一种防治艳山姜叶病害的化学药剂筛选方法与流程

技术领域

本发明涉及微生物菌株及用于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种防治艳山姜叶病害的化学药剂筛选方法。

背景技术：

艳山姜为姜科山姜属植物，其干燥果实艳山姜，又称土砂仁，大草蔻，具有温中燥湿，行气止痛，截疟，驱风，健胃，化瘀的功效，作为贵州民族药被广泛用于治疗心腹冷痛，胸腹胀满，消化不良，呕吐腹泻等症状，收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003版）。现代研究表明，艳山姜药用有效成分为其挥发油，具有广泛的抗炎、镇痛及防治心血管系统疾病等多方面的生物活性。

艳山姜喜高温多湿环境，不耐寒，一般只能耐22-28℃左右的温度，不得低于5℃，怕霜雪，喜阳光又耐阴，宜在肥沃而保湿性好的土壤中生长自然分布于海拔400-650 m，我国中高海拔西南地区亦有分布。艳山姜具有温中燥湿，行气止痛，截疟，驱风，健胃，化瘀的功效，作为贵州民族药被广泛用于治疗心腹冷痛，胸腹胀满，消化不良，呕吐腹泻等症状，收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》。现代研究表明，艳山姜药用有效成分为其挥发油，具有广泛的抗炎、镇痛及防治心血管系统疾病等多方面的生物活性。艳山姜不同部位所含挥发油含量不一，种子团含挥发油较多，果皮最少，不同挥发油成分具有相应药理作用，其研究尚未完善，药理作用的研究对艳山姜的合理开发应用具有重要意义^[4]艳山姜是极具药用价值，食用价值，观赏价值和经济价值的一种植物，产量可达每亩1000公斤以上。近年来市场需求量不断增加，价格节节上升。

笔者在贵州省兴义市贞丰县连环乡对艳山姜病害调查研究发现，一种真菌病害主要危害艳山姜的茎叶和果实，叶片染病出呈现圆形或椭圆形褐色，中间为灰白色或暗白色，有些甚至穿孔，病健交界极为明显，后期病斑出现轮状黑色小颗粒，染病艳山姜果实由青转黄并逐渐枯萎掉落，影响了艳山姜果实的产量。查阅资料，并无相关艳山姜病害的报道,本次是首次对艳山姜叶部病害的报道。

技术实现要素：

本发明人2015-2016年在贵州省兴义市贞丰县连环乡艳山姜种植基地发现艳山姜出现一种疑似艳山姜炭疽病的病害，这种病害导致艳山姜果实产量下降。病情严重的叶片可形成大面积病斑，后期病斑穿孔，叶片枯萎掉落，最终干萎掉落。通过对艳山姜病株进行筛选，挑选出典型病株，培养病害组织，提取病原菌，然后用健康艳山姜叶片组织进行回接试验，对病菌分离纯化鉴定，判断病原菌为拟盘多毛孢属真菌，该菌首次在艳山姜病害中报道。

本发明的发明目的在于:寻找出导致艳山姜出现病害的病因，并寻找到一株艳山姜致病菌株。名称为拟盘多毛孢属真菌，菌落毡状，白色，边缘规整，后期正面有黑色点分生孢子团，反面从中心向外缘零星变黑。分生孢子由5个细胞组成，成纺锤状、直状或稍微弯曲， 21.5.0-26.5× 6.0-7.5 μm，5个细胞由3个有色细胞和两个无色细胞组成，4个隔膜均为真隔膜，中间为3个褐色细胞，13.0-16.0 μm,两端为两个无色细胞， 顶部无色胞为三角锥形，着生1根无色附着丝，底部无色孢为三角锥形，着生3-4根无色附着丝。

本发明另一个目的在于公开了一种用于艳山姜叶病害的鉴定方法。

本发明的第三个目的是提供了该菌株拟盘多毛孢属真菌作为对照品，在用于鉴定艳山姜叶病害方面的应用。

本发明的技术方案概述如下:

发明所提供的艳山姜致病菌株，其特征在于该菌株的名称为拟盘多毛孢属真菌Neopestalotiopsis zerumbet,已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC 12776。在2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Cultuer Collection Centre）进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

（1）该菌株已从艳山姜叶部病斑处中分离纯化得到，经基因测序，属于Neopestalotiopsis zerumbet。该菌菌落毡状，白色，边缘规整，后期正面有黑色点分生孢子团，反面从中心向外缘零星变黑。分生孢子由5个细胞组成，成纺锤状、直状或稍微弯曲， 21.5.0-26.5× 6.0-7.5 μm，5个细胞由3个有色细胞和两个无色细胞组成，4个隔膜均为真隔膜，中间为3个褐色细胞，13.0-16.0 μm,两端为两个无色细胞， 顶部无色胞为三角锥形，着生1根无色附着丝，底部无色孢为三角锥形，着生3-4根无色附着丝。菌落形态如图1(h,i)。

本发明进一步公开了一种防治艳山姜叶病害的化学药剂筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行:

(1)病株采集:在贵州省兴义市连环乡艳山姜种植基地采集典型病株，并描述病株形态（菌落毡状，白色，边缘规整，后期正面有黑色点分生孢子团，反面从中心向外缘零星变黑。分生孢子由5个细胞组成，成纺锤状、直状或稍微弯曲， 21.5.0-26.5× 6.0-7.5 μm，5个细胞由3个有色细胞和两个无色细胞组成，4个隔膜均为真隔膜，中间为3个褐色细胞，13.0-16.0 μm,两端为两个无色细胞， 顶部无色胞为三角锥形，着生1根无色附着丝，底部无色孢为三角锥形，着生3-4根无色附着丝）。

(2) 病原菌分离纯化:将病变部位接种到培养基中，通过多次接种分离得到病原菌菌株;

(3)病原菌回接实验:选取健康的艳山姜叶片组织，将分离菌株接种到健康艳山姜叶片组织上，放入培养皿中保湿培养，所用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），之后将接种叶片与采集的病害叶片病症进行对比，筛选出致病菌，形态学鉴定:将筛选出的病原菌进行培养，待菌落产孢，挑取菌落边缘菌丝，于显微镜下观察病原菌形态特征；

(5) DNA提取:根据DNA提取试剂盒的步骤提取病原菌DNA，设立两组实验a和b;其中a指的是BIOMIGA Fungus Genomic DNA Extraction Kit (GD2416)试剂盒提取；b指的是CTAB法；

(6) PCR扩增:将提取的DNA进行PCR扩增，用凝胶成像系统显色，之后将DNA测序;测序结果见SEQ ID No.1.

(7) 测DNA序列:测序之后，构建系统发育树，判断病原菌种属为拟盘多毛孢属真菌。

附图说明：

图1为菌落形态图；

其中a :田间病叶症状；b,c：回接结果；d-g:病原菌分生孢子形态；h,i：病原菌菌落形态；

图2为基于ITS基因的Mp系统发育树；

图3为药效结果，其中A为70%甲基托布津系列溶度抑制效果 B为25%咪鲜胺系列溶度抑菌效果。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售；

本发明所用到的菌株来源：

实施例1

1.情况介绍

近年来引入种植的艳山姜逐渐开始出现病害并逐渐加重，其中真菌病害是导致艳山姜果实产量下降，品质降低的主要因素之一。2015-2016年笔者在贵州省兴义市贞丰县连环乡对艳山姜病害调查研究发现，一种真菌病害主要危害艳山姜的茎叶和果实，叶片染病出呈现圆形或椭圆形褐色，中间为灰白色或暗白色，有些甚至穿孔，病健交界极为明显，后期病斑出现轮状黑色小颗粒，染病艳山姜果实由青转黄并逐渐枯萎掉落。采集当地艳山姜病株进行病菌分离纯化，形态和症状描述，并进行艳山姜叶片组织回接试验，对比回接病斑与标本病斑一致，确定病原为拟盘多毛孢属真菌。然后通过进行室内化学药剂筛选，以期筛选出能够有效抑制艳山姜病害的杀菌剂，有效控制艳山姜病害，从而减少作物损失，保障农民收入。室内药剂筛选试验结果表明：25%咪鲜胺乳油和70%甲基托布津可湿性粉剂的抑制效果最好，EC₅₀分别为0.1503μg/ml，0.8723μg/ml,250g/L嘧菌酯次之。故25%咪鲜胺乳油可作为防治艳山姜拟盘多毛孢叶斑病的最佳化学药剂。

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1病原菌鉴定

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：39g PDA，5g琼脂粉配制成1L，(PDA上海博微生物科技有限公司生产，琼脂粉为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）

供试仪器：主要仪器有Nikon光学显微镜，Nikon图像分析系统，BIO-BRI PCR热循环仪，BIO-RAD 凝胶成像系统，Biometra高速冷冻离心机

供试试剂： PCR Master Mix, PBS缓冲液，引物为ITS1，ITS4

2.1.2药效实验

表1 供试化学药剂

2.2方法

2.2.1病原菌分离纯化

笔者于2015-2016年在贵州省兴义市贞丰县连环乡艳山姜种植基地对病害进行调查，同时进行症状描述，并采集典型病株，备用。

将采集的艳山姜病害处冲洗干净、晾干，在病健交界处剪取3-5mm×3-5mm山姜病害处的组织块，先用75%酒精消毒20s左右，然后用无菌水漂洗2-3次后用灭菌滤纸吸干，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，每个培养皿接种2-4块，置于27℃下培养2-3天。待菌落生长过后，从第一次接种生长的菌落中挑选几株生长较好，杂菌污染小的菌落，从该菌落边缘挑取菌丝，置于平板PDA培养基中进行纯化培养，每个位置接种两块平板作为对照，27℃下培养3-4天，获得分离菌株，菌落形态观察，并制作玻片在显微镜下进行分生孢子形态观察。

2.2.2柯赫氏法则

运用柯赫氏法则进行验证。挑选健康的艳山姜叶片进行回接实验，截取健康的叶片组织清洗干净，晾干，用75%乙醇对叶片组织消毒，用无菌处理的针刺叶片，并将分离的生长的菌块菌丝面贴在叶片针刺处，放在无菌处理的吸水纸上，放入培养皿中，加入无菌水保湿27℃下培养6-7天，每片叶片组织接种4个位置，同时设置对照培养皿，随时注意观察发病情况。之后对比接种叶片组织病症与采集的经典病株对比，挑选出回接试验病症与病株一致的菌落，并将该菌落接种10个培养皿作为药效实验用菌。

2.2.3形态学鉴定

挑取分离纯化的单株菌落菌丝接种到PDA培养基中，培养3-4天，观察菌落性状，挑取菌丝制做玻片观察分生孢子的形态特征，包括菌丝颜色，分生孢子的形态，利用目镜测微尺测定孢子大小，用显微镜成像系统拍照。

2.2.4分子系统学鉴定（DNA提取，PCR扩增，系统发育树构建）

DNA提取：运用改良的Gene TLE^TM提取方法：将待测菌株置于PDA培养基中28℃振荡培养3-5天,取1ml培养液，用无菌去离子水洗涤后，收集菌丝体；加入SolutionⅠ540μL，振荡混匀后放置10min，加入SolutionⅡ60μL,在95℃金属浴中加热10min，再加入SolutionⅢ300μL,置于冰上两分钟；12000r/min、4℃离心5min,上清液移至新管，加入异丙醇600μL，12000r/min、4℃离心震荡5min，弃去上清液，加入体积分数70%冷乙醇200μL洗涤沉淀，12000r/min、4℃离心5min，沉淀为DNA，用离心浓缩干燥仪干燥DNA；将DNA溶于50μL无菌去离子水，-20℃保存备用。

PCR扩增用BIO-BRI PCR热循环仪对DNA扩增，用BIO-RAD 凝胶成像系统显色，按《分子克隆试实验指南》相关步骤操作，进行菌落PCR鉴定，测序，测序结果如下：

系统发育树构建。 将测得的序列与用Blastn软件从GenBank搜索到的相关序列，CLUSTALW软件对位排列后再手工校正。系统发育分析采用PAUP4.0版beta10中的简约法进行最大简约性分析，对于由序列长度多态性所造成的空位，在运算处理中为缺失状态。利用bootstrap(1000次重复)检验各分支的置信度。

2.2.5药效实验

药剂对菌丝的抑制效果测定，采用含药平板法：

第1步：将上述7种药剂分别配制成含有有效成分1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/ml 6种质量浓度(1)80%多菌灵：取1.250 g多菌灵（80%）稀释10000倍配制成100 μg/ml浓液，依次取0.125 ml、0.250 ml、0.50 ml、1.000 ml、2.000 ml、4.000 ml配制成10 ml浓液即得；同f法（2）75%百菌清：取1.333 g百菌清（75%)稀释10000倍配制成100 μg/ml浓液；70%甲基托布津取1.42857 g稀释10000倍配制成100 μg/ml浓液；80%代森锰锌取1.250g稀释10000倍配制成100 μg/ml浓液；57.6%冠菌清取1.736g稀释10000倍配制成100 μg/ml浓液；250 g/L嘧菌酯：取40 μl配制成100 ml则浓度为100 μg/ml；25%咪鲜胺：取0.040 g配制成100 ml即的100 μg/ml浓液。同上法依次配制成系列浓度。

第2步：在无菌操作台中，用灭菌过液枪枪头和10 ml量筒，在培养皿中加入1 ml配好的药剂，外加已灭菌并降温的PDA培养基9 ml，混匀，配成共10 ml的培养基，以加入1 ml无菌水和9 ml灭菌PDA培养基的平板作为空白对照。

第3步：待培养皿混匀冷凝后，在分离纯化培养好的病原菌菌落沿边缘用灭菌过的0.5 cm打孔器取直径0.5c m的菌块，接种到含有药剂和对照组分的培养皿中央，每个培养皿放一块菌块，并且每种药剂的各个浓度设立3个重复试验。将接种好的培养皿放在27℃恒温培养箱中培养5d后采用十字交叉发测量生长菌落直径，并计算抑制率^[10]。

抑制率=(对照菌落直径—处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

测得的数据以浓度取自然对数e的对数为横坐标(X)，以抑制率对应的几率值作为纵坐标（Y)，应用统计学方法，拟合出试验浓度对数-抑制率百分率几率值的回归方程和相关系数R等相关数据。并且以抑制率为50%时对应的机率值代入毒力方程求出X，再转化成抑菌中浓度EC₅₀的值，EC₅₀越小，说明该药剂对菌丝的抑制作用越好，最后用EC₅₀值来衡量化学药剂对病原菌菌丝毒力的大小。

3结果

3. 1病原菌分离纯化及病斑描述

第一次接种，从病株上截取的病健交界处3-5mm×3-5mm大小病害组织接种到PDA培养基中，菌落长出絮状菌丝，呈白色绒毛状，在后期生长中出现黑色分生孢子盘，生长迅速，长满整个培养皿。有些培养皿中菌落出现绿色，黑色和淡黄色菌落（如图1）。第2次接种的菌落杂菌肉眼几乎无法看到，生长初期菌落为纯白色绒毛状，出现黑色小颗粒，背面为橘黄色（如图2），共获得纯菌株6株。

病斑描述：病斑椭圆形到不规则形，生于植株叶片上表面，初期斑点小，圆，为浅红色，后期病斑扩大，病斑中央叶肉减少，显示出明显的叶脉，中央变白，边缘仍保留浅红色。

3. 2致病性测定

挑取典型纯化后的菌株，针刺接种到健康的艳山姜叶片组织6-7d后，接种部位出现轮状病斑，并出现黑色孢子盘，与病株上的病斑一致（如图3)。将回接的菌落挑取上次接种位置的菌丝重新接种到新的培养基中，共10个组分，生长出来的菌落正面为白色绒毛状，有大量黑色分生孢子盘，反面呈橘黄色。

3. 3形态学鉴定

在显微镜下观察分生孢子盘和形态，观察发现，分生孢子由5个细胞组成，成纺锤状、直状或稍微弯曲，18.0-24.0× 5.0-8.0 μm，5个细胞由3个有色细胞和两个无色细胞组成，4个隔膜均为真隔膜，中间为3个褐色细胞，14.0-20.0 μm两端为两个无色细胞，16.0-22.0 μm 顶部无色胞为三角锥形，着生一根无色附着丝，底部无色孢为三角锥形，着生2-4根无色附着丝。

3. 4分子系统学鉴定

系统发育树构建 根据系统发育结果显示本实验菌株GZMU001与Pestalotiopsis trachicarpicola聚为一支，支持率为87%，结合形态学数据我们初步将GZMU001鉴定为Pestalotiopsis trachicarpicola。

3. 5药效实验

将病原菌接种在含有各系列浓度的化学药剂及对照组实验的培养皿中，在27℃的条件下培养5天，统计菌落生长情况由表2可知，在本次提供实验的7种化学药剂及其一系列浓度范围内，不同的供试药剂对病原菌丝生长的抑制作用存在明显差异，在0.125-4.000μg/ml的浓度范围内，7种药剂中，80%多菌灵对病原菌的生长无明显抑制效果，其他6种化学药剂对病原菌生长的抑制作用存在相似的规律，即随着浓度的增大，对病原菌的抑制作用越强，菌落生长直径越小（表2）。在本次实验中，在最高质量浓度4.000 μg/ml下，抑制率达到65%以上的药剂有2种，即70%甲基托布津可湿性粉末和25%咪鲜胺乳油抑制率分别达到了78.73%和91.01%，培养15d后抑制生长效果。250 g/L嘧菌酯对病原菌的抑制有一定效果，但在本实验的系列浓度中抑菌效果不佳，其6个浓度的抑制率为21.36%，24.24%，26.03%，28.73%，32.50%，34.11%，抑制率相对甲基托布津和咪鲜胺较低。而75%百菌清，80%代森锰锌和57.6%冠菌清对病原菌的抑制效果不明显。

将70%甲基托布津和25%咪鲜胺组分培养皿测得的菌落直径，以化学药剂有效含量（μ g/ml）以e为底的对数值（X）为横坐标，以抑制率对应的几率值（Y）为纵坐标，用PBT软件处理数据，求出相应的回归曲线方程，及在抑制率为50%时的浓度（EC₅₀）如表3。25%咪鲜胺的EC₅₀为0.1503 μg/ml,70%甲基托布津的EC₅₀为

0.8723 μg/ml 。在本次药剂筛选试验中，25%咪鲜胺其EC₅₀值最低，其次是70%甲基托布津，故25%咪鲜胺的抑菌效果最好。

表2 1：80%多菌灵 2：75%百菌清 3：70%甲基托布津 4：80%代森锰锌

5：57.6%冠菌清6：250g/L嘧菌酯 7：25%咪鲜胺 对照：无菌水

表3 化学药剂毒力回归曲线

试验方法：生长速率法 试验日期2016-04-12 统计方法： 几率值法

4讨论

目前，关于艳山姜的研究还处在发展阶段，尤其是艳山姜病害的研究在国内还是很少。本次试验对导致艳山姜出现病害的病原菌分离纯化，回接试验，再对病原菌进行形态学和分子系统学鉴定，最终确定病原菌为拟盘多毛孢菌，之后进行化学药剂对病原菌毒力筛选试验，以期能找到有效防治艳山姜拟盘多毛孢叶斑病的化学药剂。

病原菌鉴定结果，艳山姜致病菌为拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis trachicarpicola。

室内药剂筛选试验结果表明，7种供试化学试剂对病原菌生长的抑制作用存在较大差异，25%咪鲜胺乳油和70%甲基托布津可湿性粉剂的抑制效果最好，EC₅₀分别为0.1503μg/ml，0.8723μg/ml,250g/L嘧菌酯次之，其他4种药剂在本次试验浓度下几乎没有抑制效果。故25%咪鲜胺乳油可作为防治艳山姜拟盘多毛孢叶斑病的最佳化学药剂。

观察发现艳山姜病害出现原因还与种植密度有关，艳山姜种植基地种植密度较大，而且对死亡，病株和往年种植的艳山姜植株没有及时正确清理，害虫的啃咬也增加了艳山姜交叉感染的机率。

本次化学药剂筛选所用试剂在市场上均有销售，属于常用抗病药剂，成本较低，适于病害防治用药。但使用化学药剂对艳山姜会造成污染，对中药材的品质造成影响，在使用时应注意这不容忽视的问题。故在日常管理中，对艳山姜种植应该有更严格的规范要求，合理控制种植密度，及时清理病株，清理病害菌源，降低艳山姜交叉感染几率，防止病害大规模出现。

实施例2

一种防治艳山姜叶病害的化学药剂筛选方法：

第1步：将70%甲基托布津或25%咪鲜胺分别配制成含有有效成分1.25 μg/ml质量浓度的10 ml浓液；

第2步：在无菌操作台中，用灭菌过液枪枪头和10 ml量筒，在培养皿中加入1 ml配好的第1步浓液，外加已灭菌并降温的PDA培养基9 ml，混匀，配成共10 ml的培养基，以加入1 ml无菌水和9 ml灭菌PDA培养基的平板作为空白对照；所述的PDA培养基的组成为马铃薯200g,琼脂20g,葡萄糖20g，配成1000ml；

第3步：待培养皿混匀冷凝后，在分离纯化培养好的病原菌菌落沿边缘用灭菌过的0.5 cm打孔器取直径0.5c m的菌块，接种到含有浓液和对照组分的培养皿中央，每个培养皿放一块菌块，将接种好的培养皿放在27℃恒温培养箱中培养5d后采用十字交叉发测量生长菌落直径，并计算抑制率；所述的浓液指的是不同药剂配制成1.25μg/ml，2.50μg/ml，5.00μg/ml,10.00μg/ml,20.00μg/ml，40.00 μg/ml的浓液；

所述的对照组分的培养皿指的是以无菌水作为对照药剂的培养皿；对照组分指的是：拟盘多毛孢属真菌。

防治艳山姜叶病害的化学药剂筛选方法，其中70%甲基托布津指的是：取1.42857 g稀释10000倍配制成100 μg/ml浓液； 25%咪鲜胺指的是：取0.040 g配制成100 ml即的100 μg/ml浓液。配制成母液，通过稀释将70%甲基托布津配制终浓度为含有有效成分1.25μg/ml质量浓度的10 ml浓液，将25%咪鲜胺配制终浓度为含有有效成分1.25μg/ml质量浓度的10 ml浓液。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州医科大学

<120> 一种防治艳山姜叶病害的化学药剂筛选方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcttcttata gctgctgccg gtggaccatt aaactcttgt tattttatgt aatctgagcg 60

tcttatttta ataagtcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag 120

aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 180

gaacgcacat tgcgcccatt agtattctag tgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac 240

ccttaagcct agcttagtgt tgggaatcta cttcttttat tagttgtagt tcctgaaata 300

caacggcgga tttgtagtat cctctgagcg tagtaatgtt tttctcgctt ttgttaggtg 360

ctataactcc cagccgctaa acccccaatt ttttgtggtt gacctcggat caggtaggaa 420

tacccgctga acttaagcat 440