一种米氏凯伦藻的检测方法与流程

本发明属于有害藻类检测技术领域，具体涉及一种有害藻类米氏凯伦藻Karenia mikimotoi的检测方法。

背景技术：

米氏凯伦藻Karenia mikimotoi是一种常见的有毒赤潮甲藻，它属于裸甲藻目(Gymnodiniales)、凯伦藻科(Kareniaceae)、卡罗藻属(Karlodinium)。它常见于温带和热带浅海水域，是一种典型的鱼毒性赤潮藻。近几年来，米氏凯伦藻与其他藻类多次在渤海引发赤潮，污染面积和次数逐渐增大。作为一种有毒藻类，米氏凯伦藻能分泌溶血性毒素，危害鱼类和无脊椎动物，引起养殖生物死亡，造成渔业经济损失，严重破坏了海洋生态系统，甚至通过食物链的传播，威胁到人类的健康。因此，对米氏凯伦藻的监测和研究一直是各国海洋工作者的热点。现阶段，用于检测米氏凯伦藻的方法主要通过显微镜观察其形态学特征。但由于米氏凯伦藻个体微小，很难进行样品处理及观察，这需要实验人员具备丰富的经验。因此，需要找到一种更快，更方便，更适合米氏凯伦藻的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速检测有害藻类米氏凯伦藻的检测方法，以实现对米氏凯伦藻进行安全、特异、快速、灵敏、简单的现场快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。

本发明首先提供一种检测米氏凯伦藻的环介导等温扩增引物组，包含有以下的引物：

F3引物KM-F3:5′-GCTTATTTGGCATATTCGTTAG-3′(SEQ ID NO:1)、

B3引物KM-B3:5′-ACTTACCCAATCCCGTGG-3′(SEQ ID NO:2)、

FIP引物KM-FIP:

5′-GGCCAAAGAATTCACTAGGATAAGC-GTGCTTTGGCTATTTGTGG-3′(SEQ ID NO:3)、

BIP引物KM-BIP:

5′-GACGGCTGCTGAAGCATCTC-TTTGCACCAAGTTTTTGATCTC-3′(SEQ ID NO:4)、

LF引物KM-LF:5′-ACAAAGACTGCAGCTGTCAAT-3′(SEQ ID NO:5)

LB引物KM-LB:5′-AAGCACAAGCCTTTACGTTTCTTG-3′(SEQ ID NO:6)；

作为优选，FIP引物KM-FIP的序列如下:

5′-GGCCAAAGAATTCACTAGGATAAGC-GTGCTTTGGCTATTTGTGG-3′(SEQ ID NO:7)、

BIP引物KM-BIP的序列如下:

5′-GACGGCTGCTGAAGCATCTC-TTTGCACCAAGTTTTTGATCTC-3′(SEQ ID NO:8)。

作为实施例的优选，KM-FIP的5′端进行生物素标记，LF引物KM-LF的5′端进行异硫氰酸荧光素FITC标记；

本发明还提供一种检测有害藻米氏凯伦藻的方法，包括如下的步骤

1)配制LAMP反应体系：

各引物的终浓度为：内引物KM-FIP和KM-BIP各1.6μmol/L，外引物KM-F3和KM-B3各0.2μmol/L，环引物KM-LF和KM-LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO₄ 8mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 10mmol/L，0.1％的Tween20，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶和2μL样品DNA模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；

2)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行核酸扩增反应，扩增反应所需温度为61℃-65℃，扩增反应所需时间为30min-60min；

3)LFD检测：取8μL核酸扩增产物将产物加入到100μL Buffer中混匀，然后将LFD试纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果。

其中步骤2)中所述的最适反应温度为63℃，最适反应时间为45min。

本发明所提供的米氏凯伦藻的LAMP-LFD检测方法具有如下优点：

一、高灵敏度，对米氏凯伦藻的检测最低线可至64pg/μL，其检测灵敏度比传统PCR的检测灵敏度高10倍。

二、强特异性，所用的特异性引物根据米氏凯伦藻的ITS基因中的六个不同区域设计，其中LF同时做为DNA特异性探针，该检测特异性比常规PCR强很多。

三、检测时间较短，50分钟左右可获得检测结果，比常规PCR检测时间节省2-4h。

四、仪器设备要求低，不需要PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统，只需一个恒温加热器即可完成检测。

五、操作简便、结果呈现明显，整个检测过程不涉及复杂昂贵仪器和设备，稍具有分子生物学基础的人员即可完成整个操作；检测结果清晰明显，直接通过肉眼观察即可判别。

六、对实验人员和环境更安全，检测过程不需要进行凝胶电泳故不使用EB等有毒试剂。

综上所述，本发明具有比现有传统技术PCR检测米氏凯伦藻的方法更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际野外现场应用，有利于检测和控制米氏凯伦藻的爆发，提前做好预防。运用本发明的方法对有害藻类米氏凯伦藻的检测，能有效的预防有害藻类米氏凯伦藻发生大规模赤潮，这对保护我国海洋及水产养殖具有重要意义。

附图说明

图1：米氏凯伦藻ITS基因的LAMP-LFD引物和探针设计示意图，引物和探针由方框圈出、

图2：PCR-AGE检测米氏凯伦藻的灵敏度图、

图3：LAMP检测米氏凯伦藻的灵敏度图、

图4：LAMP-LFD检测米氏凯伦藻灵敏度图、

在图2和图4中，泳道M为DL2000DNA marker,NC为阴性对照，1泳道为10⁰(模板浓度64ng/μL),2-8泳道依次为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍稀释的基因组DNA。

图5：PCR-AGE检测米氏凯伦藻的特异性图、

图6：LAMP检测米氏凯伦藻的特异性图、

图7：LAMP-LFD检测米氏凯伦藻的特异性图；

在图5和7中，泳道M为DL2000DNA marker,NC为阴性对照，1-8泳道依次为：米氏凯伦藻、塔玛亚历山大藻、东海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、赤藻异湾藻、中肋骨条藻、米氏凯伦藻。

具体实施方式

LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)相结合的一种新颖的检测技术，该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测有机的结合。环介导等温扩增技术(LAMP)，只需要在恒温(60℃–65℃)条件下保温几十分钟，即可将所需目的基因扩增到10⁹水平。横向流动试纸条(LFD)，融合了免疫层析技术和分子生物学手段，能在纸条上形成有颜色的检测线从而可以特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)相互结合的技术，使LAMP扩增产物现场检测可视化，检测结果明显直观，通过肉眼即可辨认，LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括以下三个部分：1、提供3对用于米氏凯伦藻的LAMP引物序列，即长度分别为20bp、18bp、32bp、42bp、22bp和21bp的寡核苷酸序列，依次命名为KM-F3、KM-B3、KM-FIP、KM-BIP、KM-LF和KM-LB；2、配制LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件；3、将KM-LF设计为DNA探针，结合LFD技术对LAMP扩增结果进行分析。

本发明所使用的8种藻：米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)以上微藻藻种均由宁波大学海洋生物实验室藻种室提供,培养海水(盐度25‰)经0.45μm醋酸纤维滤膜过滤后煮沸冷却,培养液采用浙江水产学院三号液配方(NMB 3#)。藻种在2500mL锥形瓶中于日光灯光照下培养,光照强度45～55μmo l/(m 2·s),光暗周期12∶12,培养温度为(20±2)℃。

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1:LAMP-LFD技术检测有害米氏凯伦藻的方法建立

Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.50购置宝生物工程(大连)有限公司脱氧核糖核酸扩增试剂盒，荣研生物科技(中国)有限公司，LFD检测试纸条购自Milenia Biotec GmbH公司(Milenia GenLine HybriDetect MGHD1，Germany)。

1、LAMP引物的设计

对NCBI中公开的米氏凯伦藻的IST基因进行同源性分析后，并比较了与米氏凯伦藻近似种的IST基因的序列，从而设计和筛选出下面3对引物，引物序列如下所示：

KM-F3:5′-AAGCATGCCTTCTTCAGTGT-3′

KM-B3:5′-CTGGAGCAGGCTACGAGT-3′

KM-FIP:

5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG-3′

KM-BIP:5′-TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG-3′

KM-LB:5′-TAGCGTCTCCAACGAGCAACT-3′

KM-LF:5′-GACAGCACCAAGAGAAGACTTG-3′

其中KM-FIP为5′端生物素标记引物，KM-LF为5′端异硫氰酸荧光素FITC标记探针；米氏凯伦藻的ITS基因LAMP扩增引物序列位置如图1所示。按照上述引物序列，在大连宝生物公司进行LAMP引物合成。

2、LAMP扩增条件优化

以米氏凯伦藻的基因组DNA作为模板进行扩增条件优化。LAMP法DNA扩增反应试剂盒购自博奥生物科技有限公司。首先配制具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP反应体系为：各引物浓度为：FIP-bio和BIP各1.6μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L，LF-fitc和LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Tween20 0.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶；基因组DNA模板2μl。按照上述体系要求配制反应混合物，混匀后分装到无菌PCR管中，反应总体积为25μl。LAMP-LFD反应体系见表1。

表1：LAMP-LFD反应体系

在反应过程中，扩增温度过高或过低都不利于LAMP反应。应用本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系，分别比较不同温度(61℃、63℃、65℃)条件下对LAMP反应的影响，通过实时浊度仪对扩增反应进行实时监控最终确定最佳反应时间和反应所需温度。通过实验结果分析最终选择63℃，45min作为后续LAMP扩增的最佳反应条件。

3、LFD检测

LAMP扩增结束后，取8μL扩增产物加入到100μL Buffer溶液中混匀，将LFD试纸条垂直浸入混合液中，观察试纸条检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品中米氏凯伦藻的检测结果为阳性，如果不显色则表示该样品米氏凯伦藻的检测结果为阴性。

实施例2

用本发明的LAMP-LFD技术对有害藻类米氏凯伦藻灵敏度进行测定

1、参照DNA提取试剂盒说明书提取的米氏凯伦藻基因组DNA，将所提取的米氏凯伦藻的基因组DNA模板原始浓度(74ng/μL)按10倍梯度稀释，分别做为反应模板。

2、用LAMP、LAMP-LFD和PCR法对米氏凯伦藻进行检测比较灵敏度。

2.1将上述梯度稀释的基因组DNA用作PCR反应模板，利用上述特异引物F3和B3进行扩增，反应体系为：20μmol/L F3和20μmol/L B3各1μL，Premix Taq酶(TaKaRa)25μL，米氏凯伦藻模板3μL，双蒸水定容至50μL体系。优化后的PCR反应条件：预变性95℃5min；95℃40s，51℃40s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果(图2)。

2.2将上述梯度稀释的基因组DNA用作LAMP的模板进行核酸扩增试验，结果见图3。

2.3按照本发明提供的LAMP的6条引物结合LFD技术将上述梯度稀释后的基因组DNA作为LAMP反应的模板进行扩增，用本发明提供的LFD方法分析LAMP反应，结果见图4。

米氏凯伦藻基因组DNA模板10倍梯度稀释实验证明，LAMP-LFD和LAMP检测的最低稀释浓度为10^-4，模板浓度为7.4pg/μL。PCR扩增最低浓度为74pg/μL。LAMP-LFD检测的灵敏度比和常规PCR方法高1个数量级，上述结果表明本发明的引物组能够保证检测时的灵敏性。

实施例3

用本发明的LAMP-LFD技术对有害藻类米氏凯伦藻特异性进行测定

选取米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)8种常见海洋有害藻类作为LAMP-LFD特异性试验藻，其中双蒸水为阴性对照。提取藻类的基因组DNA，扩增产物分别用LFD试纸条和1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。检测结果见图5-7，说明本发明提供的米氏凯伦藻的LAMP-LFD检测方法能保证对有害藻类米氏凯伦藻的特异性检测，不与其他相关藻类发生交叉反应。

实施例4

为进一步提高LAMP扩增的灵敏度，依据先前设计的引物，针对KM-FIP和KM-BIP我们对其引物中的碱基进行了改造，改造后的引物序列如下：

KM-FIP-1:

5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTATCATGCCTCTGACG-3′

KM-BIP-1:5′-TGGCCTATGACGCATTCAGAGTACACTACGAATGAGACACCG-3′

利用改造后的引物进行LAMP扩增的特异性和灵敏度检测。扩增反应体系除将实施例1中两条引物KM-FIP和KM-BIP分别更换为KM-FIP-1和KM-BIP-1外其他均不变，扩增和LFD检测过程也保持一致。与为进行引物改造前的LAMP-LFD相比，引物改造后的LAMP-LFD在特异性检测实验中与改造前的结果一致。但在灵敏度检测方面，与未改造的引物相比较，灵敏度又上升了1个数量级，比常规的PCR方法灵敏度提高了2个数量级。上述结果表明经改造后的本发明的引物组能够在保证特异性检测不变的情况下，进一步提高检测时的灵敏性。

实施例5

LAMP-LFD对各海域中有害藻类的检测应用

用实施例1中的试剂盒法提取各样品的DNA模板。并用已经设计好的LAMP-LFD方法检测海水样品中是否存在有害赤潮藻米氏凯伦藻；同时用实施案例2中的PCR法进行检测。每个样品分别作3个平行，检测结果如表2所示。

表2：LAMP-LFD与PCR法对各海域中有害藻类米氏凯伦藻的检测结果

注：+.阳性；—.阴性

上述结果表明本发明的引物组及检测方法所获得的结果与PCR的结果一致，证明了本发明的可靠性。