹅的生殖解剖学结构与哺乳动物差异很大，主要表现在鹅的卵巢上卵泡较大，内含大量的卵黄液，卵泡膜结构由外至内分为血管膜和结缔组织层，卵泡膜外模，卵泡膜内膜，基膜，颗粒细胞层和卵黄膜层。由于卵黄液较为粘稠，卵泡膜结构极其复杂，对分离颗粒细胞过程增加了难度。同时又因为鹅卵泡的生理解剖结构与哺乳动物存在差异，所以哺乳动物分离卵泡颗粒细胞的方法对于鹅来说并不适用。而同属家禽，鸡的颗粒细胞分离方法所采用的刮取法或者剥离法所分离的颗粒细胞容易掺杂卵泡膜细胞，致使所分离的细胞不单一。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法，本发明可成功分离鹅颗粒细胞，解决并弥补了这一实验方向上的空白，本方法可克服由于鹅卵泡特有的生理结构所造成的分离困难及分离的细胞不单一问题。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法，包括以下步骤：

1)取产蛋高峰期鹅，乙醚吸入式麻醉后处死，清理腹部羽毛后进行酒精消毒，用无菌的剪刀打开腹腔，剪取出整个卵巢，将取得的卵泡用预冷并加有双抗溶液的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次后转移到装有PBS缓冲液的无菌平皿中，转移至无菌间；

2)用无菌的镊子剥离干净卵泡外膜、结缔组织及血管网；

3)将剥离后的卵泡放入新的平皿中，在生物学解剖镜下用手术刀在卵泡表面划一道出切口，这时颗粒细胞膜层会随释放卵黄流出，用镊子将颗粒细胞膜层取出，用PBS缓冲液漂洗干净后剪碎，置于离心管中加培养液，用移液枪反复吹打使其分离；

4)向离心管内加入Ⅱ型胶原酶，置于37℃恒温水浴锅中消化，每5min振荡一次；

5)消化结束，加入含血清的培养基终止消化；用200目铜网过滤，收集滤液；

6)沉淀室温离心；弃上清，加入M199完全培养基后接种于6孔培养皿中，置于37℃、体积百分含量为5％CO₂培养箱内静置培养。

进一步地，PBS缓冲液具体包括以下组分：NaCl 8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaHPO₄·12H₂O 3.58g，蒸馏水1000ml，PH 7.2-7.4。

进一步地，双抗溶液具体为：100×的双抗溶液中，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，该溶液用体积分数为0.9％氯化钠配制而成。

进一步地，Ⅱ型胶原酶的体积百分含量为0.1％-0.5％；步骤4)中的消化时间为25-35min。

进一步地，步骤5)中的血清的体积百分含量为5％-15％。

进一步地，步骤6)中的离心条件为：转速1000-1500rpm，离心时间为5min。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本方法首先填补了没有鹅卵泡颗粒细胞分离技术的空白，其次此方法操作简单，方便，且最终所分离的颗粒细胞单一，可以提高后续实验的准确性。

2)本发明对鹅卵泡颗粒细胞进行分离，经台盼蓝染色后发现所分离出的颗粒细胞形态，大小均一，呈圆形或椭圆形，且结构完整，边缘分明，坏死细胞数量较少，说明所分离的颗粒细胞处于健康状态。可用于后续的转化，或者外源添加等试验。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明显微镜下分离开的卵泡膜和颗粒细胞层；

图2是本发明所分离的鹅卵泡颗粒细胞；

图3是本发明对颗粒细胞进行分离结果；

图4是采用现有刮刀刮取法分离颗粒细胞结果图。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明提供一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法，包括以下步骤：

1)取产蛋高峰期鹅，乙醚吸入式麻醉后处死，清理腹部羽毛后进行酒精消毒，用无菌的剪刀打开腹腔，剪取出整个卵巢，将取得的卵泡用预冷并加有双抗溶液的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次后转移到装有PBS缓冲液的无菌平皿中，转移至无菌间；

其中，PBS缓冲液具体包括以下组分：NaCl 8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，NaHPO₄·12H₂O 3.58g，蒸馏水1000ml，PH 7.2-7.4；

双抗溶液具体为：100×的双抗溶液中，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，该溶液用体积分数为0.9％的氯化钠配制而成；

2)用无菌的镊子剥离干净卵泡外膜、结缔组织及血管网；

3)将剥离后的卵泡放入新的平皿中，在生物学解剖镜下用手术刀在卵泡表面划一道出切口，这时颗粒细胞膜层会随释放卵黄流出，用镊子将颗粒细胞膜层取出，用PBS缓冲液漂洗干净后剪碎，置于离心管中加培养液，用移液枪反复吹打使其分离；

4)向离心管内加入体积百分含量为0.1％-0.5％的Ⅱ型胶原酶，置于37℃恒温水浴锅中消化25-35min，每5min振荡一次；

5)消化结束，加入含体积百分含量为5％-15％的血清的培养基终止消化；用200目铜网过滤，收集滤液；

6)沉淀室温离心，1000-1500rpm，5min；弃上清，加入M199完全培养基(市售)后接种于6孔培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养；待细胞生长融合用于实验。

由上述操作方法对鹅卵泡颗粒细胞进行分离，经台盼蓝染色后发现所分离出的颗粒细胞形态，大小均一，呈圆形或椭圆形，且结构完整，边缘分明，坏死细胞数量较少，说明所分离的颗粒细胞处于健康状态。可用于后续的转化，或者外源添加等试验。

实施例1

一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法，包括以下步骤：取产蛋高峰期鹅，乙醚吸入式麻醉后处死，清理腹部羽毛后进行酒精消毒，用无菌的剪刀打开腹腔，剪取出整个卵巢，将取得的卵泡用预冷并加有双抗溶液的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次后转移到装有PBS缓冲液的无菌平皿中，转移至无菌间；其中，PBS缓冲液具体包括以下组分：NaCl 8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，NaHPO₄·12H₂O 3.58g，蒸馏水1000ml，PH 7.3；双抗溶液具体为：100×的双抗溶液中，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，该溶液用体积分数为0.9％的氯化钠配制而成；用无菌的镊子剥离干净卵泡外膜、结缔组织及血管网；将剥离后的卵泡放入新的平皿中，在生物学解剖镜下用手术刀在卵泡表面划一道出切口，这时颗粒细胞膜层会随释放卵黄流出，用镊子将颗粒细胞膜层取出，用PBS缓冲液漂洗干净后剪碎，置于离心管中加培养液，用移液枪反复吹打使其分离，分离开的卵泡膜和颗粒细胞层如图1所示；向离心管内加入体积百分含量为0.3％的Ⅱ型胶原酶，置于37℃恒温水浴锅中消化30min，每5min振荡一次；消化结束，加入含体积百分含量为10％的血清的培养基终止消化；用200目铜网过滤，收集滤液；沉淀室温离心，1200rpm，5min；弃上清，加入M199完全培养基(市售)后接种于6孔培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养；分离所得到的鹅卵泡颗粒细胞如图2所示，待细胞生长融合用于实验。

采用实施例1分离方法制备得到的对颗粒细胞进行分离结果如图3所示，采用现有刮刀刮取法分离颗粒细胞结果图如图4所示，由两图对比可发现采用本实验方法所分离的鹅的颗粒细胞数量显著多与刮刀刮取法分离颗粒细胞，且形态，大小上均一，结构完整。可见其细胞质量优于刮刀刮取法分离的颗粒细胞。

实施例2

一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法，包括以下步骤：取产蛋高峰期鹅，乙醚吸入式麻醉后处死，清理腹部羽毛后进行酒精消毒，用无菌的剪刀打开腹腔，剪取出整个卵巢，将取得的卵泡用预冷并加有双抗溶液的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次后转移到装有PBS缓冲液的无菌平皿中，转移至无菌间；其中，PBS缓冲液具体包括以下组分：NaCl 8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，NaHPO₄·12H₂O 3.58g，蒸馏水1000ml，PH 7.2；双抗溶液具体为：100×的双抗溶液中，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，该溶液用体积分数为0.9％的氯化钠配制而成；用无菌的镊子剥离干净卵泡外膜、结缔组织及血管网；将剥离后的卵泡放入新的平皿中，在生物学解剖镜下用手术刀在卵泡表面划一道出切口，这时颗粒细胞膜层会随释放卵黄流出，用镊子将颗粒细胞膜层取出，用PBS缓冲液漂洗干净后剪碎，置于离心管中加培养液，用移液枪反复吹打使其分离；向离心管内加入体积百分含量为0.1％的Ⅱ型胶原酶，置于37℃恒温水浴锅中消化35min，每5min振荡一次；消化结束，加入含体积百分含量为5％的血清的培养基终止消化；用200目铜网过滤，收集滤液；沉淀室温离心，1500rpm，5min；弃上清，加入M199完全培养基(市售)后接种于6孔培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养；分离所得到的鹅卵泡颗粒细胞如图2所示，待细胞生长融合用于实验。

实施例3

一种鹅等级前卵泡颗粒细胞的分离方法，包括以下步骤：取产蛋高峰期鹅，乙醚吸入式麻醉后处死，清理腹部羽毛后进行酒精消毒，用无菌的剪刀打开腹腔，剪取出整个卵巢，将取得的卵泡用预冷并加有双抗溶液的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次后转移到装有PBS缓冲液的无菌平皿中，转移至无菌间；其中，PBS缓冲液具体包括以下组分：NaCl 8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，NaHPO₄·12H₂O 3.58g，蒸馏水1000ml，PH 7.4；双抗溶液具体为：100×的双抗溶液中，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，该溶液用体积分数为0.9％的氯化钠配制而成；用无菌的镊子剥离干净卵泡外膜、结缔组织及血管网；将剥离后的卵泡放入新的平皿中，在生物学解剖镜下用手术刀在卵泡表面划一道出切口，这时颗粒细胞膜层会随释放卵黄流出，用镊子将颗粒细胞膜层取出，用PBS缓冲液漂洗干净后剪碎，置于离心管中加培养液，用移液枪反复吹打使其分离；向离心管内加入体积百分含量为0.5％的Ⅱ型胶原酶，置于37℃恒温水浴锅中消化25min，每5min振荡一次；消化结束，加入含体积百分含量为5％-15％的血清的培养基终止消化；用200目铜网过滤，收集滤液；沉淀室温离心，1000rpm，5min；弃上清，加入M199完全培养基(市售)后接种于6孔培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养；分离所得到的鹅卵泡颗粒细胞如图2所示，待细胞生长融合用于实验。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。