结合EGFR和C‑METIII型纤连蛋白域的分子的制作方法

本申请是申请日为2013年11月21日，申请号为201380071078.6，发明名称为“结合egfr和c-metiii型纤连蛋白域的分子”的发明专利的分案申请。本发明涉及结合egfr和/或c-met的单特异性或双特异性分子以及制备和使用该分子的方法。
背景技术：
：表皮生长因子受体(egfr、erbbl或her1)是由c-erbbl原癌基因编码的170kda跨膜糖蛋白。egfr是受体酪氨酸激酶(rtk)的人表皮生长因子受体(her)家族的成员，所述家族包括her2(erbb2)、her3(erbb3)和her4(erbb4)。egfr信号传导通过如下方式引发：配体结合、之后诱导构象变化、受体与其他erbb家族成员的同源二聚化或异源二聚化，以及受体的反式自磷酸化(ferguson等人，annurevbiophys，37：353-73，2008)，这引发了信号转导级联，最终影响多种多样的细胞功能，包括细胞增殖和存活。egfr的表达或激酶活性的增加与一系列人癌症有关，从而使egfr成为治疗干预的有吸引力的靶标(mendelsohn等人，oncogene19：6550-6565，2000；grünwald等人，jnatlcancerinst，95：851-67，2003；mendelsohn等人，seminoncol，33：369-85，2006)。在非小细胞肺癌中，egfr基因拷贝数和蛋白表达两者的增加与对egfr酪氨酸激酶抑制剂iressatm((吉非替尼)的有利响应相关联(hirsch等人，annoncol18：752-60，2007)。egfr疗法包括小分子和抗egfr抗体两者，它们经批准用于治疗结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌和非小细胞肺癌(nsclc)(baselga和arteaga，jclinoncol，23：2445-2459(20005；gill等人，jbiolchem，259：7755-7760，1984；goldstein等人，clincancerres，1：1311-1318，1995；prewett等人，clincancerres，4：2957-2966，1998)。抗egfr疗法的疗效可取决于瘤类型以及瘤中的efgr突变/扩增状态。当前疗法的副作用可包括皮肤毒性(deroock等人，lancetoncol11：753-762，2010；linardou等人，natrevclinoncol，6：352-366，2009；li和perez-soler，targoncol4：107-119，2009)。egfr酪氨酸激酶抑制剂(tki)通常用作非小细胞肺癌(nsclc)的二线疗法，但由于抗药途径的原因，通常会在十二个月内失效(riely等人，clincancerres12：839-44，2006)。c-met编码酪氨酸激酶受体。其在1984年在发现用致癌物处理产生了组成型活性融合蛋白tpr-met之后，首次被鉴定为原癌基因(cooper等人，nature，311：29-33，1984)。c-met被其配体肝细胞生长因子(hgf)激活会刺激大量的细胞过程，包括生长、运动、侵袭、转移、上皮细胞-细胞转化、血管生成/创伤愈合以及组织再生(christensen等人，cancerlett225：1-26，2005；peters和adjei，natrevclinoncol，9：314-26，2012)。c-met被合成为单链蛋白质，该蛋白质被蛋白水解裂解成由二硫键连接的50kdaα-亚基和140kdaβ-亚基(ma等人，cancerandmetastasisreviews，22：309-325，2003)。c-met在结构上类似于其他膜受体诸如ron和。hgf：c-met结合的准确化学计量尚不清楚，但通常认为两个hgf分子结合于两个c-met分子，导致受体二聚化以及在1230、1234和1235位酪氨酸处自磷酸化(stamos等人，theembojournal，23：2325-2335，2004)。非配体依赖性c-met自磷酸化也可由于基因扩增、突变或受体过表达而发生。c-met在多种类型的癌(包括胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌和cns癌)中常常被扩增、突变或过表达。通常定位于激酶域的错义突变常见于遗传性乳头状肾细胞癌(prcc)和13％的散发性prcc(schmidt等人，oncogene18：2343-2350，1999)。定位于c-met的臂板蛋白或近膜域的c-met突变常见于胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、nsclc和甲状腺癌(ma等人，cancerandmetastasisreviews，22：309-325，2003；sakakura等人，chromosomesandcancer，1999，24：299-305)。已在脑癌、结肠直肠癌、胃癌和肺癌中检测到c-met扩增，这通常与疾病进展相关(ma等人，cancerandmetastasisreviews，22：309-325，2003)。分别多至4％和20％的非小细胞肺癌(nsclc)和胃癌表现出c-met扩增(sakakura等人，chromosomesandcancer，1999，24：299-305；sierra和tsao，therapeuticadvancesinmedicaloncology，3：s21-35，2011)。甚至在不存在基因扩增的情况下，通常在肺癌中观察到c-met过表达(ichimura等人，jpnjcancerres，87：1063-9，1996)。此外，在临床样品中，将近一半的肺腺癌表现出高水平的c-met和hgf，这两者均与增强的瘤生长速率、转移和不良预后相关(sierra和tsao，therapeuticadvancesinmedicaloncology，3：s21-35，2011；siegfried等人，annthoracsurg66：1915-8，1998)。抵抗egfr酪氨酸激酶抑制剂的所有瘤中的将近60％增加c-met表达、扩增c-met或增加其唯一已知配体hgf(turke等人，cancercell，17：77-88，2010)，表明存在通过c-met对egfr的补偿途径。在抵抗吉非替尼(一种egfr激酶抑制剂)并经her3途径表现出增强存活率的培养细胞中，c-met扩增被首次鉴定(engelman等人，science，316：1039-43，2007)。这进一步在临床样品中得到验证，其中具有对厄洛替尼或吉非替尼的获得性抗性的43名患者中有9名表现出c-met扩增，与之相比的是，62名未治疗患者中仅两名有此表现。九名治疗患者中有四名也获得了egfr激活突变t790m，证实为同步抗性途径(beat等人，procnatlacadsciusa，104：20932-7，2007)。egfr和c-met在癌中的单独作用已充分确立，使得这些靶标对于联合疗法具有吸引力。两个受体均通过相同的存活和抗凋亡途径(erk和akt)传导信号；因此，联合抑制该对受体可限制补偿途径激活的可能性，从而改善总体疗效。在(厄洛替尼)与nscl的抗c-met单价抗体联用(spigel等人，2011ascoannualmeetingproceedings，2011，journalofclinicaloncology：伊利诺伊州芝加哥(chicago，il.)，第7505页)以及tarceva(厄洛替尼)与arq-197(一种c-met小分子抑制剂)联用(adiei等人，oncologist，16：788-99，2011)的临床试验中测试了靶向egfr和c-met的联合疗法。联合疗法或双特异性抗egfr/c-met分子已例如在如下专利中公开：国际专利公开wo2008/127710、美国专利公开us20090042906、国际专利公开wo2009111691、国际专利公开wo2009126834、国际专利公开wo2010039248、国际专利公开wo2010115551。目前的拮抗egfr和/或c-met信号传导途径进行治疗的小分子和大分子治疗方法可能为次优的，这是由于可能缺少特异性、可能的脱靶活性以及小分子抑制剂可能遇到的剂量限制性毒性。典型的二价抗体可导致膜结合受体聚簇以及下游信号传导途径的非期望激活。单价抗体(半臂)对制造工艺带来了相当大的复杂性和成本。因此，对另外的单特异性和双特异性egfr和/或c-met抑制剂存在需要，以用于治疗和诊断目的两者。技术实现要素：本发明提供了一种分离的包含fn3域的双特异性分子，该分子包含第一iii型纤连蛋白(fn3)域和第二fn3域，其中第一fn3域特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr，并且第二fn3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met。本发明还提供了一种分离的包含fn3域的双特异性分子，该分子包含第一iii型纤连蛋白(fn3)域和第二fn3域，其中第一fn3域包含与seqidno：27的氨基酸序列至少87％相同的氨基酸序列，并且第二fn3域包含与seqidno：41的氨基酸序列至少83％相同的氨基酸序列。本发明还提供了包含结合egfr/c-met的fn3域的双特异性分子和包含结合egfr或c-met的fn3域的单特异性分子，该分子具有特定序列。本发明还提供了一种特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域，其中fn3域从基于seqidno：1的tencon氨基酸序列而设计的文库分离。本发明还提供了一种特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域。本发明还提供了一种编码本发明分子的分离的多核苷酸。本发明的另一个方面是包含本发明多核苷酸的载体。本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的载体。本发明还提供了一种制备双特异性分子的方法，该方法包括在使得双特异性分子得以表达的条件下温育本发明的分离的宿主细胞，以及纯化该双特异性分子。本发明还提供了一种包含本发明的分子和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供了一种治疗患有癌的受试者的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子或者结合egfr或c-met的fn3域并持续足以治疗癌的时间。附图说明图1a和1b：结合egfr的fn3域的氨基酸比对。在seqidno：18的第22-28位和第75-86位残基处对bc和fg环加框。一些变体包括改善热稳定性的l17a、n46k和e86i替换(残基根据tenconseqidno：1编号)。对p54ar4-83v2(seqidno：27)互补位残基加下划线(seqidno：27中的d23、f27、y28、v77、g85)。图2：tencon27支架(seqidno：99)与具有随机化c-cd-f-fg可供选择的表面的tcl14文库(seqidno：100)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示环和链。图3：结合c-met的fn3域的序列比对。c环和cd链以及f环和fg链被加框并且跨越第29-43位和第65-81位残基。对p114ar7p95-a3(seqidno：41)互补位残基加下划线(r34s、f38s、m72s和i79s)。图4：示出了在用包含fn3域的单特异性或双特异性分子预处理并用hgf刺激的h292细胞中c-met磷酸化的抑制。当与单独的单特异性的结合c-met的fn3域(p114ar5p74-a5，图中以a5示出)或联用结合egfr的fn3域(p54ar4-83v2，图中以83v2示出)相比时，观察到双特异性egfr/c-met分子(ecb1)的效力的大幅提高。图5：egfr和c-met磷酸化在用包含fn3域的单特异性或双特异性分子预处理的细胞中的抑制。在表达高水平的egfr的细胞系nci-h292(图5a)和h596(图5(b))中，包含fn3域的抗egfr单特异性和双特异性分子在减少egfr磷酸化方面效力相同。在表达相对于c-met而言低水平的egfr的细胞系h441(图5c)中，与单独的单特异性的结合egfr的fn3域相比，双特异性egfr/c-met分子改善了egfr磷酸化的抑制效力。在具有相对于egfr而言低水平的c-met的细胞系h292(图5d)和h596(图5e)中，与仅单特异性的结合c-met的fn3域相比，双特异性egfr/c-met分子显著增强了c-met磷酸化的抑制。该研究所用的分子是：双特异性ecb5(图中以17-a3示出)、单特异性的结合egfr的fn3域p53a1r5-17(图中以“17”示出)、双特异性egfr/c-met分子ecb3(图中以83-h9示出)以及单特异性的结合c-met的fn3域p114ar7p93-h9(图中以h9示出)。图6：从用双特异性egfr/c-met分子给药6h或72h的小鼠分离的瘤中的药效信号传导。所有分子在6h和72h时均显著减少了c-met、egfr和erk磷酸化，抑制的程度取决于fn3域对egfr和/或c-met的亲和力。双特异性分子通过如下方式生成：将具有高(图中的“83”是p54ar4-83v2)或中等(图中的“17v2”是p53a1r5-17v2)亲和力的结合egfr的fn3域连接到具有高(图中的“a3”是p114ar7p94-a3)或中等(图中的“a5”是p114ar5p74-a5)亲和力的结合c-met的fn3域。图7：示出了在ip给药后6h(左)和72h(右)连接到白蛋白结合域(abd)的可变亲和力的双特异性egfr/cmet分子的血浆(顶部)和瘤(底部)积聚。在用具有中等亲和力结合egfr的fn3域(17v2)或高亲和力egfr结合域(83v2)的双特异性分子给药的小鼠中，给药后六小时，瘤积聚达最大值。双特异性分子掺入了如下高或中等亲和力结合egfr或c-met的fn3域：83v2-a5-abd(ecb18；对egfr/cmet的亲和力为高/中等)83v2-a3-abd(ecb38；高/高)17v2-a5(ecb28；中等/中等)17v2-a3-abd(ecb39；中等/高)。在该图中，83v2是指p54ar4-83v2；17v2是指p53a1r5-17v2；a3是指p114ar7p94-a3并且a5是指p114ar5p74-a5。图8：h292-hgf移植瘤被植入scidbeige小鼠中。当瘤达到大约80mm3的平均体积时，每周用双特异性egfr/c-met分子(25mg/kg)或pbs媒介物给予小鼠三次。所有双特异性分子降低了瘤生长，瘤生长抑制(tgi)取决于分子对c-met和egfr的亲和力。(高egfr-高cmet是指p54ar4-83v2-p114ar7p94-a3(ecb38)；高egfr-中等cmet是指p54ar4-83v2-p114ar5p74-a5(ecb18)；中等egfr-高cmet是指p53a1r5-17v2-p114ar7p94-a3(ecb39)；中等egfr-中等-cmet是指p53a1r5-17-p114ar5p74-a5(ecb28))。图9：h292-hgf移植瘤被植入scidbeige小鼠中并且它们用不同疗法治疗。示出了疗法的抗瘤活性。(双特异性egfr/c-met分子是指p54ar4-83v2-p114ar7p94-a3-abd(ecb38)；其他疗法是克唑替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗，以及克唑替尼与厄洛替尼的组合)。具体实施方式如本文所用，术语“iii型纤连蛋白(fn3)域”(fn3域)是指在蛋白质中频繁出现的域，该蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(bork和doolittle，procnatacadsciusa，89：8990-8994，1992；meinke等人，jbacteriol175：1910-1918，1993；watanabe等人，jbiolchem265：15659-15665，1990)。示例性的fn3域是存在于人腱生蛋白c中的15种不同的fn3域、存在于人纤连蛋白(fn)中的15种不同的fn3域以及非天然的合成fn3域，如例如美国专利公开2010/0216708中所述。单独的fn3域通过域编号和蛋白质名称来表示，例如，腱生蛋白的第3fn3域(tn3)，或纤连蛋白的第10fn3域(fn10)。如本文所用，术语“替换”或“替换的”或“突变”或“突变的”是指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。如本文所用，术语“使随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“使多样化”是指在多核苷酸或多肽序列中进行至少一处替换、插入或缺失。如本文所用“变体”是指与参考多肽或参考多核苷酸的不同在于一种或多种修饰，例如替换、插入或缺失的多肽或多核苷酸。如本文所用，术语“特异性地结合”或“特异性结合”是指本发明的fn3域以约1×10-6m或更小、例如约1×10-7m或更小、约1×10-8m或更小、约1×10-9m或更小、约1×10-10m或更小、约1×10-11m或更小、约1×10-12m或更小或约1×10-13m或更小的离解常数(kd)结合预定抗原的能力。通常，如通过表面等离子共振使用例如proteon仪器(biorad)所测量，本发明的fn3域以比其对非特异性抗原(例如bsa或酪蛋白)的kd小至少十倍的kd结合预定抗原(即，egfr或c-met)。因此，本发明的含egfr/c-metfn3域的双特异性分子以对于egfr和c-met两者至少1×10-6m的结合亲和力(kd)特异性地结合至每个egfr和c-met。然而，特异性地结合至预定抗原的本发明的分离的fn3域可具有对其它相关抗原(例如对其它物种(同族体)的相同预定抗原)的交叉反应性。术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体组成。如本文所用，术语“稳定性”是指在生理条件下分子保持折叠状态以便其保持至少一种其正常功能活性例如结合于预定抗原诸如egfr或c-met的能力。如此处所用，“表皮生长因子受体”或“egfr”是指具有以seqidno：73和genbank登录号np_005219示出的序列的人egfr(也称为her-1或erb-b1(ullrich等人，nature，309：418-425，1984)以及其天然存在的变体。此类变体包括熟知的egfrviii和其他选择性剪接变体(例如，如通过如下swissprot登录号标识：p00533-1(野生型；与seaidno：73和np_005219相同)、p00533-2(f404l/l405s)、p00533-3(628-705：ctgpglegcp...geapnqallr→pgneslkaml...sviitassch且706-1210缺失)、p00533-4(c628s且629-1210缺失)、变体q98、r266、k521、i674、g962和p988(livingston等人，niehs-snps，环境基因组计划(environmentalgenomeproject)，niehses15478)、t790m、l858r/t790m和del(e746，a750))。如本文所用，“egfr配体”涵盖egfr的所有(例如，生理)配体，包括egf、tgf-α、肝素结合egf(hb-egf)、双调蛋白(ar)和上皮调节蛋白(epi)。如本文所用，“表皮生长因子”(egf)是指具有以seqidno：74示出的氨基酸序列的熟知53氨基酸人egf。如本文所用，“肝细胞生长因子受体”或“c-met”是指具有以seqidno：101或genbank登录号np_001120972示出的氨基酸序列的人c-met以及其天然变体。如本文所用，“肝细胞生长因子”(hgf)是指具有以seqidno：102示出的氨基酸序列的熟知人hgf，其被裂解以形成由二硫键连接的α和β链的二聚体。如本文可互换使用的“阻碍结合”或“抑制结合”是指本发明的fn3域或包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子阻碍或抑制egfr配体结合(诸如egf与egfr结合和/或hgf与c-met结合)的能力，并且涵盖部分和完全阻碍/抑制两者。本发明的fn3域或包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子对egfr配体(诸如egf与egfr结合和/或hgf与c-met结合)的阻碍/抑制，与egfr配体结合于egfr和/或hgf结合于c-met而不受阻碍或抑制相比，部分或完全降低了egfr信号传导和/或c-met信号传导的正常水平。当抑制为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％时，本发明的fn3域或包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子“阻碍”egfr配体诸如egf结合于egfr和/或hgf结合于c-met。结合的抑制可使用熟知的方法测量，例如使用facs并且使用本文所述的方法测量暴露于fn3域、本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的表达egfr的a431细胞上生物素酰化egf的结合的抑制，或使用熟知的方法和本文所述的方法测量c-met细胞外域上生物素酰化hgf的结合的抑制。术语“egfr信号传导”是指egfr配体结合于egfr所诱导的信号转导，导致egfr中的至少一个酪氨酸残基的自磷酸化。示例性的egfr配体是egf。如本文所用，“中和egfr信号传导”是指本发明的fn3域将egfr配体诸如egf所诱导的egfr信号传导抑制至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的能力。术语“c-met信号传导”是指hgf结合于c-met所诱导的信号转导，导致c-met中的至少一个酪氨酸残基的自磷酸化。通常，在hgf结合时，在位置1230、1234、1235或1349处的至少一个酪氨酸残基被自磷酸化。如本文所用，“中和c-met信号传导”是指本发明的fn3域将hgf所诱导的c-met信号传导抑制至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的能力。如本文可互换使用的“过表达”和“过表达的”是指与相同组织类型的正常细胞相比，癌细胞或恶性细胞在表面上具有可测量地更高水平的egfr和/或c-met。这种过表达可由基因扩增或由增加的转录或翻译引起。可使用熟知的测定法，利用例如elisa、免疫荧光、流式细胞术或放射免疫测定法对活细胞或裂解细胞测量egfr和/或c-met表达和过表达。作为另外一种选择或除此以外，可例如使用荧光原位杂交、dna印迹或pcr技术在细胞中测量编码egfr和/或c-met的核酸分子的水平。当与正常细胞相比，细胞的表面上的egfr和/或c-met的水平高至少1.5倍时，egfr和/或c-met被过表达。如本文所用，“tencon”是指具有以seqidno：1示出的序列并且在美国专利公开no.us20100216708中所公开的。如本文所用，“癌细胞”或“瘤细胞”是指体内、离体或组织培养物中的癌变细胞、癌前细胞或转化细胞，其具有不一定涉及新遗传物质摄入的自发或诱导表型变化。虽然转化可由感染转化病毒和掺入新基因组核酸或摄入外源核酸引起，但也可自发引起或在暴露于致癌物之后引起，从而使内源基因突变。转化/癌被示例为例如合适动物宿主诸如裸小鼠体外、体内和离体的形态学变化、细胞永生化、异常细胞控制、病灶形成、增殖、恶性化、瘤特异性标记水平、侵袭性、瘤生长或抑制(freshney，cultureofanimalcells：amanualofbasictechnique(第3版1994))。术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是dna或rna分子或这些分子的杂合分子。术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链dna和单链dna以及双链rna和单链rna是多核苷酸的典型例子。术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于约50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。如本文所用，术语“双特异性egfr/c-met分子”或“包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子”是指包含结合egfr的fn3域和不同的结合c-met的fn3域的分子，这两个域直接或经由接头共价连接在一起。示例性的结合egfr/c-met的双特异性分子包含特异性地结合egfr的第一fn3域以及特异性地结合c-met的第二fn3域。如本文所用，“价”是指分子中存在对抗原具有特异性的指定数量的结合位点。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”是指分子中分别存在对抗原具有特异性的一个、两个、四个和六个结合位点。如本文所用，“混合物”是指未共价连接在一起的两个或更多个fn3域的样品或制备物。混合物可由两个或更多个相同的fn3域或不同的fn3域组成。物质的组成本发明提供了包含结合egfr和/或c-met的fn3域的单特异性和双特异性分子。本发明提供了编码本发明fn3域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。结合egfr的单特异性分子本发明提供了iii型纤连蛋白(fn3)域，其特异性地结合于表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr，从而可广泛用于治疗和诊断应用。本发明提供编码本发明fn3域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。本发明的fn3域以高亲和力结合egfr并抑制egfr信号传导，并且可提供与小分子egfr抑制剂相比在特异性和降低的脱靶毒性方面的有益效果，以及与常规抗体治疗剂相比改善的组织渗透性。本发明还提供了一种特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域。在采用a431细胞并在与或不与本发明fn3域一起温育的情况下使用600nm链霉亲和素-藻红蛋白缀合物检测来自a431细胞上的结合生物素酰化egf的荧光量的竞争测定法中，本文所述的本发明的fn3域可以小于约1×10-7m、小于约1×10-8m、小于约1×10-9m、小于约1×10-10m、小于约1×10-11m或小于约1×10-12m的ic50值阻碍egf结合于egfr。示例性的fn3域可以约1×10-9m至约1×10-7m之间的ic50值阻碍egf结合于egfr，诸如具有seqidno：18-29、107-110或122-137的氨基酸序列的结合egfr的fn3域。与在不存在本发明fn3域的情况下使用相同的测定法条件时egf对egfr的结合相比，本发明的fn3域可将egf对egfr的结合阻碍至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。与在不存在本发明fn3域的情况下使用相同的测定法条件时的信号传导水平相比，本文所述的本发明的fn3域可将egfr信号传导抑制至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。配体诸如egf与egfr的结合刺激受体二聚化、自磷酸化、受体的内部细胞质酪氨酸激酶域的激活，以及多个参与dna合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的调控的信号转导和反式激活途径的引发。egfr信号传导的抑制可导致一个或多个egfr下游信号传导途径受抑制，因此中和egfr可具有各种效应，包括细胞增殖和分化、血管生成、细胞运动和转移的抑制。egfr信号传导可使用各种熟知的方法测量，例如测量受体在酪氨酸y1068、y1148和y1173中任一者处的自磷酸化(downward等人，nature，311：483-5，1984)和/或天然或合成底物的磷酸化。磷酸化可使用熟知的方法检测，诸如采用磷酸化酪氨酸特异性抗体的elisa测定法或蛋白质印迹。示例性的测定法可见于panek等人，jpharmacolexpthera，283：1433-44，1997和batley等人，lifesci，62：143-50，1998以及本文所述的测定法。在本文所述的一些实施例中，当在a431细胞中使用50ng/ml人egf测量时，本发明的fn3域以小于约2.5×10-6m，例如小于约1×10-6m、小于约1×10-7m、小于约1×10-8m、小于约1×10-9m、小于约1×10-10m、小于约1×10-11m或小于约1×10-12m的ic50值抑制在egfr残基位置第1173位酪氨酸处egf诱导的egfr磷酸化。在本文所述的一些实施例中，当在a431细胞中使用50ng/ml人egf测量时，本发明的fn3域以在约1.8×10-8m至约2.5×10-6m之间的ic50值抑制在egfr残基位置第1173位酪氨酸处egf诱导的egfr磷酸化。此类示例性的fn3域是具有seqidno：18-29、107-110或122-137的氨基酸序列的那些。在本文所述的一些实施例中，如通过表面等离子共振或kinexa方法所测定，如本领域技术人员所实践，本发明的fn3域以小于约1×10-8m，例如小于约1×10-9m、小于约1×10-10m、小于约1×10-11m、小于约1×10-12m或小于约1×10-13m的离解常数(kd)结合人egfr。在一些实施例中，本发明的fn3域以约2×10-10至约1×10-8m的kd结合人egfr。fn3域对egfr的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。(参见例如，berzofsky等人，“antibody-antigeninteractions(抗体-抗原相互作用)”，载于fundamentalimmunology，paul，w.e.编辑，纽约州纽约的乌鸦出版社(ravenpress：newyork，ny)(1984)；kuby，janis，immunology，w.h.freemanandcompany：newyork，ny(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、ph)下测量，特定fn3域-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其它抗原-结合参数(例如，kd、kon、koff)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准溶液，以及标准缓冲液，诸如本文所述的缓冲液进行。示例性的结合egfr的本发明fn3域包括seqidno：18-29、107-110或122-137的fn3域。在本文所述的一些实施例中，特异性地结合egfr的fn3域包含与seqidno：27的氨基酸序列至少87％相同的氨基酸序列。在本文所述的一些实施例中，特异性地结合egfr的fn3域包含fg环，该fg环包含序列hnvykdtnx9rgl(seqidno：179)或序列lgsyvfehdvml(seqidno：180)，其中x9为m或i；和bc环，该bc环包含序列x1x2x3x4x5x6x7x8(seqidno：181)；其中x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；并且x8为y、f或l。本文所述的特异性地结合egfr并抑制egfr的自磷酸化的本发明的fn3域可包含作为结构特征的fg环，该fg环包含序列hnvykdtnx9rgl(seqidno：179)或序列lgsyvfehdvml(seqidno：180)，其中x9为m或i。此类fn3域还可包含8或9个氨基酸长并由序列x1x2x3x4x5x6x7x8(seqidno：181)限定的bc环，并且当在a431细胞中使用50ng/ml人egf测量时，以小于约2.5×10-6m的ic50值，或约1.8×10-8m至约2.5×10-6m的ic50值抑制egfr自磷酸化。本文所述的特异性地结合egfr并抑制egfr的自磷酸化的本发明fn3域还包含如下序列：lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnx9rglplsaeftt(seqidno：182)，或序列lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvlgsyvfehdvmlplsaeftt(seqidno：183)，其中x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；x8为y、f或l；并且x9为m或i。可使用熟知的方法和本文所述的方法生成本文所述的结合egfr的fn3域并测试其抑制egfr自磷酸化的能力。本发明还提供了一种特异性地结合egfr的分离的fn3域，其中fn3域包含以seqidno：18-29、107-110、122-137或194-211示出的序列。在本文所述的一些实施例中，结合egfr的fn3域包含连接到特定fn3域的n端的起始子甲硫氨酸(met)或连接到特定fn3域的c端的半胱氨酸(cys)，例如以有利于半衰期延长分子的表达和/或缀合。本发明还提供了一种特异性地结合egfr并阻碍egf结合于egfr的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域，其中fn3域从基于seqidno：1的tencon序列而设计的文库分离。本发明还提供了一种特异性地结合egfr并阻碍egf结合于egfr的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域，其中fn3域以对应于p54ar4-83v2(seqidno：27)的残基d23、f27、y28、v77和g85的一个或多个氨基酸残基结合egfr。有助于fn3域结合至egfr的氨基酸残基可利用诸如诱变的方法和通过晶体结构评估结合残基/表面来识别。结合egfr的fn3域p54ar4-83v2(seqidno：27)中的残基d23、f27、y28、v77、g85处的替换将结合至fn3域的egfr减少100倍以上。结合egfr的fn3域p54ar4-48、p54ar4-81、p53a1r5-17v2、p54ar4-83v22和p54ar4-83v23共享这些残基并且可预期以相同互补位残基作为p54ar4-83v2结合至egfr。其它结合egfr的fn3域可通过如下方式形成：将位置d23、f27、y28、v77、g85保持恒定，同时改变位于bc和fg环的其它位置(位置24、25、75、76、78、79、80、81、82、83、84和86)的氨基酸。这些变化可通过在特定位置处设计特异性氨基酸或通过将这些位置掺入文库来进行，该文库用随机氨基酸替换这些位点。以此类方式涉及的新fn3域可用于筛选或选择最优化的性质，诸如egfr结合、溶解度、稳定性、免疫原性或血清半衰期。单特异性的结合c-met的分子本发明还提供了iii型纤连蛋白(fn3)域，其特异性地结合于肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met，从而可广泛用于治疗和诊断应用。本发明提供编码本发明fn3域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。本文所述的本发明的fn3域以高亲和力结合c-met并抑制c-met信号传导，并且可提供与小分子c-met抑制剂相比在特异性和降低的脱靶毒性方面的有益效果，以及与常规抗体治疗剂相比改善的组织渗透性。本发明的fn3域是单价的，因此防止了其他二价分子可能出现的不期望的受体聚簇和激活。本发明还提供了特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域。在检测在存在本发明fn3域的情况下对生物素酰化hgf结合于c-met-fc融合蛋白的抑制的测定法中，本文所述的本发明的fn3域可以小于约1×10-7m、小于约1×10-8m、小于约1×10-9m、小于约1×10-10m、小于约1×10-11m或小于约1×10-12m的ic50值阻碍hgf结合于c-met。示例性的fn3域可以约2×10-10m至约6×10-8m之间的ic50值阻碍hgf结合于c-met。与在不存在本发明的fn3域的情况下使用相同测定法条件时hgf对c-met的结合相比，本发明的fn3域可将hgf结合于c-met阻碍至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。与在不存在本发明fn3域的情况下使用相同的测定法条件时的信号传导水平相比，本文所述的本发明的fn3域可将c-met信号传导抑制至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。hgf与c-met的结合刺激受体二聚化、自磷酸化、受体的内部细胞质酪氨酸激酶域的激活，以及多个参与dna合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的调控的信号转导和反式激活途径的引发。c-met信号传导的抑制可导致一个或多个c-met下游信号传导途径受抑制，因此中和c-met可具有各种效应，包括细胞增殖和分化、血管生成、细胞运动和转移的抑制。c-met信号传导可使用各种熟知的方法测量，例如测量受体在至少一个酪氨酸残基y1230、y1234、y1235或y1349上的自磷酸化，和/或天然或合成底物的磷酸化。可例如在elisa测定法中或在蛋白质印迹上使用对磷酸化酪氨酸具有特异性的抗体来检测磷酸化。酪氨酸激酶活性的测定法(panek等人，jpharmacolexpthera，283：1433-44，1997；batley等人，lifesci，62：143-50，1998)以及本文所述的测定法。在本文所述的一些实施例中，当在nci-h441细胞中使用100ng/ml重组人hgf测量时，本发明的fn3域以小于约1×10-6m、小于约1×10-7m、小于约1×10-8m、小于约1×10-9m、小于约1×10-10m、小于约1×10-11m或小于约1×10-12m的ic50值抑制在c-met残基位置1349处hgf诱导的c-met磷酸化。在本文所述的一些实施例中，当在nci-h441细胞中使用100ng/ml重组人hgf测量时，本发明的fn3域以在约4×10-9m至约1×10-6m之间的ic50值抑制在c-met酪氨酸y1349处hgf诱导的c-met磷酸化。在本文所述的一些实施例中，如通过表面等离子共振或kinexa方法所测定，如本领域技术人员所实践，本发明的fn3域以等于或小于约1×10-7m、1×10-8m、1×10-9m、1×10-10m、1×10-11m、1×10-12m、1×10-13m、1×10-14m或1×10-15m的离解常数(kd)结合人c-met。在一些实施例中，本发明的fn3域以约3×10-10m至约5×10-8m的kd结合人c-met。fn3域对c-met的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。(参见例如，berzofsky等人，“antibody-antigeninteractions”，载于fundamentalimmunology，paul，w.e.编辑，ravenpress：newyork，ny(1984)；kubv，janis，immunology，w.h.freemanandcompany：newyork，ny(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、ph)下测量，特定fn3域-抗原相互作用的所测量的亲和力可变化。因此，亲和力和其它抗原-结合参数(例如，kd、kon、koff)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准溶液，以及标准缓冲液，诸如本文所述的缓冲液进行。示例性的结合c-met的本发明fn3域包括具有seqidno：32-49、111-114或212-223的氨基酸序列。在本文所述的一些实施例中，特异性地结合c-met的fn3域包含与seqidno：41的氨基酸序列至少83％相同的氨基酸序列。在本文所述的一些实施例中，特异性地结合c-met的fn3域包含c链和cd环，该c链和cd环包含序列dsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16(seqidno：184)，其中x10为w、f或v；x11为d、f或l；x12为v、f或l；x13为v、l或t；x14为v、r、g、l、t或s；x15为g、s、a、t或k；并且x16为e或d；和f链和fg环，该f链和fg环包含序列teyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23(seqidno：185)，其中x17为y、w、i、v、g或a；x18为n、t、q或g；x19为l、m、n或i；x20为g或s；x21为s、l、g、y、t、r、h或k；x22为i、v或l；并且x23为v、t、h、i、p、y或l。本文所述的特异性地结合c-met并抑制c-met的自磷酸化的本发明fn3域还包含如下序列：lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16aivltvpgsersydltglkpgteyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23plsaeftt(seqidno：186)，其中x10为w、f或v；并且x11为d、f或l；x12为v、f或l；x13为v、l或t；x14为v、r、g、l、t或s；x15为g、s、a、t或k；x16为e或d；x17为y、w、i、v、g或a；x18为n、t、q或g；x19为l、m、n或i；x20为g或s；x21为s、l、g、y、t、r、h或k；x22为i、v或l；并且x23为v、t、h、i、p、y或l。本发明还提供了一种特异性地结合c-met的分离的fn3域，其中fn3域包含以seqidno：32-49或111-114示出的序列。本发明还提供了一种特异性地结合c-met并阻碍hgf结合于c-met的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域，其中fn3域从基于seqidno：1的tencon序列而设计的文库分离。本发明还提供了一种特异性地结合c-met并阻碍hgf结合于c-met的分离的iii型纤连蛋白(fn3)域，其中fn3域以对应于p114ar7p95-a3(seqidno：41)中的残基r34、f38、m72和i79的一个或多个氨基酸残基结合c-met。有助于fn3域结合至c-met的氨基酸残基可利用诸如诱变的方法和通过晶体结构评估结合残基/表面来识别。结合c-met的fn3域p114ar7p95-a3(seqidno：27)中的残基r34s、f38s、m72s和i79s处的替换将结合至fn3域的c-met减少100倍以上。结合c-met的fn3域分子p114ar7p92-f3、p114ar7p95-d3、p114ar7p95-f10和p114ar7p95-h8共享这些残基并且可预期以相同互补位残基作为p114ar7p95-a3结合至c-met。其它结合c-met的fn3域可通过如下方式形成：将位置r34s、f38s、m72s和i79s保持恒定，同时改变位于c链、f链、cd环和/fg环的其它位置(位置32、36、39、40、68、70、78和81)的氨基酸。这些变化可通过在特定位置处设计特异性氨基酸或通过将这些位置掺入文库来进行，该文库用随机氨基酸替换这些位点。以此类方式设计的新fn3域可用于筛选或选择最优化的性质，诸如c-met结合、溶解度、稳定性、免疫原性或血清半衰期。结合egfr或c-met的fn3域从基于tencon序列的文库的分离tencon(seqidno：1)是由来自人腱生蛋白-c的十五个fn3域的共有序列而设计的非天然存在的iii型纤连蛋白(fn3)域(jacobs等人，proteinengineering，design，andselection，25：107-117，2012；美国专利公开2010/0216708)。tencon的晶体结构显示连接七条β-链的六个表面外露的环，这是fn3域所特有的，该β-链称为a、b、c、d、e、f和g，并且该环称为ab、bc、cd、de、ef和fg环(bork和doolittle，procnatlacadsciusa，89：8990-8992，1992；美国专利6,673,901)。这些环或每个环内的所选残基可被随机化以便构建iii型纤连蛋白(fn3)域的文库，该文库可用于选择结合egfr或c-met的新型分子。表1示出了tencon(seqidno：1)中的每个环和β-链的位置和序列。基于tencon序列而设计的文库可因此具有随机化fg环或随机化bc和fg环，诸如如下所述的文库tcl1或tcl2。tenconbc环为7个氨基酸长，因此在bc环处多样化并基于tencon序列而设计的文库中，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可被随机化。tenconfg环为7个氨基酸长，因此在fg环处多样化并基于tencon序列而设计的文库中，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可被随机化。在tencon文库中的环处的进一步多样性可通过环处的残基的插入和/或缺失来实现。例如，fg和/或bc环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。tencon中的fg环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中相应环的范围为4-28个残基。为提供最大的多样性，fg环可在序列以及长度方面被多样化以对应于4-28个残基的抗体cdr3长度范围。例如，fg环可进一步通过将环延伸另外1、2、3、4或5个氨基酸而在长度方面被多样化。基于tencon序列而设计的文库也可具有随机化可供选择的表面，该表面形成于fn3域的侧面上并且包含两条或更多条β链以及至少一个环。一种此类可供选择的表面由c和fβ-链以及cd和fg环中的氨基酸形成(c-cd-f-fg表面)。基于tencon可供选择的c-cd-f-fg表面的文库设计示于图1中，并且此类文库的详细生成描述于美国专利公开us20130226834中。基于tencon序列而设计的文库也包括基于tencon变体而设计的文库，该tencon变体诸如为在残基位置11、14、17、37、46、73或86(残基编号对应于seqidno：1)处具有替换的tencon变体，并且该变体表现出改善的热稳定性。示例性的tencon变体描述于美国专利公开2011/0274623，并且包括与seqidno：1的tencon相比具有替换e11r、l17a、n46v和e86i的tencon27(seqidno：99)。表1：可使用随机或限定组的氨基酸在所选残基位置处将基于tencon和其他fn3序列的文库随机化。例如，可使用nnk密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机替换的文库中的变体。在其它多样化方案中，dvk密码子可用于编码氨基酸ala、trp、tyr、lys、thr、asn、lys、ser、arg、asp、glu、gly和cys。另选地，nns密码子可用于产生所有20种氨基酸残基并同时降低终止密码子的频率。可例如使用technology(http：_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置具有偏向氨基酸分布的fn3域。这种技术使用预先制备的双链三体的文库，其用作对于成千上万的基因合成工艺而言为足够的通用构建模块。该三体文库代表对构建任何期望的dna分子所必需的所有可能的序列组合。密码子命名是根据熟知的iub密码的。本文所述的本发明的特异性地结合egfr或c-met的fn3域可通过如下方式产生fn3文库诸如tencon文库来分离：使用顺式展示将编码支架蛋白质的dna片段连接到编码repa的dna片段以生成体外翻译后形成的蛋白质-dna复合物集合(pool)，其中每种蛋白质与编码其的dna稳定地相关联(美国专利7,842,476；odegrip等人，procnatlacadsciusa，101，2806-2810，2004)，并且通过本领域已知及实例中所述的任何方法测定文库对egfr和/或c-met的特异性结合。可使用的示例性熟知的方法为elisa、夹心免疫测定以及竞争性和非竞争性测定(参见例如，ausubel等人编辑，1994，currentprotocolsinmolecularbiology，第1卷，johnwiley&sons，inc.，newyork)。使用本文所述的方法，针对其阻碍egfr配体诸如egf结合于egfr或hgf结合于c-met的能力以及其抑制egfr和/或c-met信号传导的能力，进一步表征了所鉴定的特异性地结合egfr或c-met的fn3域。可通过如下方式生成如本文所述的本发明的特异性地结合于egfr或c-met的fn3域：使用任何fn3域作为模板来生成文库，以及使用本文中提供的方法从文库筛选特异性结合egfr或c-met的分子。可使用的示例性fn3域是腱生蛋白c的第三fn3域(tn3)(seqidno：75)、fibcon(seqidno：76)以及纤连蛋白的第十fn3域(fn10)(seqidno：77)。标准的克隆和表达技术用于将文库克隆进载体或合成文库的双链cdna盒以在体外表达或翻译文库。例如，可使用核糖体展示(hanes和pluckthun，procnatlacadsciusa，94，4937-4942，1997)、mrna展示(roberts和szostak，procnatlacadsciusa，94，12297-12302，1997)或其他无细胞系统(美国专利5,643,768)。fn3域变体的文库可表达为展示在例如任何合适的噬菌体的表面上的融合蛋白。用于在噬菌体的表面上展示融合多肽的方法是熟知的(美国专利公开2011/0118144；国际专利公开wo2009/085462；美国专利6,969,108；美国专利6,172,197；美国专利5,223,409；美国专利6,582,915；美国专利6,472,147)。本文所述的本发明的特异性地结合egfr或c-met的fn3域可被修饰以改善其性质，诸如改善热稳定性以及热折叠和解折叠的可逆性。多种方法已应用于增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、对盐桥进行工程改造、蛋白质表面电荷的改变、定向进化和共有序列的构成(lehmann和wyss，curropinbiotechnol，12，371-375，2001)。高度的热稳定性可增加所表达蛋白的产量、改善溶解度或活性、降低免疫原性并且使生产中对冷链的需要最小化。可被替换以改善tencon(seqidno：1)的热稳定性的残基是残基位置11、14、17、37、46、73或86，并且描述于美国专利公开2011/0274623中。对应于这些残基的替换可被掺入本发明的fn3域或包含fn3域的双特异性分子中。本发明还提供了一种特异性地结合egfr并阻碍egf结合于egfr的分离的fn3域，其包含以seqidno：18-29、107-110、122-137示出的序列，还包含在与tencon(seqidno：1)中的位置11、14、17、37、46、73和86对应的一个或多个残基位置处的替换。本发明还提供了一种特异性地结合c-met并阻碍hgf结合于c-met的分离的fn3域，其包含以seqidno：32-49或111-114示出的序列，还包含在与tencon(seqidno：1)中的位置11、14、17、37、46、73和86对应的一个或多个残基位置处的替换。示例性的替换是替换e11n、e14p、l17a、e37p、n46v、g73y和e86i(根据seqidno：1编号)。在一些实施例中，本发明的fn3域包含与tencon(seqidno：1)中的替换l17a、n46v和e86i对应的替换。本文所述的特异性地结合egfr的fn3域(图1)具有与tencon(seqidno：1)相比延伸的fg环。因此，与tencon(seqidno：1)中的残基11、14、17、37、46、73和86对应的残基是图1a和1b所示的egfrfn3域中的残基11、14、17、37、46、73和91，但例外的是seqidno：24的fn3域，其中对应残基是残基11、14、17、38、74和92，这是由于bc环中插入了一个氨基酸。本发明还提供了一种特异性地结合egfr并阻碍egf结合于egfr的分离的fn3域，其包含以seqidno：18-29、107-110、122-137或194-211示出的氨基酸序列，任选地具有与tencon(seqidno：1)中的替换l17a、n46v和e86i对应的一个、两个或三个替换。本发明还提供了一种特异性地结合c-met并阻碍hgf结合于c-met的分离的fn3域，其包含以seqidno：32-49、111-114或212-223示出的氨基酸序列，任选地具有与tencon(seqidno：1)中的替换l17a、n46v和e86i对应的一个、两个或三个替换。蛋白稳定性和蛋白易变性的测量可视为蛋白完整性的相同或不同方面。蛋白对由热、由紫外线或电离辐射、环境同渗容摩和ph(如果在液体溶液中)的变化、由小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外线辐射、电离辐射(诸如由γ辐射)、化学或热脱水或任何其它可造成蛋白结构破坏的作用或力引起的变性敏感或“易变”。可使用标准方法测定分子的稳定性。例如，可通过使用标准方法测量热解链(“tm'’)温度，即一半的分子变为解折叠的以摄氏度(℃)表示的温度来测定分子的稳定性。通常，tm越高，分子越稳定。除了热之外，化学环境也改变蛋白的稳定性以保持特定的三维结构。在本文所述的一些实施例中，由tm的增加所测量，与工程改造之前的相同域相比，本发明的结合egfr或c-met的fn3域表现出稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。可通过多种方法同样地测量化学变性。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、脲、丙酮、有机溶剂(dmf、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫苯和氢化物，诸如硼氢化钠)、非离子和离子型去污剂、酸(例如盐酸(hcl)、乙酸(ch3cooh)、卤代乙酸)、疏水分子(例如，磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可依赖于功能特性的丧失，诸如结合靶分子的能力，或通过物理化学特性定量，诸如聚集的趋势、先前溶剂不可及残基的暴露或二硫键的破坏或形成。在本文所述的一些实施例中，如通过使用盐酸胍作为化学变性剂所测量，与工程改造之前的相同支架相比，本发明的结合egfr或c-met的fn3域表现出稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。使用熟知的方法，在用增加浓度的盐酸胍处理后，增加的稳定性可测量为降低的色氨酸荧光的函数。本文所述的本发明的fn3域可作为单体、二聚体或多聚体产生，例如作为增加化合价和因此靶分子结合的亲和力的手段，或产生同时结合两种或多种不同的靶分子双特异性或多特异性支架的手段。二聚体和多聚体可通过连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质支架来产生，例如，通过纳入氨基酸接头，例如含有聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸的接头。示例性的接头包括(gs)2(seqidno：78)、(gggs)2(seqidno：224)、(ggggs)5(seqidno：79)、(ap)2(seqidno：80)、(ap)5(seqidno：81)、(ap)10(seqidno：82)、(ap)20(seqidno：83)和a(eaaak)5aaa(seqidno：84)。二聚体和多聚体可彼此以n到c方向连接。使用天然存在的以及人工肽接头将多肽连接成新型连接的融合多肽在文献中为熟知的(hallewell等人，jbiolchem，264，5260-5268，1989；alfthan等人，proteineng.，8，725-731，1995；robinson&sauer，biochemistry，35，109-116，1996；美国专利5,856,456)。双特异性的结合egfr/c/met的分子本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可提供与小分子egfr抑制剂相比在特异性和降低的脱靶毒性方面的有益效果，以及与常规抗体治疗剂相比改善的组织渗透性。本发明至少部分地基于这样令人惊讶的发现：当与结合egfr和结合c-met的fn3域的混合物相比时，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子提供显著改善的协同抑制效应。分子可被调制为对于egfr和c-met两者具有特定亲和力，以使瘤渗透和潴留最大化。与西妥昔单抗相比，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子提供egfr和/或c-met信号传导途径的更有效抑制并更有效地抑制瘤生长。本发明还提供了一种分离的包含fn3域的双特异性分子，其包含第一iii型纤连蛋白(fn3)域和第二fn3域，其中第一fn3域特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr，并且第二fn3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met。本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可通过如下方式生成：将本发明的任何结合egfr的fn3域和任何结合c-met的fn3域直接地或经由接头共价连接。因此，双特异性分子的第一fn3域可具有如上对于结合egfr的fn3域所述的特性，并且双特异性分子的第二fn3域可具有如上对于结合c-met的fn3域所述的特性。在本文所述的一些实施例中，当在a431细胞中使用50ng/ml人egf测量时，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的第一fn3域以小于约2.5×10-6m的ic50值抑制在egfr残基第1173位酪氨酸处egf诱导的egfr磷酸化，并且当在nci-h441细胞中使用100ng/ml人hgf测量时，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的第二fn3域以小于约1.5×10-6m的ic50值抑制在c-met残基第1349位酪氨酸处hgf诱导的c-met磷酸化。在本文所述的一些实施例中，当在nci-h292细胞中使用50ng/ml人egf测量时，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的第一fn3域以约1.8×10-8m至约2.5×10-6m的ic50值抑制在egfr残基第1173位酪氨酸处egf诱导的egfr磷酸化，并且当在nci-h441细胞中使用100ng/ml人hgf测量时，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的第二fn3域以在约4×10-9m至约1.5×10-6m之间的ic50值抑制在c-met残基第1349位酪氨酸处hgf诱导的c-met磷酸化。在本文所述的一些实施例中，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的第一fn3域以小于约1×10-8m的离解常数(kd)结合人egfr，并且包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的第二fn3域以小于约5×10-8m的kd结合人c-met。在本文所述的结合egfr和c-met两者的双特异性分子中，第一fn3域以约2×10-10至约1×10-8m的kd结合人egfr，并且第二fn3域以约3×10-10至约5×10-8m的kd结合人c-met。双特异性egfr/c-met分子对于egfr和c-met的亲和力可如实例3和实例5中对于单特异性分子所述来测定。在采用a431细胞并在与或不与第一fn3域一起温育的情况下使用600nm链霉亲和素-藻红蛋白缀合物检测来自a431细胞上的结合生物素酰化egf的荧光量的测定法中，本发明的双特异性egfr/c-met分子中的第一fn3域可以约1×10-9m至约1.5×10-7m的ic50值阻碍egf结合于egfr。与在不存在第一fn3域的情况下使用相同测定法条件时egf对egfr的结合相比，本发明的双特异性egfr/c-met分子中的第一fn3域可将egf对egfr的结合阻碍至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在检测在存在第二fn3域的情况下对生物素酰化hgf结合于c-met-fc融合蛋白的抑制的测定法中，本发明的双特异性egfr/c-met分子中的第二fn3域可以约2×10-10m至约6×10-8m的ic50值阻碍hgf结合于c-met。与在不存在第二fn3域的情况下使用相同的测定法条件时hgf对c-met的结合相比，双特异性egfr/c-met分子中的第二fn3域可将hgf对c-met的结合阻碍至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。与在不存在本发明的双特异性egfr/c-met分子的情况下使用相同的测定法条件时信号传导的水平相比，本文所述的本发明的双特异性egfr/c-met分子可将egfr和/或c-met信号传导抑制至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可使用如上对于单特异性分子所述的各种熟知方法测量egfr和c-met信号传导。与第一fn3域和第二fn3域的混合物所观察到的协同抑制相比，包含特异性地结合egfr的第一fn3域和特异性地结合c/met的第二fn3域的本文所述的本发明双特异性egfr/c-met分子提供egfr和c-met信号传导及瘤细胞增殖的显著增强的协同抑制。可例如通过测量包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子及两种单特异性分子(一种结合egfr，而另一种结合c-met)的混合物对erk磷酸化的抑制，来评估协同抑制。本发明的双特异性egfr/c-met分子可以与两种单特异性fn3域的混合物的ic50值相比小至少约100倍、例如小至少500、1000、5000或10,000倍的ic50值抑制erk磷酸化，指示与两种单特异性fn3域的混合物相比，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子效力增强至少100倍。示例性的包含egfr-c-metfn3域的双特异性分子可以约5×10-9m或更小的ic50值抑制erk磷酸化。可使用标准方法和本文所述的方法来测量erk磷酸化。本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可以与第一fn3域和第二fn3域的混合物对nci-h292细胞生长的抑制的ic50值相比小至少30倍的ic50值抑制nci-h292细胞增殖，其中用包含10％的fbs且补充有7.5ng/ml的hgf的培养基诱导细胞增殖。本文所述的本发明的双特异性分子可以与第一fn3域和第二fn3域的混合物对瘤细胞增殖的抑制的ic50值相比小约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800或约1000倍的ic50值抑制瘤细胞增殖。可使用标准方法和本文所述的方法来测量瘤细胞增殖的抑制。在本文所述的一些实施例中，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子以对应于p54ar4-83v2(seqidno：27)的残基d23、f27、y28、v77和g85的一个或多个氨基酸残基结合egfr。在本文所述的一些实施例中，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子以对应于p114ar7p95-a3(seqidno：41)中的残基r34、f38、m72和i79的一个或多个氨基酸残基结合c-met。双特异性分子中的互补位残基可通过诱变研究或根据fn3域和egfr或c-met的共晶体结构来识别。诱变研究可通过例如使用丙氨酸扫描来采用，并且利用标准方法可测试所得变体至egfr或c-met的结合。通常，互补位残基为在突变时导致具有减少或消除对egfr或c-met的结合的那些残基。当与野生型p54ar4-83v2相比时，具有在对应于p54ar4-83v2(seqidno：27)的残基d23、f27、y28、v77和g85的氨基酸残基位置处的替换的结合egfr的fn3域在替换时减少egfr结合至少100倍。双特异性分子ecb1、ecb2、ecb3、ecb4、ecb5、ecb6、ecb7、ecb15、ecb17、ecb60、ecb37、ecb94、ecb95、ecb96、ecb97、ecb91、ecb18、ecb28、ecb38、ecb39、ecb168和ecb176在对应于p54ar4-83v2的残基d23、f27、y28、v77和g85的残基位置处具有d、f、y、v和g，并且预期以这些残基结合于egfr。当与野生型p114ar7p95-a3相比时，具有在对应于p114ar7p95-a3(seqidno：41)的残基r34、f38、m72和i79的氨基酸残基位置处的替换的结合c-met的fn3域在替换时减少c-met结合至少100倍。双特异性分子ecb2、ecb5、ecb15、ecb60、ecb38和ecb39在对应于p114ar7p95-a3(seqidno：41)的残基r34、f38、m72和i79的残基位置处具有r、f、m和i，并且预期以这些残基结合于c-met。本发明还提供了一种包含fn3域的双特异性分子，该分子包含第一iii型纤连蛋白(fn3)域和第二fn3域，其中第一fn3域特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr，并且第二fn3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met，其中第一fn3域包含：fg环，该fg环包含序列hnvykdtnx9rgl(seqidno：179)或序列lgsyvfehdvml(seqidno：180)，其中x9为m或i；和bc环，该bc环包含序列x1x2x3x4x5x6x7x8(seqidno：181)，其中x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；并且x8为y、f或l；并且第二fn3域包含：c链和cd环，该c链和cd环包含序列dsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16(seqidno：184)，其中x10为w、f或v；x11为d、f或l；x12为v、f或l；x13为v、l或t；x14为v、r、g、l、t或s；x15为g、s、a、t或k；并且x16为e或d；和f链和fg环，该f链和fg环包含序列teyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23(seqidno：185)，其中x17为y、w、i、v、g或a；x18为n、t、q或g；x19为l、m、n或i；x20为g或s；x21为s、l、g、y、t、r、h或k；x22为i、v或l；并且x23为v、t、h、i、p、y或l。在本文所述的一些其它实施例中，双特异性分子包含结合egfr的第一fn3域，第一fn3域包含序列：lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnx9rglplsaeftt(seqidno：182)，或序列lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvlgsyvfehdvmlplsaeftt(seqidno：183)，其中在seqidno：182和183中；x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；x8为y、f或l；并且x9为m或i。在本文所述的一些其它实施例中，双特异性分子包含结合c-met的第二fn3域，第二fn3域包含序列：lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16aivltvpgsersydltglkpgteyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23plsaeftt(seqidno：186)，其中x10为w、f或v；并且x11为d、f或l；x12为v、f或l；x13为v、l或t；x14为v、r、g、l、t或s；x15为g、s、a、t或k；x16为e或d；x17为y、w、i、v、g或a；x18为n、t、q或g；x19为l、m、n或i；x20为g或s；x21为s、l、g、y、t、r、h或k；x22为i、v或l；并且x23为v、t、h、i、p、y或l。示例性的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子包含以seqidno：50-72、106、118-121、138-165、170-178或190-193示出的氨基酸序列。本文所述的本发明的双特异性egfr/c-met分子具有与其功能特性(诸如抑制egfr自磷酸化)相关的某些结构特性，诸如结合egfr的第一fn3域的fg环，其包含序列hnvykdtnx9rgl(seqidno：179)或序列lgsyvfehdvml(seqidno：180)，其中x9为m或i。在本文所述的一些实施例中，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子当在h292细胞中使用50ng/ml人egf测量时，以小于约8×10-7m的ic50值抑制egfr残基第1173位酪氨酸处egf诱导的egfr磷酸化；当在nci-h441细胞中使用100ng/ml人hgf测量时，以小于约8.4×10-7m的ic50值抑制在c-met残基第1349位酪氨酸处hgf诱导的c-met磷酸化；以小于约9.5×10-6m的ic50值抑制hgf诱导的nci-h292细胞增殖，其中用包含7.5ng的hgf的10％的fbs诱导细胞增殖；以小于约2.0×10-8m的kd结合egfr；或以小于约2.0×10-8m的kd结合c-met；其中kd利用如实例3或实例5所述的表面等离子共振来测量。在另一个实施例中，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子当在h292细胞中使用50ng/ml人egf测量时，以介于约4.2×10-9m和8×10-7m之间的ic50抑制egfr残基第1173位酪氨酸处egf诱导的egfr磷酸化；当在nci-h441细胞中使用100ng/ml人hgf测量时，以约2.4×10-8m至约8.4×10-7m的ic50值抑制在c-met残基第1349位酪氨酸处hgf诱导的c-met磷酸化；以约2.3×10-8m至约9.5×10-6m的ic50值抑制hgf诱导的nci-h292细胞增殖，其中用包含7.5ng的hgf的10％的fbs诱导细胞增殖；以约2×10-10m至约2.0×10-8m的kd结合egfr；或以约1×10-9m至约2.0×10-8m的kd结合c-met，其中kd利用如实例3或实例5所述的表面等离子共振来测量。在本文所述的一些实施例中，双特异性egfr/c-met分子包含结合egfr的fn3域，其包含序列lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnx9rglplsaeftt(seqidno：182)，其中x1为d；x2为d；x3为p；x4不存在；x5为h或w；x6为a；x7为f；x8为y；并且x9为m或i；和包含如下序列的结合c-met的fn3域：lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16aivltvpgsersydltglkpgteyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23plsaeftt(seqidno：186)，其中x10为w；x11为f；x12为f；x13为v或l；x14为g或s；x15为s或k；x16为e或d；x17为v；x18为n；x19为l或m；x20为g或s；x21为s或k；x22为i；并且x23为p。示例性的双特异性egfr/c-met分子是具有以seqidno：57、61、62、63、64、65、66、67、68或190-193示出的序列的那些。本文所述的本发明的双特异性分子还可包含在第一fn3域和/或第二fn3域中的与如上所述的tencon(seqidno：1)中的位置11、14、17、37、46、73和86对应的一个或多个残基位置处的替换，以及位置29处的替换。示例性的替换是替换e11n、e14p、l17a、e37p、n46v、g73y、e86i和d29e(根据seqidno：1编号)。本领域的技术人员将认识到其他氨基酸可用于替换，诸如如下文所述在其侧链中相关的氨基酸的家族内的氨基酸。可使用本文的方法测试所生成的变体的稳定性及其对egfr和/或c-met的结合。在本文所述的一些实施例中，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子包含特异性地结合egfr的第一fn3域和特异性地结合c-met的第二fn3域，其中第一fn3域包含如下序列：lpapknlvvsx24vtx25dsx26rlswddpx27afyx28sfliqyqx29sekvgeaix30ltvpgsersydltglkpgteytvsiyx31vhnvykdtnx32rglplsax33ftt(seqidno：187)，其中x24为e、n或r；x25为e或p；x26为l或a；x27为h或w；x28为e或d；x29为e或p；x30为n或v；x31为g或y；x32为m或i；并且x33为e或i；并且第二fn3域包含如下序列：lpapknlvvsx34vtx35dsx36rlswtapdaafdsfwiryfx37fx38x39x40gx41aix42ltvpgsersydltglkpgteyvvnix43x44vkggx45ispplsax46ftt(seqidno：188)；其中x34为e、n或r；x35为e或p；x36为l或a；x37为e或p；x38为v或l；x39为g或s；x40为s或k；x41为e或d；x42为n或v；x43为l或m；x44为g或s；x45为s或k；并且x46为e或i。在本文所述的一些实施例中，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子包含具有与seqidno：27的氨基酸序列至少87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的第一fn3域，以及具有与seqidno：41的氨基酸序列至少83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的第二fn3域。本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可被调制为对于egfr和c-met具有特定亲和力以使瘤积聚最大化。本发明还提供了一种分离的包含fn3域的双特异性分子，其包含第一iii型纤连蛋白(fn3)域和第二fn3域，其中第一fn3域特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr，并且第二fn3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met，其中第一fn3域和第二fn3域从基于seqidno：1的tencon序列而设计的文库分离。本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可通过如下方式生成：使用熟知的方法将本发明的结合egfr的fn3域和结合c-met的fn3域共价偶联。fn3域可经由接头连接，例如包含聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸的接头。示例性的接头包括(gs)2(seqidno：78)、(gggs)2(seqidno：224)、(ggggs)5(seqidno：79)、(ap)2(seqidno：80)、(ap)5(seqidno：81)、(ap)10(seqidno：82)、(ap)20(seqidno：83)、a(eaaak)5aaa(seqidno：84)。使用天然存在的以及人工肽接头将多肽连接成新型连接的融合多肽在文献中是熟知的(hallewell等人，jbiolchem264，5260-5268，1989；alfthan等人，proteineng.，8，725-731，1995；robinson&sauer，biochemistry，35，109-116，1996；美国专利5,856,456)。本文所述的本发明的双特异性egfr/c-met分子可从第一fn3域的c端到第二fn3域的n端或从第二fn3域的c端到第一fn3域的n端连接在一起。任何结合egfr的fn3域可共价连接到结合c-met的fn3域。示例性的结合egfr的fn3域是具有以seqidno：18-29、107-110、122-137或194-211示出的氨基酸序列的域，并且示例性的结合c-met的fn3域是具有以seqidno：32-49、111-114或212-223的氨基酸序列。要偶联到双特异性分子的结合egfr的fn3域可另外在其n端包含起始子甲硫氨酸(met)。包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的变体是本发明的范围之内的。例如，可在包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子中作出替换，只要所得变体在与亲本分子相比时保留对于egfr和c-met的相似选择性和效力。示例性的修饰是例如将产生具有与亲本分子类似特性的变体的保守替换。保守替换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。基因编码的氨基酸可被分成四个家族：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳族氨基酸。作为另外一种选择，氨基酸库(repertoire)可被分组为(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，(3)脂族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，且丝氨酸和苏氨酸任选地被单独分组为脂族-羟基；(4)芳族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；以及(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(stryer编辑，biochemistry，第2版，whfreemanandco.，1981)。可对包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子作出非保守替换，其涉及不同种类氨基酸之间的氨基酸残基的替换，以改善双特异性分子的性质。可以使用本文描述的测定法通过评估修饰的多肽或片段以类似于未经修饰的多肽或片段的方式产生应答的能力，容易地测定多肽或其片段的氨基酸序列中的变化是否导致功能同系物。其中已发生超过一个替换的肽、多肽或蛋白质可以容易地以相同方式进行测试。本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可作为二聚体或多聚体生成，例如作为增加化合价和因此靶分子结合的亲合力的手段。多聚体可通过如下方式生成：例如通过使用熟知方法引入氨基酸接头，而将一个或多个结合egfr的fn3域和一个或多个结合c-met的fn3域连接，以形成包含对于egfr或c-met具有至少双特异性的至少三个单独的fn3域的分子。本发明还提供了一种包含fn3域的双特异性分子，其包含第一iii型纤连蛋白(fn3)域和第二fn3域，其中第一fn3域特异性地结合表皮生长因子受体(egfr)并阻碍表皮生长因子(egf)结合于egfr，并且第二fn3域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-met)，并阻碍肝细胞生长因子(hgf)结合于c-met，其包含以seqidno：50-72、106、118-121、138-165、170-179或190-193示出的氨基酸序列。半衰期延长部分本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子或单特异性的结合egfr或c-met的fn3域可例如经由共价相互作用掺入其他亚基。在本发明的一个方面，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子还包含半衰期延长部分。示例性的半衰期延长部分是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白质和/或域、转铁蛋白及其片段和类似物，以及fc区域。示例性的白蛋白结合域以seqidno：117示出，并且示例性的白蛋白变体以seqidno：189示出。抗体恒定区的全部或一部分可连接至本发明的分子以赋予抗体样特性，特别是与fc区域相关的那些特性，例如fc效应子功能诸如c1q结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、吞噬作用，细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的下调，并且可通过修饰促成这些活性的fc中的残基来进一步修饰(对于综述，参见strohl，curropinbiotechnol.，20，685-691，2009)。另外的部分可掺入到本发明的双特异性分子，诸如用于期望特性的聚乙二醇(peg)分子，诸如peg5000或peg20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如，月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、糖类(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术来产生。作为另外一种选择，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分连接至本发明的重组制备的分子。聚乙二醇化(pegyl)部分可通过如下方式例如被添加到本发明的双特异性或单特异性分子：使用熟知的方法，将半胱氨酸残基掺入到分子的c端，以及将聚乙二醇化基团连接到半胱氨酸。具有c端半胱氨酸的示例性双特异性分子是具有以seqinno：170-178示出的氨基酸序列的那些分子。可通过若干熟知测定法比较掺入另外部分的本文所述的本发明单特异性和双特异性分子的功能性。例如，由于掺入fc域和/或fc域变体而导致的单特异性和/或双特异性分子的改变的特性可在fc受体结合测定法中使用该受体的可溶形式来测定，该受体的可溶形式诸如fcγri、fcγrii、fcγriii或fcrn受体，或使用熟知的测量例如adcc或cdc的基于细胞的测定法，或在体内模型中评价本发明分子的药代动力学特性。多核苷酸、载体、宿主细胞本发明提供编码结合egfr或结合c-met的fn3域或本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的核酸，作为分离的多核苷酸或作为表达载体的部分或作为线性dna序列的部分，包括用于体外转录/翻译的线性dna序列、与其组合物或定向诱变剂的原核、真核或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。本文公开了某些示例性的多核苷酸，然而，其他多核苷酸也是在本发明的范围之内的，考虑到给定表达系统中遗传密码的简并性或密码子偏好，其他多核苷酸编码结合egfr或结合c-met的fn3域或本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子。本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其编码特异性地结合具有seqidno：18-29、107-110、122-137或194-211的氨基酸序列的egfr的fn3域。本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其编码特异性地结合具有seqidno：32-49、111-114或212-223的序列的氨基酸序列的c-met的fn3域。本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其编码包含egfr/-c-metfn3域的双特异性分子，该分子具有seqidno：50-72、106、118-121、138-165、170-179或190-193的氨基酸序列。本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含seqidno：97、98、103、104、115、116或166-169的多核苷酸序列。本文所述的本发明的多核苷酸可以通过化学合成(诸如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成)来生产，并装配成完整的单链或双链分子。作为另外一种选择，本发明的多核苷酸可以通过其它技术来生产，诸如pcr之后进行常规克隆。制备或获得具有给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。本文所述的本发明的多核苷酸可包含至少一个非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、聚腺苷酸化信号、促进repa结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可包含编码另外的氨基酸的另外的序列，其编码例如标记或标签序列，诸如组氨酸标签或ha标签以促进蛋白质的纯化或检测；信号序列；融合蛋白配偶体诸如repa、fc；或噬菌体外壳蛋白诸如pix或piii。本发明还提供了一种载体，其包含本发明的至少一种多核苷酸。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、杆状病毒表达载体、基于转座子的载体或任何其它适用于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。此类载体可以是包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件的表达载体。此类元件可包含转录增强子结合位点、rna聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于被编码多肽在给定表达系统中的表达的其它位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。本发明还提供一种种宿主细胞，其包含本发明的载体。单特异性的结合egfr或结合c-met的fn3域或本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可任选地由细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的无性系群体产生，如本领域熟知的。参见例如，ausubel等人编辑，currentprotocolsinmolecularbiologyjohnwiley&sons，inc.，ny，ny(1987-2001)；sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharbor，ny(1989)；harlow和lane，antibodies，alaboratorymanual，(1989)；colligan等人编辑，currentprotocolsinimmunology，johnwiley&sons，inc.，ny(1994-2001)；colligan等人，currentprotocolsinproteinscience，johnwiley&sons，ny，ny(1997-2001)。选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物起源的或可选自cos-1、cos-7、hek293、bhk21、cho、bsc-1、heg2、sp2/0、hela、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生物、永生化细胞或转化的细胞。作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能够使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如bl21、bl21(de3)、bl21-gold(de3)、xl1-blue、jm109、hms174、hms174(de3)以及任何天然或工程改造的大肠杆菌属(e.colispp)、克雷伯氏菌属(klebsiellaspp.)或假单胞菌属(pseudomonasspp)菌株。本发明的另一个实施例是产生分离的本发明的特异性地结合egfr或c-met的fn3域或分离的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子的方法，该方法包括在一定条件下培养分离的本发明的宿主细胞，使得分离的特异性地结合egfr或c-met的fn3域或分离的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子被表达，以及纯化该域或分子。特异性地结合egfr或c-met的fn3域或分离的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子可通过熟知的方法从重组细胞培养物中纯化，例如通过蛋白质a纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法，或高效液相色谱法(hplc)。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子和结合egfr或结合c-met的fn3域的用途本文所述的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防发生细胞、组织、器官、流体或通常宿主中的人疾病或特定病变或者减轻其症状。本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的例子包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。本发明的一个方面是用于抑制表达egfr和/或c-met的细胞的生长或增殖的方法，该方法包括使细胞与本发明的分离的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域接触。本发明的另一个方面是用于抑制受试者中表达egfr和/或c-met的瘤或癌细胞的生长或转移的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的分离的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域，使得表达egfr和/或c-met的瘤或癌细胞的生长或转移被抑制。本发明的另一个方面是治疗患有癌的受试者的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的分离的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域并持续足以治疗癌的时间。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可用于治疗特征在于egfr、c-met、egf、或其他egfr配体或hgf的异常激活或产生的任何疾病或失调，或与egfr或c-met表达相关的失调，其可能涉及或可能不涉及恶性瘤或癌，其中egfr、c-met、egf或其他egfr配体或hgf的异常激活和/或产生会在患有或易患疾病或失调的受试者的细胞或组织中发生。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可用于治疗瘤，包括癌和良性瘤。适于通过本发明的双特异性分子来治疗的癌包括过表达egfr和/或c-met的那些癌，与提高的egfr活性和/或表达水平(诸如例如，egfr激活突变、egfr基因扩增，或配体介导的egfr激活)和提高的c-met活性和/或表达水平(诸如例如，c-met激活突变、c-met基因扩增，或hgf介导的c-met激活)相关的癌。可能与癌相关的示例性egfr激活突变包括点突变、缺失突变、插入突变、倒位或基因扩增，它们引起egfr的至少一种生物活性的提高，诸如提高的酪氨酸激酶活性、受体同源二聚体和异源二聚体的形成、增强的配体结合等。突变可位于egfr基因的任何部分或与egfr基因相关的调控区中，并且包括第18、19、20或21位外显子中的突变或激酶域中的突变。示例性的激活egfr突变是g719a、l861x(x为任何氨基酸)、l858r、e746k、l747s、e749q、a750p、a755v、v765m、l858p或t790m替换，e746-a750的缺失，r748-p753的缺失，ala在m766与a767之间的插入，sva(ser，val，ala)在s768与v769之间的插入，以及ns(asn，ser)在p772与h773之间的插入。egfr激活突变的其他实例是本领域已知的(参见例如美国专利公开us2005/0272083)。关于egfr和其他erbb受体的信息(包括受体同源二聚体和异源二聚体、受体配体、自磷酸化位点以及参与erbb介导的信号传导的信号传导分子)是本领域已知的(参见例如hvnes和lane，naturereviewscancer，5：341-354，2005)。示例性的c-met激活突变包括点突变、缺失突变、插入突变、倒位或基因扩增，它们引起c-met蛋白质的至少一种生物活性的提高，诸如提高的酪氨酸激酶活性、受体同源二聚体和异源二聚体的形成、增强的配体结合等。突变可位于c-met基因的任何部分或与该基因相关的调控区中，诸如c-met的激酶域中的突变。示例性的c-met激活突变是在残基位置n375、v13、v923、r175、v136、l229、s323、r988、s1058/t1010和e168处的突变。用于检测egfr和c-met突变或基因扩增的方法是熟知的。适于通过本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域来治疗的示例性癌包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌、胃癌、胸腺癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌或散发性或遗传性乳头状肾癌(prcc)。本发明的特异性地结合c-met并阻碍hgf结合于c-met的fn3域可用于治疗瘤，包括癌和良性瘤。适于通过本发明的结合c-met的fn3域来治疗的癌包括过表达c-met的那些癌。适于通过本发明的fn3域来治疗的示例性癌包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌和胸腺癌。本发明的特异性地结合egfr并阻碍egf结合于egfr的fn3域可用于治疗瘤，包括癌和良性瘤。适于通过本发明的fn3域来治疗的癌包括过表达egfr或变体的那些癌。适于通过本发明的fn3域来治疗的示例性癌包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌和胸腺癌。在本文所述的一些方法中，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可用于治疗患有癌的受试者，该癌抵抗一种或多种egfr抑制剂的治疗或者已获得对一种或多种egfr抑制剂的治疗的抗性。癌可能获得对其的抗性的示例性egfr抑制剂是抗egfr抗体，即西妥昔单抗帕尼单抗马妥珠单抗、尼妥珠单抗；小分子egfr抑制剂，即(厄洛替尼)、iressa(吉非替尼)、ekb-569(培利替尼，不可逆egfrtki)、pan-erbb；以及其他受体酪氨酸激酶抑制剂，即拉帕替尼(egfr和her2抑制剂)、培利替尼(egfr和her2抑制剂)、凡德他尼(zd6474、zactimatm、egfr、vegfr2和rettki)、pf00299804(达克替尼，不可逆pan-erbbtki)、ci-1033(不可逆pan-erbbtki)、阿法替尼(bibw2992，不可逆pan-erbbtki)、av-412(双重egfr和erbb2抑制剂)、exel-7647(egfr、erbb2、gevgr和ephb4抑制剂)、co-1686(不可逆突变体-选择性egfrtki)、azd9291(不可逆突变体-选择性egfrtki)以及hki-272(来那替尼，不可逆egfr/erbb2抑制剂)。本文所述的方法可用于治疗癌，该癌抵抗吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、co-1686、azd9291和/或西妥昔单抗的治疗或者已获得对一种或多种egfr抑制剂的治疗的抗性。可使用的示例性包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域为本文所述的具有seqidno：18-29、107-110、122-137、194-211、32-49、111-114、212-223、50-72、106、118-121、138-165、170-178或190-193所示的氨基酸序列的那些。本发明的另一个方面是一种治疗患有癌的受试者的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、特异性地结合c-met的fn3域或特异性地结合egfr的fn3域并持续足以治疗癌的时间，其中该受试者抵抗厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼、co-1686(cas号：1374640-70-6)、azd9291或西妥昔单抗的治疗或者已获得对该治疗的抗性。各种定性和/或定量方法可用于确定受试者是否抵抗egfr抑制剂治疗，形成对egfr抑制剂治疗的抗性或易于形成对egfr抑制剂治疗的抗性。可能与对egfr抑制剂的抗性相关的症状包括例如患者健康状况的下降或平稳、瘤尺寸的增加、瘤生长的下降停滞或变缓，和/或体内的癌细胞从一个位置向其他器官、组织或细胞的扩散。与癌相关的各种症状的重建或恶化也可指示受试者已形成或易于形成对egfr抑制剂的抗性，诸如厌食、认知功能障碍、抑郁、呼吸困难、疲乏、激素紊乱、中性粒细胞减少、疼痛、周围神经病变和性功能障碍。与癌相关的症状可根据癌的类型而变化。例如，与宫颈癌相关的症状可包括异常出血、不寻常白带过多、与正常月经周期不相关的骨盆疼痛、膀胱疼痛或排尿时疼痛，以及规律月经期之间、性交、冲洗或骨盆检查后的出血。与肺癌相关的症状可包括持续性咳嗽、咳血、呼吸短促、哮喘性胸痛、食欲不振，在没有刻意情况下的体重减轻以及疲乏。肝癌的症状可包括食欲不振及体重减轻、腹痛(尤其是可延伸到背部和肩部中的腹部右上部)、恶心与呕吐、全身无力与疲乏、肝肿大、腹部肿胀(腹水)以及皮肤和眼白发黄(黄疸)。肿瘤学方面的技术人员可易于鉴定与特定癌类型相关的症状。用于确定受试者是否形成对egfr抑制剂的抗性的其他方式包括检查癌细胞中的egfr磷酸化、erk1/2磷酸化和/或akt磷酸化，其中增加的磷酸化可指示受试者已形成或易于形成对egfr抑制剂的抗性。测定egfr、erk1/2和/或akt磷酸化的方法是熟知的并且在本文中有所描述。已形成对egfr抑制剂的抗性的受试者的鉴定可涉及检测升高的c-met表达水平或提高的c-met活性，例如由升高水平的循环hgf、c-met基因的激活突变或c-met基因扩增引起。本发明的另一个实施例是治疗患者中的nsclc的方法，该患者具有带有激活egfr突变或egfr基因扩增的nsclc瘤或瘤转移，该方法包括向患者施用治疗有效量的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可用于治疗非小细胞肺癌(nsclc)，其包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。在一些实施例中，nsclc的细胞具有上皮表型。在一些实施例中，nsclc已获得对一种或多种egfr抑制剂治疗的抗性。在nsclc中，egfr基因中的特定突变与对egfr酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)的高响应率(70-80％)相关。egfr中的第19位外显子的5氨基酸缺失或点突变l858r与egfr-tki敏感性相关(nakata和gotoh，expertopinthertargets16：771-781，2012)。这些突变导致egfr激酶活性的非配体依赖性激活。激活egfr突变在10-30％的nsclc患者中发生，并且在东亚人、女性、从未吸烟者以及具有腺癌组织学的患者中明显更常见(janne和johnson，clincancerres12(14增刊)：4416s-4420s，2006)。egfr基因扩增也与egfr-tki治疗后的响应强烈相关(cappuzzo等人，jnatlcancerinst，97：643-55，2005)。虽然具有egfr突变的大多数nsclc患者最初响应于egfrtki疗法，但几乎所有患者都获得防止持久响应的抗性。由于egfr的激酶域中的第二位点点突变(t790m)，50-60％的患者获得抗性。抵抗egfr酪氨酸激酶抑制剂的所有瘤中的将近60％增加c-met表达、扩增c-met基因或增加其唯一已知配体hgf(turke等人，cancercell，17：77-88，2010)。本发明的另外的实施例是治疗患有癌的患者的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域并持续足以治疗癌的时间，其中癌与egfr激活突变、egfr基因扩增、c-met激活突变或c-met基因扩增相关。在一些实施例中，egfr激活突变是g719a、g719x(x为任何氨基酸)、l861x(x为任何氨基酸)、l858r、e746k、l747s、e749q、a750p、a755v、v765m、l858p或t790m替换，e746-a750的缺失，r748-p753的缺失，ala(a)在m766与a767之间的插入，ser、val和ala(sva)在s768与v769之间的插入，以及asn和ser(ns)在p772与h773之间的插入。本发明的另外的实施例是治疗患有癌的患者的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域并持续足以治疗癌的时间，其中癌与egfr突变l858r、t790m或残基e746-a750的缺失(del(e746，a750))、egfr扩增或c-met扩增相关。在一些实施例中，癌与野生型egfr和野生型c-met相关。在一些实施例中，癌与野生型egfr和c-met扩增相关。在一些实施例中，癌与egfrl858r和t790m突变及野生型c-met相关。在一些实施例中，癌与egfr缺失del(e764，a750)和野生型c-met相关。在一些实施例中，癌与egfr缺失del(e764，a750)和c-met扩增相关。在一些实施例中，癌与egfr缺失del(e764，a750)、egfr扩增和c-met扩增相关。在一些实施例中，患者患有与egfrl858r和t790m突变及野生型c-met相关的nsclc。在一些实施例中，患者患有与egfr扩增和野生型c-met相关的nsclc。在一些实施例中，患者患有与egfr扩增和c-met扩增相关的nsclc。在一些实施例中，患者患有与egfr缺失del(e764，a750)和野生型c-met相关的nsclc。在一些实施例中，患者患有与egfr缺失del(e764，a750)和c-met扩增相关的nsclc。egfr或c-met的扩增可通过标准方法评价，例如通过dna印迹、fish或比较基因组杂交(cgh)测定egfr或c-met基因的拷贝数。术语“治疗”或“处理”是指治疗处理和预防或防御措施，其中目标是防止或减缓(减轻)非期望的生理变化或失调，诸如癌的发展或扩散。对于本发明而言，有利或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的削弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，而不论是可检测的或是不可检测的。“治疗”也可意指与未接受治疗时的预期生存期相比生存期延长。需要治疗的个体包括已患有病症或失调的个体以及易患病症或失调的个体或者要预防病症或失调的个体。“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可根据多种因素变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域引起个体中的所需响应的能力。在与抗性的关联方面可降低或减少的有效egfr/c-met治疗剂的示例性指标包括例如改善的患者健康状况、瘤尺寸的减小或缩小、瘤生长停滞或减缓，和/或不存在癌细胞向体内其他位置的转移。施用/药物组合物本发明提供了包含本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域和药学上可接受的载体的药物组合物。就治疗用途而言，可将本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域制备为药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体中的有效量的域或分子作为活性成分。术语“载体”是指活性化合物与其一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的熟知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有配药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本发明的分子在这种药物制剂中的浓度可大范围改变，即从小于约0.5％、通常至少约1％到高达15或20％(以重量计)，且将根据所选择的具体施用方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白如人血清白蛋白在内的合适的媒介物和制剂描述在例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，troy，d.b.编辑，lipincottwilliamsandwilkins，philadelphia，pa，2006，第5部分，pharmaceuticalmanufacturing第691-1092页，特别参见第958-989页。用于本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径，诸如肠胃外施用，例如，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用在片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中的制剂；或技术人员所理解的本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可经制备以包含1ml的无菌缓冲水，以及1ng至约100mg的本发明的fn3域，例如，约50ng至约30mg，或更优选地约5mg至约25mg。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可通过任何合适的途径施用给患者，例如通过静脉内(iv)输注或弹丸式注射、肌内注射或皮下注射或腹膜内注射以肠胃外方式施用。可给予iv输注少至15分钟，但更常为30分钟、60分钟、90分钟或甚至2或3小时。也可将本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域直接注射到病变部位(例如，瘤自身)。给予患有癌的患者的剂量足以缓解或至少部分地抑制正治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且有时可为0.1至10mg/kg体重，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg，但可甚至更高，例如15、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。也可给予固定的单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或剂量可基于患者的表面积，例如400、300、250、200或100mg/m2。通常可施用1至8剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)以治疗癌，但可给予10、12、20或更多剂量。可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间后重复本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域的施用。重复疗程也是可能的，长期施用同样可能。重复施用可采用相同剂量或采用不同剂量。例如，可将用于静脉内输注的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域的药物组合物制备成包含约200ml的无菌林格氏溶液，及约8mg至约2400mg、约400mg至约1600mg或约400mg至约800mg的双特异性egfr/c-met抗体以便施用给80kg患者。用于制备可肠胃外施用的组合物的方法是众所周知的，且更详细地描述在，例如，“remington'spharmaceuticalscience”，第15版，mackpublishingcompany，easton，pa。可将本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域冻干保存，并且在使用前在合适载体中重构。已证实此技术对常规蛋白制备有效，并且可以采用本领域已知的冻干法和重构技术。可以单次剂量向受试者施用本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域，或可在一天、两天、三天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月或三个月后重复该施用。重复施用可采用相同剂量或采用不同剂量。施用可重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可联合第二治疗剂同时地、顺序地或单独地施用。第二治疗剂可为化学治疗剂、抗血管生成剂或细胞毒素药物。当用于治疗癌时，包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可结合传统癌疗法进行施用，诸如外科手术、放射疗法、化学疗法或它们的组合。可与本发明的fn3域结合使用的示例性药剂为her2、her3、her4或vegf的拮抗剂，和蛋白酪氨酸激酶抑制剂，诸如(吉非替尼)和tarceva(厄洛替尼)。包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可连同本领域技术人员已知的化疗药或其他抗癌治疗剂中的任何一者或多者一起施用。化学治疗剂是可用于治疗癌的化合物，并且包括生长抑制剂或其他细胞毒素剂，并且包括烷化剂、抗代谢药、抗微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂等。化学治疗剂的例子包括烷化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、加利车霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素d、柔红菌素、阿霉素、6-重氮-5-氧-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-fu；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类，诸如二甲睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；足叶草酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉类或紫杉烷家族的成员，诸如紫杉醇(多西他赛及其类似物；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维甲酸；艾司波霉素(esperamicins)；卡培他滨；受体酪氨酸激酶和/或血管生成的抑制剂，包括索拉非尼舒尼替尼帕唑帕尼(votrienttm)、托西尼布(palladiatm)、凡德他尼(zactimatm)、西地尼布瑞格非尼(bay73-4506)、阿西替尼(ag013736)、来他替尼(cep-701)、厄洛替尼吉非替尼(iressatm)、bibw2992(tovoktm)、拉帕替尼来那替尼(hki-272)等，以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括在该定义中的是抗激素剂，其用于调节或抑制激素对瘤的作用，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬以及抗雄激素类，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其他常规细胞毒性化合物(如wiemann等人，1985，载于medicaloncology(calabresi等人编辑)，第10章，麦克米兰出版社(mcmillanpublishing)中所公开的那些化合物)也可应用于本发明的方法。可与包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域结合使用的示例性药剂包括酪氨酸激酶抑制剂和靶向抗癌疗法诸如(吉非替尼)和tarceva(厄洛替尼)及her2、her3、her4或vegf的其他拮抗剂。示例性的her2拮抗剂包括cp-724-714、herceptintm(曲妥珠单抗)、omnitargtm(帕妥珠单抗)、tak-165、拉帕替尼(egfr和her2抑制剂)和gw-282974。示例性的her3拮抗剂包括抗her3抗体(参见例如美国专利公开us2004/0197332)。示例性的her4拮抗剂包括抗her4sirna(参见例如maatta等人，molbiolcell，17：67-79，2006)。示例性的vegf拮抗剂为贝伐单抗(avastintm)。当小分子与本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域结合使用时，其通常更频繁地施用，优选地一天一次，但每天2、3、4或更多次也是可能的，每两天一次、每周一次或一些其他时间间隔同样可能。小分子药物通常以口服方式服用，但肠胃外施用也是可能的，例如通过iv输注或弹丸式注射或皮下或肌内注射。小分子药物的剂量可通常为10至1000mg，或约100、150、200或250mg。当本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域可结合第二治疗剂施用时，该组合可在任何方便的时间段内发生。例如，可在同一天且甚至在相同静脉内输注中，将本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域和第二治疗剂施用给患者。然而，也可在隔天或隔周、隔两周或隔月等施用本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域和第二治疗剂。在一些方法中，本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域和第二治疗剂以足够接近的时间施周，使得它们在正治疗的患者中同时以可检测水平存在(例如，存在于血清中)。在一些方法中，由一段时间内多剂量组成的本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域的整个疗程之后或者之前是也由多剂量组成的第二治疗剂的疗程。在一些方法中，如果患者具有对最初施用的第二治疗剂的抗性或形成对该第二治疗剂的抗性，则开始接着施用本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域进行治疗。患者可接受本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域和第二治疗剂中一者或两者的仅单个疗程或多个疗程。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域和第二治疗剂施用期间可使用1、2或若干天或周的恢复期。当已确立第二治疗剂的合适治疗方案时，该方案可与本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域结合使用。例如，(厄洛替尼)作为100mg或150mg丸剂每天服用一次，并且(吉非替尼)作为250mg片剂每天服用一次。本发明的包含egfr/c-metfn3域的双特异性分子、结合egfr的fn3域或结合c-met的fn3域，任选地与第二治疗剂联用，可连同任何形式的放射疗法和/或外科手术一起施用，该放射疗法包括外照射、调强放射疗法(imrt)和任何形式的放射外科手术，包括伽玛刀、射波刀、直线加速器和组织问放射(例如，植入的放射性粒子、gliasite球囊)。与放射疗法的联用可尤其适用于头颈癌和脑瘤。虽然以一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求所保护的范围的限制。实例1.tencon文库的构建tencon(seqidno：1)是一种免疫球蛋白样支架，即由来自人腱生蛋白-c的十五个fn3域的共有序列而设计的iii型纤连蛋白(fn3)域(jacobs等人，proteinengineering，design，andselection，25：107-117，2012；美国专利公开2010/0216708)。tencon的晶体结构显示连接七条β-链的六个表面外露的环。这些环或每个环内的所选残基可被随机化以便构建iii型纤连蛋白(fn3)域的文库，该文库可用于选择结合于特定靶标的新型分子。tencon：lpapknlvvsevtedslrlswtapdaafdsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaeftt(seqidno1)：tcl1文库的构建构建被设计成仅使tencon(seqidno：1)的fg环随机化的文库tcl1，以与顺式展示系统一起使用(jacobs等人，proteinengineering，design，andselection，25：107-117，2012)。在该系统中，产生了掺入tac启动子、tencon文库编码序列、repa编码序列、顺式元件和复制起点元件的序列的单链dna。在体外转录/翻译系统中表达时，tencon-repa融合蛋白顺式结合于编码该融合蛋白的dna而产生了复合物。然后通过如下所述的聚合酶链反应(pcr)分离并扩增结合于靶分子的复合物。与顺式展示一起使用的tcl1文库的构建通过连续数轮pcr实现，以产生两个半部的最终线性的双链dna分子；5’片段包含启动子和tencon序列，而3’片段包含repa基因及顺式元件和复制起点元件。这两个半部通过限制酶切消化来组合，以产生完整构建体。tcl1文库被设计成仅在tencon的fg环中掺入随机氨基酸kgghrsn(seqidno：86)。nns密码子用于构建该文库，使得可能将所有20种氨基酸和一个终止密码子掺入到fg环中。tcl1文库包含六个单独的亚文库，各亚文库具有7至12个残基的不同随机化fg环长度，以进一步增加多样性。基于tencon的文库的设计示于表2中。表2：*tapdaafd：seqidno：1的第22-28位残基；**kgghrsn：seqidno：86x是指由nns密码子编码的简并氨基酸。#是指正文中所述的“氨基酸的设计分布”。为了构建tcl1文库，执行连续数轮pcr以附加tac启动子、在fg环中建立简并性以及添加最终组装所需的限制位点。首先，通过pcr在两个步骤中产生包含启动子序列和fg环的tencon序列5’的dna序列。对应于完全tencon基因序列的dna用作采用引物pop2220(seqidno：2)和tc5’tofg(seqidno：3)的pcr模板。从该反应所得的pcr产物用作采用引物130mer(seqidno：4)和tc5'tofg的下一轮pcr扩增的模板，以完成5’和启动子序列向tencon的附加。接下来，通过如下方式将多样性引入fg环中：采用正向引物pop2222(seqidno：5)以及包含简并核苷酸的反向引物tcf7(seqidno：6)、tcf8(seqidno：7)、tcf9(seqidno：8)、tcf10(seqidno：9)、tcf11(seqidnno：10)或tcf12(seqidno：11)扩增在第一步中产生的dna产物。每个亚文库执行至少八个100μl的pcr反应以使pcr循环最小化并使文库的多样性最大化。对至少5μg的该pcr产物进行凝胶纯化并用于采用引物pop2222(seqidno：5)和pop2234(seqidno：12)的随后pcr步骤，从而导致6xhis标签和noti限制位点连接到tencon序列的3’端。该pcr反应仅使用十五个pcr循环和至少500ng的模板dna来进行。对所得pcr产物进行凝胶纯化，用noti限制酶消化，并通过qiagen柱纯化。文库的3’片段是恒定dna序列，该序列包含用于展示的元件，包括pspomi限制位点、repa基因的编码区以及顺式元件和复制起点元件。使用包含该dna片段的质粒(pcr4blunt)(invitrogen)，利用m13正向引物和m13反向引物执行pcr反应。通过pspomi将所得pcr产物消化过夜，并进行凝胶纯化。为了将文库dna的5’部分连接到包含repa基因的3’dna，在noti和pspomi酶及t4连接酶存在下，将2pmol的5'dna连接到等摩尔量的3’repadna。在37℃下过夜连接后，将小部分的连接dna在凝胶上电泳以检查连接效率。将连接文库产物分成十二次pcr扩增，并且采用引物对pop2250(seqidno：13)和didligrev(seqidno：14)运行12个循环的pcr反应。tcl1文库的每个亚文库的dna产量在32-34μg范围内。为了评估文库的质量，采用引物tcon5new2(seqidno：15)和tcon6(seqidno：16)扩增小部分的工作文库，并经由不依赖连接酶的克隆法克隆到修饰pet载体中。将质粒dna转化到bl21-gold(de3)感受态细胞(stratagene)中并且使用t7启动子引物对96个随机挑取的菌落进行测序。未发现重复的序列。总的说来，大约70-85％的克隆具有完整的启动子和tencon编码序列而无移码突变。功能序列比率(排除具有终止密码子的克隆)在59％与80％之间。tcl2文库的构建构建tcl2文库，其中tencon的bc和fg环被随机化并且每个位置处的氨基酸的分布受到严格控制。表3示出了tcl2文库中所需环位置处的氨基酸分布。所设计的氨基酸分布具有两个目标。首先，文库偏向于这样的残基，根据tencon晶体结构的分析和/或同源建模，预测这些残基在结构上对于tencon折叠和稳定性是重要的。例如，位置29固定为仅亚组的疏水氨基酸，因为该残基掩埋于tencon折叠的疏水核中。第二层设计包括使氨基酸分布偏向在抗体的重链hcdr3中优先发现的残基，以有效产生高亲和力结合物(birtalan等人，jmolbiol，377：1518-28，2008；olson等人，proteinsci，16：476-84，2007)。为了达到这个目的，表3的“所设计的分布”是指如下的分布：6％丙氨酸、6％精氨酸、3.9％天冬酰胺、7.5％天冬氨酸、2.5％谷氨酸、1.5％谷氨酰胺、15％甘氨酸、2.3％组氨酸、2.5％异亮氨酸、5％亮氨酸、1.5％赖氨酸、2.5％苯丙氨酸、4％脯氨酸、10％丝氨酸、4.5％苏氨酸、4％色氨酸、17.3％酪氨酸和4％缬氨酸。该分布没有甲硫氨酸、半胱氨酸和终止密码子。表3：*残基编号基于seqidno：1的tencon序列tcl2文库的5’片段包含启动子和tencon(seqidno：1)的编码区，其被化学合成为文库集合(librarypool)(sloningbiotechnology)。dna的该集合包含至少1×1011个不同成员。在片段的末端，bsai限制位点被包括在设计中以用于连接到repa。文库的3’片段是恒定dna序列，该序列包含用于展示的元件，包括6xhis标签、repa基因的编码区以及顺式元件。使用现有的dna模板(见上)以及引物ls1008(seqidno：17)和didligrev(seqidno：14)，通过pcr反应来制备dna。为了组装完整的tcl2文库，将总计1μg的经bsai消化的5’tencon文库dna连接到3.5μg的3’片段，该3’片段通过采用相同酶的限制性消化来制备。在过夜连接后，通过qiagen柱纯化dna，并通过测量260nm下的吸光度来定量dna。通过采用引物对pop2250(seqidno：13)和didligrev(seqidno：14)的12个循环的pcr反应来扩增经连接的文库产物。执行总计72个反应，每个反应包含50ng的经连接的dna产物作为模板。tcl2工作文库dna的总产量为约100μg。将小部分的工作文库亚克隆并测序，如上文针对文库tcl1所述。未发现重复的序列。约80％的序列包含完整的启动子和tencon编码序列而无移码突变。tcl14文库的构建顶部(bc、de和fg)和底部(ab、cd和ef)环，例如fn3域中报道的结合表面被形成fn3结构的中心的β-链分隔。存在于fn3域的两个“侧面”上且形状与仅由环形成的表面不同的可供选择的表面，在fn3域的一个侧面处由两条反平行β-链即c和fβ-链以及cd和fg环形成，并且本文称为c-cd-f-fg表面。使tencon的可供选择的表面随机化的文库通过如下方式产生：使所选c和f链的表面暴露残基以及cd和fg环的部分随机化，如图1中所示。与tencon(seqidno：1)相比具有下列替换的tencon变体tencon27(seqidno：99)用于产生文库；e11rl17a、n46v、e86i。用于构建该文库的方法的完整描述描述于美国专利公开us2013/0226834。实例2：结合egfr并抑制egf结合的iii型纤连蛋白(fn3)域的选择文库筛选使用顺式展示从tcl1和tcl2文库选择egfr结合域。使用标准方法对融合到igg1fc的egfr(r&dsystems)的重组人细胞外域进行生物素酰化，并用于淘选(seqidno：73的全长egfr的第25-645位残基)。为了体外转录和翻译(itt)，将2-6μg的文库dna与0.1mm完整氨基酸、1xs30预混组分以及30μl的s30抽提物(promega)一起在100μl的总体积中温育，并且在30℃下温育。1小时后，加入450μl的封闭溶液(pbsph7.4，补充有2％牛血清白蛋白、100μg/ml鲱鱼精dna和1mg/ml肝素)，并且将反应在冰上温育15分钟。通过将重组人egf(r&dsystems)与生物素酰化重组egfr-fc在封闭溶液中在室温下混合1小时，以1∶1和10∶1摩尔比的egfr与egf来组装egfr-fc：egf复合物。为进行结合，将500μl经封闭的itt反应与100μl的egfr-fc：egf复合物混合，并且在室温下温育1小时，之后采用中性亲和素或链霉亲和素磁珠(seradyne)将结合复合物拉下。通过用pbst和pbs连续洗涤来移除未结合的文库成员。洗涤之后，通过加热到65℃持续10分钟将dna从结合复合物洗脱下来，通过pcr来扩增，并通过限制性消化和连接将其连接到编码repa的dna片段，以供随后几轮淘选所用。通过在每轮期间将靶标egfr-fc的浓度从200nm到50nm连续地降低并且增加洗涤严格性，来分离高亲和力结合物。在第4和5轮中，通过在10倍摩尔过量的非生物素酰化egfr-fc存在下在pbs中洗涤过夜，来移除未结合和弱结合的fn3域。在淘选后，使用标准分子生物学技术，采用寡核苷酸tcon5new2(seqidno：15)和tcon6(seqidno：16)通过pcr来扩增所选fn3域，亚克隆到经修饰而包括不依赖连接酶的克隆位点的pet载体中，并且转化到bl21-gold(de3)(stratagene)细胞中，以用于在大肠杆菌中进行可溶性表达。将编码c端聚组氨酸标签的基因序列添加到每个fn3域以实现纯化和检测。在37℃下使培养物在1ml的96孔板中补充有100μg/ml羧苄青霉素的2yt培养基中生长到0.6-0.8的光密度，然后添加终浓度为1mm的iptg，此时温度下降到30℃。大约16小时后通过离心收获细胞并在-20℃下冻存。通过如下方式实现细胞裂解：在摇动的情况下将各沉淀物在0.6ml的ht裂解缓冲液(novagenemdbiosciences)中在室温下温育45分钟。结合细胞上的egfr的fn3域的选择为了在更具生理性的环境中评估不同fn3域结合egfr的能力，测量了它们结合a431细胞的能力。a431细胞(美国典型培养物保藏中心，目录号crl-1555)过表达egfr，每个细胞含约2×106个受体。将细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中，并使之在37℃下在潮湿5％的co2气氛中附着过夜。将表达fn3域的细菌裂解物在facs染色缓冲液(bectondickinson)中稀释1,000倍，并且在三个平行测定板中在室温下温育1小时。移除裂解物，并且用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次。将细胞与50μl/孔的抗pentahis-alexa488抗体缀合物(qiagen)(以1∶100稀释于facs染色缓冲液中)在室温下温育20分钟。用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次，之后在孔中充入100μl的facs染色缓冲液并且使用acumenex3读板机读取488nm下的荧光。针对其结合a431细胞的能力来筛选包含fn3域的细菌裂解物(用于tcl1和tcl2文库的1320个粗细菌裂解物)，并且鉴定出516个阳性克隆，其中结合性超过背景信号≥10倍。针对结合来筛选来自tcl14文库的300个裂解物，得到结合于egfr的58个独特的fn3域序列。抑制egf结合于细胞上的egfr的fn3域的选择为了更好地表征egfr结合的机制，使用a431细胞测量了各种鉴定的fn3域克隆以egf竞争性方式结合egfr的能力，并且与a431结合测定筛选并行运行。将a431细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中，并使之在37℃下在潮湿5％的co2气氛中附着过夜。将细胞与50μl/孔的1∶1,000稀释的细菌裂解物在三个平行测定板中在室温下温育1小时。将生物素酰化egf(invitrogen)，目录号e-3477)加入每个孔中达到30ng/ml的终浓度，并在室温下温育10分钟。用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次。将细胞与50μl/孔的链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(invitrogen)(以1∶100稀释于facs染色缓冲液中)在室温下温育20分钟。用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次，之后在孔中充入100μl的facs染色缓冲液并且使用acumenex3读板机读取600nm下的荧光。在上述egf竞争测定法中筛选包含fn3域的细菌裂解物。筛选来自tcl1和tcl2文库的1320个粗细菌裂解物，得到将egf结合抑制＞50％的451个阳性克隆。鉴定的结合egfr的fn3域的表达和纯化用hismultitraptmhp板(gehealthcare)从澄清的大肠杆菌裂解物纯化带his标签的fn3域，并在ph7.4的包含20mm磷酸钠、500mm氯化钠和250mm咪唑的缓冲液中洗脱。使用pdmultitraptmg-25板(gehealthcare)将经纯化的样品交换到pbsph7.4中以用于分析。尺寸排阻色谱法分析使用尺寸排阻色谱法测定结合egfr的fn3域的聚集状态。将每个经纯化的fn3域的等分试样(10μl)在pbsph7.4的流动相中以0.3ml/min的流量注射到superdex755/150柱(gehealthcare)上。通过280nm处的吸光度监测来自柱的洗脱液。将通过sec显示出高水平聚集的fn3域排除，不进行进一步分析。所选结合egfr的fn3域从egfr-fc的解离速率在proteonxpr-36仪器(bio-rad)上筛选所选的结合egfr的fn3域，以鉴定在结合于egfr-fc时具有缓慢解离速率(koff)的那些，从而有利于选择高亲和力结合物。将5μg/ml浓度的山羊抗人fcigg(r&dsystems)以包含0.005％吐温-20的pbs中30μl/min的流量经由胺偶联(在ph5.0下)沿芯片上的水平取向直接固定在所有6个配体通道上。固定密度平均为约1500响应单位(ru)，并且不同通道间的变化率小于5％。egfr-fc被捕获于抗人fcigg表面，在竖直配体取向上达到约600ru的密度。将所有经测试的fn3域归一化为1μm的浓度并且测试它们在水平取向上的结合。所有6个分析物通道用于fn3域以使筛选通量最大化。以100μl/min的流量监测离解相10分钟。点间结合信号周作参照以监测分析物与固定igg表面之间的非特异性结合，并且从所有结合响应扣除。经处理的结合数据局部拟合到1∶1简单朗缪尔结合模型，以提取结合于捕获的egfr-fc的每个fn3域的koff。egf刺激的egfr磷酸化的抑制测试了经纯化的结合egfr的fn3域在单一浓度下抑制egf刺激的a431细胞中egfr的磷酸化的能力。使用egfr磷酸化(tyr1173)试剂盒(mesoscalediscovery)监测egfr磷酸化。将细胞以20,000/孔接种于透明96孔组织培养处理板(nunc)中含glutamaxtm与10％胎牛血清(fbs)(gibco)的100μl/孔rpmi培养基(gibco)中，并使之在37℃下于潮湿5％的co2气氛中附着过夜。将培养基完全移除，并且在100μl/孔的不含fbs的培养基中在37℃下于潮湿5％的co2气氛中对细胞进行饥饿处理过夜。然后用100μl/孔的包含2μm浓度的结合egfr的fn3域的预热(37℃)饥饿培养基，在37℃下于潮湿5％的co2气氛中将细胞处理1小时。对照仅用饥饿培养基处理。通过如下方式刺激细胞：加入100μl/孔的包含100ng/ml重组人egf(r&dsystems，目录号236-eg)(终浓度为50ng/mlegf和1μm结合egfr的fn3域)的预热(37℃)饥饿培养基并轻轻混合，并且在37℃、5％的co2下温育15分钟。一组对照孔保持不刺激，作为阴性对照。将培养基完全移除，并且根据制造商说明书，在摇动的情况下在室温下用100μl/孔的完全裂解缓冲液(mesoscalediscovery)裂解细胞10分钟。根据制造商说明书，用所提供的封闭溶液在室温下将被配置用于测量第1173位酪氨酸上磷酸化的egfr的测定板(mesoscalediscovery)封闭1.5-2小时。然后用200μl/孔的1xtris洗涤缓冲液(mesoscalediscovery)将板洗涤4次。将细胞裂解物的等分试样(30μl/孔)转移到测定板，将测定板用板密封膜(vwr)覆盖并且在摇动的情况下在室温下温育1小时。用200μl/孔的tris洗涤缓冲液将测定板洗涤4次，之后将25μl的冰冷检测抗体溶液(mesoscalediscovery)加入每孔中，应小心操作，避免引入气泡。在摇动的情况下在室温下将板温育1小时，然后用200μl/孔的tris洗涤缓冲液洗涤4次。通过如下方式检测信号：加入150μl/孔的读取缓冲液(readbuffer)(mesoscalediscovery)并且使用制造商安装的测定专用默认设置，在成像器6000仪器(mesoscalediscovery)上读数。对每个结合egfr的fn3域计算egf刺激的阳性对照信号的抑制百分比。对来自tcl1和tcl2文库的232个鉴定的克隆测量egf刺激的egfr磷酸化的抑制。这些克隆中的22个在1μm浓度下将egfr磷酸化抑制≥50％。在将弱表达或经尺寸排阻色谱法判定为多聚体的克隆移除之后，九个克隆接着进行进一步的生物表征。这些克隆的bc和fg环序列示于表4中。九个所选克隆中的八个具有共同的fg环序列(hnvykdtnmrgl；seqidno：95)并且在若干克隆之间在其bc环序列中可看到显著相似性的区域。表4：实例3：抑制egf结合的结合egfr的fn3域的表征大规模表达、纯化和内毒素移除表4中所示的fn3域按比例放大以提供用于详细表征的更多材料。使用包含每种结合egfr的fn3域变体的过夜培养物，以过夜培养物在新鲜培养基中的1/80稀释液接种0.8l补充有100μg/ml氨比西林的terrific肉汤培养基，并且在摇动的情况下在37℃下温育。当600nm下的光密度达到约1.2-1.5时，通过添加终浓度为1mm的iptg来诱导培养物，并且温度下降到30℃。在4小时后，通过离心收集细胞，并且将细胞沉淀物保存于-80℃下直到需要为止。为了进行细胞裂解，以每克沉淀物5ml的的比率，将解冻的沉淀物重悬于补充有25u/ml的(sigma-aldrich)和1ku/ml的rlysozymetm(novagenemdbiosciences)的1x中。在轻轻搅拌的情况下在室温下进行裂解1小时，然后在4℃下以56,000×g离心50分钟。收集上清液并通过0.2μm滤膜过滤，然后使用gehealthcare100s色谱系统将其上样于用缓冲液a(50mmtris-hclph7.5、500mmnacl、10mm咪唑)预先平衡的5ml的histrapff柱。将柱用20个柱体积的缓冲液a洗涤，并用6个柱体积的16％缓冲液b(50mmtris-hclph7.5、500mmnacl、250mm咪唑)进一步洗涤。将fn3域用10个柱体积的50％b、接着是超过6个柱体积的50-100％b的梯度进行洗脱。将包含fn3域蛋白的级分合并，使用millipore10kmwco浓缩器浓缩，并过滤，再上样于用pbs预先平衡的hiloadtm16/60superdextm75柱(gehealthcare)上。从尺寸排阻柱洗脱的蛋白单体峰得以保留。使用acticleanetox树脂(sterogenebioseparations)，利用分批方法移除内毒素。在内毒素移除之前，将树脂用1nnaoh在37℃下预处理2小时(或4℃过夜)并且用pbs充分洗涤直到用ph试纸测得ph已稳定到约7。将经纯化的蛋白通过0.2μm滤膜过滤，再以10ml的蛋白与1ml的树脂的比率加入到1ml的etox树脂中。在轻轻旋转的情况下使内毒素对树脂的结合在室温下进行至少2小时。通过以500×g离心2分钟来移除树脂，并且保留蛋白上清液。使用-ptstm小柱测量内毒素水平，并且在-mcs读板机(charlesriver)分析。如果在第一次etox处理后内毒素水平高于5eu/mg，则重复以上程序直到内毒素水平降至≤5eu/mg。在用etox进行两次连续处理后内毒素水平高于5eu/mg并且稳定的情况下，确定蛋白质的阴离子交换或疏水相互作用色谱法条件，以移除剩余的内毒素。所选结合egfr的fn3域对egfr-fc的亲和力测定(egfr-fc亲和力)所选结合egfr的fn3域对重组egfr细胞外域的结合亲和力进一步使用proteon仪器(biorad)通过表面等离子共振方法表征。测定装置(芯片制作，egfr-fc捕获)类似于以上针对解离速率分析所述的装置。以3倍稀释系列在1μm浓度下测试水平取向的所选结合egfr的fn3域。还注入缓冲液样品以监测基线稳定性。以100μl/min的流量监测所有浓度的每个结合egfr的fn3域的离解相30分钟(对于来自解离速率筛选的koff为约10-2s-1的那些)或1小时(对于koff为约10-3s-1或更慢的那些)。将两组参考数据从响应数据扣除：1)点间信号，以校正结合egfr的fn3域与固定化igg表面之间的非特异性相互作用；2)缓冲液通道信号，以校正因捕获的egfr-fc表面随时间推移的离解而引起的基线漂移。将在所有浓度下对每个fn3域处理的结合数据全局地拟合到1∶1简单朗缪尔结合模型，以提取动力学(kon、koff)和亲和力(kd)常数的估计值。表5示出了每个构建体的动力学常数，且亲和力从200pm变化到9.6nm。所选结合egfr的fn3域对细胞上的egfr的结合(“a431细胞结合测定”)将a431细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中，并使之在37℃下在潮湿5％的co2气氛中附着过夜。在室温下将经纯化的结合egfr的fn3域(1.5nm至30μm)加入到三个平行测定板中的细胞(50ul)中持续1小时。移除上清液，并且用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次。将细胞与50μl/孔的抗pentahis-alexa488抗体缀合物(qiagen)(以1∶100稀释于facs染色缓冲液中)在室温下温育20分钟。用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次，之后在孔中充入100μl的facs染色缓冲液并且使用acumenex3读板机读取488nm下的荧光。将数据作为原始荧光信号对fn3域摩尔浓度的对数作图，并且使用graphpadprism4(graphpadsoftware)拟合到具有可变斜率的s形剂量-响应曲线，以计算ec50值。表5报告了2.2nm至＞20μm范围内的每个构建体的ec50。使用所选结合egfr的fn3域对egf结合于细胞上的egfr的抑制(a431细胞egf竞争测定法)将a431细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中，并使之在37℃下在潮湿5％的co2气氛中附着过夜。在室温下将经纯化的结合egfr的fn3域(1.5nm至30μm)加入到三个平行测定板中的细胞(50μl/孔)中持续1小时。将生物素酰化egf(invitrogen，目录号：e-3477)加入每个孔中达到30ng/ml的终浓度，并在室温下温育10分钟。用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次。将细胞与50μl/孔的链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(invitrogen)(以1∶100稀释于facs染色缓冲液中)在室温下温育20分钟。用150μl/孔的facs染色缓冲液将细胞洗涤3次，之后在孔中充入100μl的facs染色缓冲液并且使用acumenex3读板机读取600nm下的荧光。将数据作为原始荧光信号对fn3域摩尔浓度的对数作图，并且使用graphpadprism4(graphpadsoftware)拟合到具有可变斜率的s形剂量-响应曲线，以计算ic50值。表5报告了1.8nm至121nm范围内的ic50值。egf刺激的egfr磷酸化的抑制(磷酸化egrf测定)通过测量抑制的ic50值，更全面地评估显著抑制egf刺激的egfr磷酸化的所选fn3域。在不同fn3域浓度(0.5nm至10μm)下评估egf刺激的egfr磷酸化的抑制，如以上在“egf刺激的egfr磷酸化的抑制”中所述。将数据作为电化学发光信号对fn3域摩尔浓度的对数作图，并且通过使用graphpadprism4(graphpadsoftware)将数据拟合到具有可变斜率的s形剂量响应，来测定ic50值。表5示出了在18nm至＞2.5μm范围内的ic50值。人瘤细胞生长的抑制(nci-h292生长和nci-h322生长测定)通过如下方式评估egfr依赖性细胞生长的抑制：在暴露于结合egfr的fn3域之后，测量过表达egfr的人瘤细胞系nci-h292和nci-h322(美国典型培养物保藏中心，分别为目录号crl-1848和#crl-5806)的活力表5：暴露于结合egfr的fn3域。将细胞以500个细胞/孔(nci-h292)或1,000个细胞/孔(nci-h322)接种于不透明的白色96孔组织培养处理板(nunc)中含glutamaxtm和10mmhepes且补充有10％热灭活胎牛血清(gibco)和1％青霉素/链霉素(gibco)的100μl/孔rpmi培养基(gibco)中，并使之在37℃下在潮湿的5％co2气氛中附着过夜。通过加入包含某浓度范围结合egfr的fn3域的5μl/孔的磷酸盐缓冲盐水(pbs)来处理细胞。对照仅用5μl/孔的pbs或pbs中的25mm乙二胺四乙酸处理。将细胞在37℃、5％的co2下温育120小时。通过如下方式检测活细胞：加入75μl/孔的celltiter-试剂(promega)，然后在板摇动器上混合2分钟，并且在室温下在黑暗中再温育10分钟。在设定为发光模式的spectramaxm5读板机(moleculardevices)上读取板，对于仅空白介质的读取时间为0.5秒/孔。将数据作为经pbs处理的细胞生长的百分比对fn3域摩尔浓度的对数作图。使用graphpadprism4(graphpadsoftware)将数据拟合到具有可变斜率的s形剂量响应的方程，来测定ic50值。表5示出了分别使用nci-h292和nci-h322细胞时5.9nm至1.15μm以及9.2nm至＞3.1μm范围内的ic50值。表5示出了每个测定法的结合egfr的fn3域的生物学特性的汇总。实例4：结合egfr的fn3域的工程改造亚组的结合egfr的fn3域被工程改造为增加每个分子的构象稳定性。通过dna合成将已表明改善fn3域稳定性的突变l17a、n46v和e86i(描述于美国专利公开us2011/0274623)掺入到克隆p54ar4-83、p54cr4-31和p54ar4-37中。如上所述，将新突变体p54ar5-83v2、p54cr431-v2和p54ar4-37v2表达并纯化。使用pbs中的差示扫描量热法评估每个突变体的稳定性，以便将其与对应亲本分子的稳定性相比较。表6示出了每个变体分子被显著稳定，其中tm的平均增加值为18.5℃。表6：fn3域克隆seqidno：tm(℃)p54ar4-832550.6p54ar4-83v22769.8p54cr4-312660.9p54cr4-31v22878.9p54ar4-372245.9p54ar4-37v22964.2实例5：结合c-met并抑制hgf结合的iii型纤连蛋白(fn3)域的选择对人c-met的淘选针对生物素酰化人c-met细胞外域(bt-c-met)来筛选tcl14文库，以鉴定能够特异性地结合c-met的fn3域。对于选择，使3μg的tcl14文库在大肠杆菌s30线性提取物(promega，madison，wi)中体外转录并翻译(ivtt)，并且表达的文库用cisblock(2％的bsa(sigma-aldrich，st.louis，mo)、100μg/ml鲱鱼精dna(promega)、1mg/ml肝素(sigma-aldrich)封闭。对于选择，bt-c-met以浓度为400nm(第1轮)、200nm(第2和3轮)和100nm(第4和5轮)添加。结合的文库成员使用中和亲和素磁珠(thermofisher，rockford，il)(第1、3和5轮)或链霉亲和素磁珠(promega)(第2和4轮)回收，并且未结合的文库成员通过用500ul的pbs-t洗涤珠粒5-14次接着用500μl的pbs洗涤2次来移除。进行另外的选择轮以便鉴定具有提高的亲和力的fn3域分子。简而言之，如上所述制备来自第5轮的输出并且使其经历另外重复轮的选择，除了以下变化：与bt-c-met的温育从1小时减少至15分钟，并且珠粒捕获从20分钟减少至15分钟，bt-c-met减少至25nm(第6和7轮)或2.5nm(第8和9轮)，并且在过量的非生物素酰化c-met存在下进行另外1小时的洗涤。这些变化的目的是同时选择具有可能较快的结合速率和较慢的解离速率的结合物，产生大致较低的kd。使用标准方案，利用tcon6(seqidno.30)和tcon5e86ishort(seqidno.31)引物，将第5、7和9轮输出pcr克隆到包含不依赖连接酶的克隆位点的修饰pet15载体(emdbiosciences，gibbstown，nj)(pet15-lic)中，并且在转化和iptg诱导(1mm终浓度，30℃下持续16小时)后将蛋白质表达为c端带his6标签的蛋白质。通过离心收获细胞并随后用补充有0.2mg/ml鸡蛋清溶解酵素(sigma-aldrich)的bugbusterht(emdbiosciences)裂解。通过离心使细菌溶解物澄清并将上清液转移至新的96深孔板。筛选抑制hgf结合于c-met的fn3域在生物化学形式中针对它们抑制hgf结合于经纯化的c-met胞外域的能力来筛选存在于大肠杆菌裂解物中的fn3域。将重组人c-metfc嵌合体(pbs中的0.5μg/ml，100μl/孔)包被于96孔白色maxisorp板(nunc)上并在4℃下温育过夜。在biotek洗板机上使用300μl/孔含0.05％吐温20的tris缓冲盐水(tbs-t，sigma-aldrich)将板洗涤两次。在摇动的情况下在室温(rt)下用startingblockt20(200μl/孔，thermofisherscientific，rockland，il)封闭测定板1小时，并且再用300ul的tbs-t洗涤两次。使用hamiltonstarplus机器人系统将fn3域裂解物稀释于startingblockt20(从1∶10到1∶100,000)中。在摇动的情况下在室温下将裂解物(50μl/孔)在测定板上温育1小时。在不洗涤板的情况下，在室温下将bt-hgf(startingblockt20中的1μg/ml，50μl/孔，生物素酰化)加入板中持续30min，同时伴以摇动。包含tencon27裂解物的对照孔容纳有startingblockt20或稀释的bt-hgf。然后用300μl/孔的tbs-t将板洗涤四次，并且在摇动的情况下在室温下用100μl/孔的链霉亲和素-hrp(tbs-t中的1∶2000，jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)温育30-40分钟。再用tbs-t将板洗涤四次。为形成信号，将根据制造商说明书制备的pod化学发光底物(50μl/孔，rochediagnostics，indianapolis，in)加入板中，并且在大约3分钟内，使用softmaxpro在moleculardevicesm5上读取发光。使用下列计算来测定抑制百分比：100-((rlu样品-平均rlu无bt-hgf对照)/(平均rlubt-hgf对照-平均rlu无bt-hgf对照)*100)。50％或更大的抑制百分比值被视为活性化合物(hits)。fn3域的高通量表达和纯化用hismultitraptmhp板(gehealthcare)从澄清的大肠杆菌裂解物纯化带his标签的fn3域，并在ph7.4的包含20mm磷酸钠、500mm氯化钠和250mm咪唑的缓冲液中洗脱。使用pdmultitraptmg-25板(gehealthcare)将经纯化的样品交换到pbsph7.4中以用于分析。hgf结合于c-met的抑制的ic50测定在hgf竞争测定法中进一步表征所选fn3域。利用上述测定法建立经纯化的fn3域的剂量响应曲线(起始浓度为5μm)。计算抑制百分比值。将数据作为抑制％对fn3域摩尔浓度的对数作图，并且使用graphpadprism4将数据拟合到具有可变斜率的s形剂量响应来测定ic50值。从第5轮鉴定出在1∶10稀释度下显示活性且ic50值在0.5至1500nm范围内的35个独特序列。第7轮得到在1∶100稀释度下具有活性且ic50值在0.16至2.9nm范围内的39个独特序列。从第9轮鉴定出66个独特序列，其中活性化合物(hits)被定义为在1∶1000的稀释度下具有活性。在第9轮中观察到低至0.2nm的ic50值(表8)。所选结合c-met的fn3域对c-met-fc的亲和力测定(c-met-fc亲和力)根据实例3中对于结合egfr的fn3域的亲和力测定所述的方法，测定对所选结合c-met的fn3域的亲和力，不同的是在实验中使用c-met-fc融合蛋白。实例6：结合c-met并抑制hgf结合的fn3域的表征按照以上在实例2中所述的方法表达并纯化fn3域。分别按照以上在实例1和2中所述的方法进行尺寸排阻色谱法和动力学分析。表7示出了c-链、cd环、f-链和fg环的序列以及每个域的完整氨基酸序列的seqidno：。表7：c环残基对应于所指示seqidno：的第28-37位残基cd链残基对应于所指示seqidno：的第38-43位残基f环残基对应于所指示seqidno：的第65-74位残基fg链残基对应于所指示seqidno：的第75-81位残基所选结合c-met的fn3域对细胞上的c-met的结合(“h441细胞结合测定”)将nci-h441细胞(目录号htb-174，americantypeculturecollection，manassas，va)以每孔20,000个细胞接种于聚d-赖氨酸包被的黑色透明底96孔板(bdbiosciences，sanjose，ca)中，并使之在37℃、5％的co2下附着过夜。在4℃下将经纯化的fn3域(50μl/孔；0至1000nm)加入两个平行测定板中的细胞中持续1小时。移除上清液，并且用facs染色缓冲液(150μl/孔，bdbiosciences，目录号554657)将细胞洗涤三次。将细胞与生物素酰化抗his抗体(以1∶160稀释于facs染色缓冲液中，50μl/孔，r&dsystems，目录号bam050)在4℃下温育30分钟。用facs染色缓冲液(150μl/孔)将细胞洗涤三次，之后将孔与抗小鼠igg1-alexa488缀合抗体(以1∶80稀释于facs染色缓冲液中，50μl/孔，lifetechnologies，目录号a21121)在4℃下温育30分钟。用facs染色缓冲液(150μl/孔)将细胞洗涤三次并留在facs染色缓冲液(50μl/孔)中。使用acumenex3读板机测定总荧光。将数据作为原始荧光信号对fn3域摩尔浓度的对数作图，并且使用graphpadprism4(graphpadsofiware)拟合到具有可变斜率的s形剂量-响应曲线，以计算ec50值。发现fn3域表现出一系列结合活性，并且ec50值在1.4nm与22.0nm之间，如表8中所示。hgf刺激的c-met磷酸化的抑制使用得自mesoscalediscovery(mesoscalediscovery(gaithersburg，md)的c-met磷酸化(tyr1349)试剂盒，测试经纯化的fn3域抑制nci-h441中hgf刺激的c-met磷酸化的能力。将细胞以20,000/孔接种于透明96孔组织培养处理板中含10％胎牛血清(fbs；lifetechnologies)的100μl/孔rpmi培养基(包含glutamax和hepes，lifetechnologies)中，并使之在37℃、5％的co2下附着过夜。将培养基完全移除，并且在无血清rpmi培养基(100μl/孔)中在37℃、5％的co2下对细胞进行饥饿处理过夜。然后为细胞补充包含20μm及更低浓度的fn3域的新鲜无血清rpmi培养基(100μl/孔)，在37℃、5％的co2下持续1小时。对照仅用培养基处理。用100ng/ml重组人hgf(100μl/孔，r&dsystems目录号294-hgn)刺激细胞并在37℃、5％的co2下温育15分钟。一组对照孔保持不刺激，作为阴性对照。然后将培养基完全移除，并且根据制造商说明书，在摇动的情况下在室温下用完全裂解缓冲液(50μl/孔，mesoscalediscovery(mesoscalediscovery))裂解细胞10分钟。根据制造商说明书，用所提供的封闭溶液在室温下将被配置用于测量磷酸化c-met的测定板封闭1小时。然后用tris洗涤缓冲液(200μl/孔，mesoscalediscovery)将板洗涤三次。将细胞裂解物(30μl/孔)转移到测定板，并且在摇动的情况下在室温下温育1小时。然后用tris洗涤缓冲液将测定板洗涤四次，之后将冰冷检测抗体溶液(25μl/孔，mesoscalediscovery)加入每孔中，在摇动的情况下在室温下持续1小时。再用tris洗涤缓冲液将板冲洗四次。通过如下方式检测信号：加入150读取缓冲液(150μl/孔，mesoscalediscovery)并且使用制造商安装的测定专用默认设置，在成像器6000仪器(mesoscalediscovery)上读数。将数据作为电化学发光信号对fn3域摩尔浓度的对数作图，并且使用graphpadprism4将数据拟合到具有可变斜率的s形剂量响应来测定ic50值。发现fn3域以4.6nm至1415nm范围内的ic50值抑制磷酸化c-met，如表8所示。人瘤细胞生长的抑制通过如下方式评估c-met依赖性细胞生长的抑制：在暴露于结合c-met的fn3域后，测量u87-mg细胞(美国典型培养物保藏中心，目录号htb-14)的活力。将细胞以每孔8000个细胞接种于不透明的白色96孔组织培养处理板(nunc)中补充有10％的fbs的100μl/孔rpmi培养基中，并使之在37℃、5％的co2下附着过夜。接种后二十四小时，吸出培养基并为细胞补充无血清rpmi培养基。表8：血清饥饿后二十四小时，通过加入包含结合c-met的fn3域的无血清培养基(30μl/孔)来处理细胞。将细胞在37℃、5％的co2下温育72小时。通过如下方式检测活细胞：加入100μl/孔的celltiter-试剂(promega)，然后在板摇动器上混合10分钟。在设定为发光模式的spectramaxm5读板机(moleculardevices)上读取板，读取时间为0.5秒/孔。将数据作为原始发光单位(rlu)对fn3域摩尔浓度的对数作图。使用graphpadprism4将数据拟合到具有可变斜率的s形剂量响应的方程，来测定ic50值。表8报告了1nm至＞1000nm范围内的ic50值。结合c-met的fn3域的特征汇总于表8中。结合c-met的fn3域的热稳定性使用pbs中的差示扫描量热法评估每个fn3域的稳定性。实验的结果在表9中示出。表9：实例7：双特异性抗egfr/c-met分子的构建和表征双特异性egfr/c-met分子的构建将实例1-6中所述的结合egfr和c-met的fn3域的多种组合连接成能够结合于egfr和c-met两者的双特异性分子。另外，制备具有以seqidno：107-110示出的氨基酸序列的结合egfr的fn3域以及具有以seqidno：111-114示出的氨基酸序列的结合c-met的fn3域，并连接成双特异性分子。形成合成基因以便编码以seqidno：50-72、106、118-121或190-193(表10)所述的氨基酸序列，使得下列形式得以保持：结合egfr的fn3域，之后是肽接头，之后是结合c-met的fn3域。将聚组氨酸标签掺入到c端以有助于纯化。除了表10中所述的那些分子之外，这两个fn3域之间的接头还根据如表11中所列的长度、序列组成和结构而变化。可以设想到多种其他接头可用于连接此类fn3域。使双特异性egfr/c-met分子表达，并且如针对单特异性egfr或c-metfn3域所述，使用imac和凝胶过滤色谱法步骤从大肠杆菌纯化。对本领域的技术人员明显的是，双特异性egfr/c-met分子可包含或可不包含引发剂甲硫氨酸。具有引发剂甲硫氨酸的示例性分子为具有seqidno：106、118-121、138-165、190和192所示的氨基酸序列的分子，并且不具有引发剂甲硫氨酸的示例性分子以seqidno：50-72、191和193示出。对于结合egfr的fn3域，引发剂甲硫氨酸的存在确保了适当的活性；引发剂甲硫氨酸对于c-metfn3域具有较小影响。表10：表11：与单独的单特异性分子相比，双特异性egfr/c-met分子增强了效力，表明有亲合力将nci-h292细胞接种于96孔板中含10％的fbs的rpmi培养基中。24小时后，将培养基更换为无血清rpmi。血清饥饿后24小时，用如下不同浓度的fn3域处理细胞：高亲和力单特异性egfrfn3域(p54ar4-83v2)，弱亲和力单特异性c-metfn3域(p114ar5p74-a5)，两种单特异性egfr和c-metfn3域的混合物，或由低亲和力c-metfn3域连接到高亲和力egfrfn3域(ecb1)构成的双特异性egfr/c-met分子。将细胞用单特异性或双特异性分子处理1小时，然后在37℃、5％的co2下用egf、hgf或egf与hgf的组合刺激15分钟。用msd裂解缓冲液裂解细胞，并且如上所述根据制造商说明书，使用适当msd测定板评估细胞信号传导。低亲和力c-metfn3域以610nm的ic50抑制c-met的磷酸化(图4)。如预期，egfrfn3域不能抑制c-met磷酸化，并且单特异性分子的混合物似乎与单独的c-metfn3域相同。然而，双特异性egfr/c-met分子以1nm的ic50抑制c-met的磷酸化(图4)，相对于单独的c-met单特异性分子而言在改善效力方面提供了2-log的改变。在具有可变c-met和egfr密度和比率的多种细胞类型中评价了双特异性egfr/c-met分子通过亲合力效应增强对c-met和/或egfr磷酸化的抑制的潜能(图5)。将nci-h292、nci-h441或nci-h596细胞接种于96孔板中含10％的fbs的rpmi培养基中。24小时后，将培养基更换为无血清rpmi。血清饥饿后24小时，用不同浓度的单特异性的结合egfr的fn3域、单特异性c-metfn3域或双特异性egfr/c-met分子(ecb5，由p53a1r5-17v2和p114ar7p94-a3构成)处理细胞。将细胞用单特异性或双特异性分子处理1小时，然后在37℃、5％的co2下用egf、hgf或egf与hgf的组合刺激15分钟。用msd裂解缓冲液裂解细胞，并且如上所述根据制造商说明书，使用适当msd测定板评估细胞信号传导。图5(a-c)示出了在三种不同细胞系中与双特异性egfr/cmet分子相比使用单特异性的结合egfr的fn3域时egfr的抑制。为了在egfr磷酸化测定法中评估亲合力，将中等亲和力结合egfr的fn3域(1.9nm)(p53a1r5-17v2)与双特异性egfr/c-met分子(0.4nm)(p114ar7p94-a3)相比较，该双特异性egfr/c-met分子包含连接到高亲和力结合c-met的fn3域的相同结合egfr的fn3域。在h292和h596细胞中，单特异性和双特异性分子对egfr的磷酸化的抑制是相当的(图5a和5b)，可能是因为这些细胞系具有egfr与c-met受体的高比率。为了测试该理论，在显示c-met受体比egfr更多的nci-h441细胞中评价egfr磷酸化的抑制。与具有结合egfr的fn3域的单特异性分子相比，用双特异性egfr/c-met分子处理nci-h441细胞将抑制egfr磷酸化的ic50降低了30倍(图5c)。使用具有对egfr(0.26nm)的高亲和力及对c-met(10.1nm)的中等亲和力的分子，在c-met磷酸化测定法中评价了双特异性egfr/c-met分子增强效力的可能性。在nci-h292和nci-h596细胞两者中，与单特异性的结合c-met的fn3域相比，双特异性分子分别将c-met的磷酸化的抑制增强134倍和1012倍(图5d和5e)。已证实，双特异性egfr/c-met分子增强抑制egfr和c-met磷酸化的效力转化为增强抑制信号传导和增殖。对于这些实验，将结合fn3egfr和结合c-met的fn3域的混合物与双特异性egfr/c-met分子相比较。如表12和13中所述，当用双特异性egfr/c-met分子处理细胞时，与单特异性的结合物的混合物相比，erk磷酸化(表12)和h292细胞增殖(表13)的ic50值减小。相对于两种单特异性egfr和c-metfn3域的混合物，双特异性egfr/c-met分子对erk磷酸化抑制的ic50低143倍，在该测定法中显示了亲合力对分子效力的效应。在表12中，单特异性的结合egfr和c-met的fn3域不会完全抑制活性，因此所示ic50值应视为下限。使用作为混合物或以双特异性形式连接的结合egfr和c-met的fn3域的不同组合，完成增殖测定。相对于单特异性亲本结合egfr或c-met的fn3域的混合物，双特异性egfr/c-met分子抑制增殖的ic50低34-236倍。这证实，在受体水平观察到的亲合力效应(图4和图5)转化为在抑制细胞信号传导(表12)和细胞增殖(表13)方面的改善。表12：表13：体内移植瘤：pk/pd为了测定体内单特异性和双特异性fn3域分子的疗效，对瘤细胞进行工程改造以分泌人hgf(鼠hgf不结合于人c-met)。使用慢病毒感染(表达人hgf的慢病毒dna载体(登录号x16322)和得自genecopoeia的慢病毒包装试剂盒)在nci-h292细胞中稳定表达人hgf。感染后，用4μg/ml嘌呤霉素(invitrogen)选择表达hgf的细胞。使用得自mesoscalediscovery的测定板在合并细胞的调理培养基中检测人hgf蛋白质。在每只动物的背侧上对scidbeige小鼠皮下接种表达人hgf的nci-h292细胞(200μl体积cultrex(trevigen)中的2.0×106个细胞)。每周进行两次瘤测量，直到瘤体积在150-250mm3之间的范围内。然后给予小鼠单一腹腔剂量的双特异性egfr/c-met分子(连接到白蛋白结合域以延长半衰期)或pbs媒介物。在给药后6h或72h，取出瘤并立即冷冻于液氮中。经由心脏穿刺将血液样品收集到含3.8％柠檬酸盐的蛋白酶抑制剂中。收集后立即将血液样品离心，并且将所得血浆转移到样品管中并保存于-80℃下。将瘤称重，切成小块，并在包含加有halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂(pierce)、50mm氟化钠(sigma)、2mm活化原钒酸钠(sigma)和1mm的pmsf(mesoscalediscovery)的ripa缓冲液的裂解基质a试管(lma)中裂解。将裂解物从lma基质移除并且离心除去不溶蛋白。用bca蛋白测定法定量可溶瘤蛋白，并且在瘤裂解缓冲液中稀释到等同蛋白水平。使用得自mesoscalediscovery的测定板(根据制造商方案并如上文所述)测量磷酸化c-met、egfr和erk。图6示出了实验的结果。在6h和72h时，每个双特异性egfr/c-met分子显著降低了磷酸化c-met、egfr和erk的水平。图6中所示的数据显示同时抑制c-met和egfr两者的重要性以及双特异性egfr/c-met分子对每个受体的亲和力在抑制下游erk方面起到的作用。在6h和72h时，与包含中等亲和力结合egfr的fn3域的分子(p53a1r5-17v2；图中以“17”示出，kd＝1.9nm)相比，包含高亲和力结合egfr的fn3域的分子(p54ar4-83v2；图中以“8”示出，kd＝0.26nm)将egfr的磷酸化抑制到更大程度。在6小时的时间点，所测试的所有四种双特异性分子完全抑制了erk的磷酸化，而与亲和力无关。在72小时的时间点，与中等亲和力结合c-met的fn3域(p114ar5p74-a5；图中以“a5”示出；kd＝10.1nm；图6)相比，包含紧密亲和力c-met结合域的分子(p114ar7p94-a3；图中以“a3”示出，kd＝0.4nm)显著抑制了erk的磷酸化。在血液和瘤中给药后6和72小时，测量每个双特异性egfr/c-met分子的浓度(图7)。有趣的是，在6小时处，相对于其他分子而言，具有中等亲和力egfr结合域(p53a1r5-17v2；kd＝1.9nm)但具有高亲和力结合c-met的fn3域(p114ar7p94-a3；kd＝0.4nm)的双特异性分子具有明显更多的瘤积聚，但到72小时该差异减小。可假设瘤之外的细胞具有更低水平的egfr和c-met表面表达，因此与更高亲和力结合egfr的fn3域相比，中等亲和力egfr分子不紧密地结合于正常组织。因此，有更多游离的中等亲和力结合egfr的fn3域可供结合于瘤中。因此，鉴定对每个受体的适当亲和力可允许鉴定具有降低的系统性毒性和增加的瘤积聚的治疗剂。采用双特异性egfr/c-met分子的瘤疗效研究在每只动物的背侧对scidbeige小鼠皮下接种表达人hgf的nci-h292细胞(200μlcultrex(trevigen)中的2.0×106个细胞)。植入后一周，小鼠被分为具有相等瘤体积的组(平均瘤体积＝77.9+/-1.7mm3)。用双特异性分子每周给予小鼠三次，并每周记录瘤体积两次。使用具有对c-met和egfr的可变亲和力的四种不同双特异性分子观察瘤生长抑制(tgi)。图8示出了抑制c-met和egfr两者的有益效果，因为当结合c-met的fn3域为中等亲和力时，与中等亲和力结合egfr的fn3域相比，在用包含高亲和力结合egfr的fn3域的分子治疗的小鼠中观察到瘤生长延迟(空心与实心三角形，p54ar4-83v2-p114ar5p74-a5与p53a1r5-17-p114ar5p74-a5相比)。此外，数据显示出具有高亲和力结合c-met的fn3域的重要性，因为包含高或中等亲和力结合egfr的fn3域但包含高亲和力结合c-met的fn3域的双特异性分子显示出最大疗效(灰色和黑色点线，p54ar4-83v2-p114ar7p94-a3和p53a1r5-17v2-p114ar7p94-a3)。双特异性分子及egfr和c-met的其他抑制剂的疗效在scid/beige小鼠的皮下h292-hgf人肺癌移植瘤模型的治疗中评价了双特异性egfr/c-met分子(ecb38)及小分子抑制剂克唑替尼(c-met抑制剂)和厄洛替尼(egfr抑制剂)、西妥昔单抗(抗egfr抗体)(各作为单一药剂)以及克唑替尼与厄洛替尼联用的体内疗效。在37℃下在空气的5％的co2气氛中，在补充有胎牛血清(10％v/v)和l-谷氨酰胺(2mm)的rpmi1640培养基中体外维持h292-hgf细胞。每周通过胰蛋白酶-edta处理将细胞常规地继代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并且计数以进行瘤接种。表14：n：动物数目；p.o.：：口服；i.p.：腹膜内注射3次/周：在一周的第1、3和5天给药。qd：每天一次，q4d：每四天一次；克唑替尼与厄洛替尼联用的时间间隔为0.5小时；基于体重调整给药量(10l/g)；a：分组后第14天不给药。每只小鼠在右侧区皮下接种在0.1ml的含用于瘤发展的cultrex(1∶1)的pbs中的h292-hgf瘤细胞(2×106)。当平均瘤尺寸达到139mm3时开始处理。在下列实验设计表中示出了每个研究组中的测试制品施用和动物数目。瘤细胞接种的日期表示为第0天。表14示出了处理组。在开始处理之前，将所有动物称重并测量瘤体积。由于瘤体积可影响任何给定处理的有效性，使用基于它们的瘤体积的随机化区组设计，将小鼠分配到各组。这确保了在基线处所有组是相当的。随机化区组设计用于将实验动物分配到各组。首先，根据其初始瘤体积将实验动物分成均匀区组。其次，在每个区组内，进行实验动物对处理的随机化。使用随机化区组设计分配实验动物确保了每只动物有相同概率被分配到给定处理，从而减少系统误差。在常规监测时，检查动物瘤生长和处理对正常行为的任何效应，诸如可动性、食物和水消耗量的目测、体重增加/减轻(每周测量两次体重)、眼光/毛发暗淡和任何其他异常效应。终点是瘤生长是否可被延迟或荷瘤小鼠是否可被治愈。每周使用卡尺在两个维度上测量瘤尺寸两次，并且使用下式表示以mm3计的体积：v＝0.5a×b2，其中a和b分别是瘤的长直径和短直径。然后使用瘤尺寸计算t-c值和t/c值两者。计算t-c，其中t是处理组的平均瘤尺寸达到1000mm3所需的时间(以天计)，并且c是对照组的平均瘤尺寸达到相同尺寸的时间(以天计)。t/c值(以百分比计)是抗瘤疗效的指示；t和c分别是在给定天处理组和对照组的平均瘤体积。瘤完全消退(cr)被定义为瘤减小到低于触诊的极限(62.5mm3)。瘤部分消退(pr)被定义为瘤从初始瘤体积减小。需要在3次或更多次连续瘤测量中cr或pr的最短持续时间，cp或pr被视为持久的。对体重减轻超过20％或该组的平均瘤尺寸超过2000mm3的动物施行安乐死。在最后一剂量后观察两周之后终止研究。在每个时间点提供每组的瘤体积的汇总统计，包括平均值和平均值的标准误差(sem)，并示于表15中。使用单因素方差分析，之后使用games-howell(未假定等方差)进行个体比较，以此来评价各组间瘤体积差异的统计分析。所有数据利用spss18.0分析，p＜0.05被视为统计意义上的显著性。表15：在瘤接种后第23天，媒介物处理组(第1组)的平均瘤尺寸达到1,758mm3。用25mg/kg剂量水平的双特异性egfr/c-met分子进行处理(第2组)导致所有小鼠中瘤完全消退(cr)，这在＞3次连续瘤测量中是持久的(在第23天，与媒介物组相比，平均tv＝23mm3，t/c值＝1％，p＝0.004)。用50mg/kg剂量水平的作为单一药剂的克唑替尼进行处理(第3组)未显示抗瘤活性；在第23天，平均瘤尺寸为2,102mm3(与媒介物组相比，t/c值＝120％，p＝0.944)。用50mg/kg给药水平的作为单一药剂的厄洛替尼进行治疗(第4组)显示出微量抗瘤活性，但与媒介物组相比，未发现显著的差异；在第23天，平均瘤尺寸为1,122mm3(与媒介物组相比，t/c值＝64％，p＝0.429)，与媒介物组相比，在瘤尺寸为1,000mm3时，瘤生长延迟4天。克唑替尼(50mg/kg，第5组)与厄洛替尼(50mg/kg，第5组)的联用显示出显著的抗瘤活性；在第23天，平均瘤尺寸为265mm3(t/c＝15％；p＝0.008)，与媒介物组相比，在瘤尺寸为1,000mm3时，瘤生长延迟17天。1mg/小鼠给药水平的作为单一药剂的西妥昔单抗(第6组)显示出显著的抗瘤活性；在第23天，平均瘤尺寸为485mm3(t/c＝28％；p＝0.018)，与媒介物组相比，在瘤尺寸为1,000mm3时，瘤生长延迟17天。图9和表16示出了各种疗法的抗瘤活性。表16：在媒介物组中观察到中等到严重的体重减轻，这可能是由于增加的瘤负荷；到第23天，3只小鼠死亡，并且当bwl＞20％时，对1只小鼠施行安乐死。在第2组中观察到双特异性egfr/c-met分子的轻微毒性；在处理期过程中当bwl＞20％时，对3只小鼠施行安乐死。在2周观察期过程中，当撤去处理时，体重逐渐恢复。与媒介物组相比，在克唑替尼或厄洛替尼单一疗法组中观察到更严重的体重减轻，暗示处理相关的毒性。在给药期过程中大体能耐受克唑替尼与厄洛替尼联用，但在研究结束时观察到严重的体重减轻，这可能是由于在非处理期过程中恢复了快速瘤生长。在该研究中西妥昔单抗的单一疗法能被良好耐受；仅在研究结束时观察到体重减轻，这是由于瘤生长恢复。总之，25mg/kg的双特异性egfr/c-met分子(3次/周×3周)在scid/beige小鼠中的h292-hgf人肺癌移植瘤模型中产生了完全响应。该处理在10只小鼠中有7只耐受，并且导致10只小鼠中有3只严重体重减轻。图9示出了处理后各时间点期间各种疗法对瘤尺寸的影响。实例8：双特异性egfr/c-met分子的半衰期延长已描述了用于减少肾过滤并从而延长蛋白质的血清半衰期的多种方法，包括用聚乙二醇(peg)或其他聚合物修饰、结合于白蛋白、与结合于白蛋白或其他血清蛋白的蛋白域融合、与白蛋白的基因融合、与iggfc域的融合，以及与非结构化长氨基酸序列的融合。用peg修饰双特异性egfr/c-met分子，以便通过在分子c端掺入游离半胱氨酸来增加流体力学半径。最常见的是，半胱氨酸残基的游离巯基用于使用标准方法连接用马来酰亚胺或碘乙酰胺基团官能化的peg分子。各种形式的peg可用于修饰蛋白，包括1000、2000、5000、10,000、20,000或40,000kda的直链peg。这些分子量的支链peg分子也可用于修饰。在一些情况下，peg基团也可通过双特异性egfr/c-met分子中的伯胺连接。除聚乙二醇化之外，双特异性egfr/c-met分子的半衰期还可通过将这些蛋白制备成与天然存在的3-螺旋束血清白蛋白结合域(abd)或共有白蛋白结合域(abdcon)的融合分子来延长。这些蛋白域经由表12中所述的任何接头连接到结合c-met的fn3域的c端。abd或abdcon域也可在一级序列中设置在结合egfr的fn3域与结合c-met的fn3域之间。在一些情况下，将白蛋白或白蛋白变体(seqidno：189)连接至双特异性egfr/c-met分子，至结合c-met的fn3域的c端。实例9：所选双特异性egfr/c-met分子的表征表征了所选双特异性egfr/c-met分子对egfr和c-met两者的亲和力、抑制egfr和c-met自磷酸化的能力以及对hgf细胞增殖的效应。还根据实例3中所述的方案，使用proteon仪器(biorad)，通过表面等离子共振方法分析了双特异性egfr/c-met分子对重组egfr和/或c-met胞外域的结合亲和力。表征的结果在表17中示出。表17：*ecb158为经由seqidno：224的(ggggs)2接头缀合至人血清白蛋白变体c34s的ecb168实例10：结合egfr和c-met的fn3域的互补位对分子p54ar4-83v2(seqidno：27)进行一系列的突变以限定对结合至egfr胞外域重要的残基。关于该分析，将bc和fg环中的每个氨基酸位置一次性突变成丙氨酸以产生18个新分子。通过spr分析，利用proteon仪器测定这些突变体结合至egfr的亲和力。结果示于表18中。10个位置导致结合亲和力的丧失大于10倍，从而指示这些位置有助于结合至egfr。倍数变化指示变体相比于亲本p54ar4-83v2的kd值的倍数变化。bc和fg环的残基的组合构成结合表面。10个位置示出弱化对egfr的结合10倍以上，并且5个位置示出弱化对egfr的结合100倍以上(d23、f27、y28、v77、g85)。除了p54ar4-83v2之外，结合egfr的分子p54ar4-48、p54ar4-81、p53a1r5-17v2、p54ar4-83v22和p54ar4-83v23(分别为seqidno：21、25、107、108和109)在当突变时弱化egfr结合100倍以上的互补位位置处具有相同残基。所生成的一些双特异性egfr/c-met分子包含p54ar4-83v2、p54ar4-48、p54ar4-81、p53a1r5-17v2、p54ar4-83v22或p54ar4-83v2作为其结合egfr的fn3域，如表10所示。表18：分子seqidno：ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)倍数变化p54ar4-83v2273.54e+054.98e-050.14183v2d22a1942.15e+053.01e-050.14183v2d23a1951.32e+054.20e-0331.822783v2p24a1967.81e+042.19e-042.82083v2w25a1971.10e+051.69e-041.51183v2f27a1982.32e+045.56e-042417183v2y28a1994.36e+043.86e-0388.563283v2h75a2001.67e+056.55e-043.92883v2n76a2012.08e+057.43e-050.36383v2v77a2027.88e+048.55e-0310877183v2y78a2031.82e+055.14e-042.82083v2k79a2046.81e+052.83e-050.04083v2d80a2051.23e+055.46e-050.45383v2m83a2061.77e+052.74e-041.51183v2r84a2072.34e+051.37e-040.59483v2g85a2087.30e+042.20e-0330.121583v2l86a2093.09e+051.17e-040.38383v2t81a2102.28e+058.38e-050.37383v2n82a2111.94e+059.67e-050.54同样，对分子p114ar7p95-a3(seqidno：41)的假设c-met交互表面进行一系列的突变以限定对靶向结合重要的位置。该分析在双特异性分子ecb15(seqidno：145)的情况下进行，并且丝氨酸替代如上文所述的丙氨酸被用作替换。选择丝氨酸以降低所得突变体的疏水性。表19示出了具有相对于分子a3(seqidno：41)的位置编号的每个突变位置的spr结果。7个位置示出弱化对c-met的结合10倍以上。突变体m72s、r34s和i79s的结合是不可测量的。f38s突变减少对c-met的结合100倍以上。该数据证明，有助于c-met结合的位置分布于c链、f链、cd环和fg环之间。倍数变化指示变体相比于亲本p114ar7p95-a3的kd值的倍数变化。除了p114ar7p94-a3之外，结合c-met的分子p114ar7p92-f3、p114ar7p95-d3、p114ar7p95-f10和p114ar7p95-h8(分别为seqidno：34、44、47和49)在当突变时弱化c-met结合100倍以上的互补位位置处具有相同残基。表19：样品seqidno：ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)倍数变化ecb151453.51e+051.33e-040.41a3k78s2124.40e+051.50e-040.30.75a3g40s2131.85e+053.20e-041.74.25a3l39s2144.75e+051.27e-032.76.75a3v68s2153.29e+051.20e-033.69a3n70s2164.25e+052.49e-035.914.75a3p81s2173.21e+055.36e-041.74.25a3f36s2181.88e+055.12e-0327.268a3w32s2192.89e+058.60e-0329.874.5a3m72s220---a3r34s221---a3f38s2224.51e+043.23e-027171792.5a3i79s223---实例11：通过双特异性egfr/c-met分子抑制人瘤细胞生长人瘤细胞生长的抑制在按照实例3或6中所述的标准附着培养中，或在低附着培养条件下评估。为了评估低附着条件下的存活率，将细胞接种于超低附着性96孔板(corningcostar)中含glutamax和25mmhepes且补充有1mm丙酮酸钠(gibco)、0.1mmneaa(gibco)和10％热灭活胎牛血清(gibco)的50μl/孔rpmi培养基(invitrogen)中，并使之在37℃、5％的co2下附着过夜。将细胞用不同浓度的抗体(终浓度0.035-700nm)以及hgf(7.5ng/ml，r&dsystems目录号294-hgn)处理，然后在37℃、5％的co2下温育72小时。一些孔不用hgf或抗体处理，作为对照。使用celltiter-试剂(promega)检测活细胞，并且如以上在实例3的“人瘤细胞生长的抑制(nci-h292生长和nci-h322生长测定法)”中所述分析数据，不同的是在读取发光之前将裂解物转移到不透明的白色96孔组织培养处理板(perkinelmer)中。在最大细胞生长抑制为＞40％并且相对ic50＜5mm的那些情形下，细胞系被分类为对egfr/c-met双特异性分子的强响应者。ecb15的抑制活性在多个细胞系中评估，这些细胞系具有野生型、扩增或突变egfr和野生型或扩增c-met。ecb15抑制表20所示的细胞系的瘤细胞生长。ecb15还抑制具有突变t790m的nci-h1975细胞系的生长，突变t790m已示出导致对tki(诸如厄洛替尼片)的抗性。表20：细胞系组织学egfrc-metnci-h1650支气管肺泡腺癌del(e746，a750)wtskmes-1鳞状wtwtnci-h1563腺癌glc-82腺癌calu-3腺癌nci-h1573腺癌ampampnci-h1435nsclcnci-h1975nsclcl858r；t790mwtnci-h1666支气管肺泡腺癌hcc2935nsclcdel(e746-t751)，s752ihcc4006腺癌del(l747-e749)，a750ph292粘液表皮样wtwth322腺癌wtwthcc827腺癌del(e746，a750)；ampwth596混合鳞腺wt外显子14缺失h1869鳞状wtwtwt：野生型amp：扩增del：缺失序列表seqidno：73，prt，智人，egfr1mrpsgtagaallallaalcpasraleekkvcqgtsnkltqlgtfedhflslqrmfnncev61vlgnleityvqrnydlsflktiqevagyvlialntveriplenlqiirgnmyyensyala121vlsnydanktglkelpmrnlqeilhgavrfsnnpalcnvesiqwrdivssdflsnmsmdf181qnhlgscqkcdpscpngscwgageencqkltkiicaqqcsgrcrgkspsdcchnqcaagc241tgpresdclvcrkfrdeatckdtcpplmlynpttyqmdvnpegkysfgatcvkkcprnyv301vtdhgscvracgadsyemeedgvrkckkcegpcrkvcngigigefkdslsinatnikhfk361nctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhaf421enleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkkl481fgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcn541llegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvm601genntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvv661algiglfmrrrhivrkrtlrrllqerelvepltpsgeapnqallrilketefkkikvlgs721gafgtvykglwipegekvkipvaikelreatspkankeildeayvmasvdnphvcrllgi781cltstvqlitqlmpfgclldyvrehkdnigsqyllnwcvqiakgmnyledrrlvhrdlaa841rnvlvktpqhvkitdfglakllgaeekeyhaeggkvpikwmalesilhriythqsdvwsy901gvtvwelmtfgskpydgipaseissilekgerlpqppictidvymimvkcwmidadsrpk961freliiefskmardpqrylviqgdermhlpsptdsnfyralmdeedrnddvvdadeylipq1021qgffsspstsrtpllsslsatsnnstvacidrnglqscpikedsflqryssdptgalted1081siddtflpvpeyinqsvpkrpagsvqnpvyhnqplnpapsrdphyqdphstavgnpeyln1141tvqptcvnstfdspahwaqkgshqisldnpdyqqdffpkeakpngifkgstaenaeylrv1201apqssefigaseqidno：75，prt，智人，腱生蛋白-c1mgamtqllagvflaflalateggvlkkvirhkfrqsgvnatlpeenqpvvfnhvyniklpv61gsqcsvdlesasgekdlappsepsesfqehtvdgenqivfthriniprracgcaaapdvk121ellsrleelenlvsslreqctagagcclqpatgrldtrpfcsgrgnfstegcgcvcepgw181kgpncsepecpgnchlrgrcidgqcicddgftgedcsqlacpsdcndqgkcvngvcicfe241gyagadcsreicpvpcseehgtcvdglcvchdgfagddcnkplclnncynrgrcvenecv301cdegftgedcselicpndcfdrgrcingtcyceegftgedcgkptcphachtqgrceegq361cvcdegfagvdcsekrcpadchnrgrcvdgrcecddgftgadcgelkcpngcsghgrcvn421gqcvcdegytgedcsqlrcpndchsrgrcvegkcvceqgfkgydcsdmscpndchqhgrc481vngmcvcddgytgedcrdrqcprdcsnrglcvdgqcvcedgftgpdcaelscpndchgqg541rcvngqcvchegfmgkdckeqrcpsdchgqgrcvdgqcichegftgldcgqhscpsdcnn601lgqcvsgrcicnegysgedcsevsppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpth661egglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfirvfailenkksipvsarvatylpapeglkf721ksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqeye781islhivknntrgpglkrvtttrldapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygik841dvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevslisrrgdmssnpaketfttgldaprnlr901rvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqattkttltglrpgte961ygigvsavkedkesnpatinaateldtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnys1021lptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvlltaekgrhkskparvkasteqapelenl1081tvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravdipglkaatpy1141tvsiygviqgyrtpvlsaeastgetpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvq1201eadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaathytitirgvtqdfsttplsvevlteevpdmg1261nltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragt1321pytvtlhgevrghstrplavevvtedlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviq1381vqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaatpyrvsiygvirgyrtpvlsaeastakepe1441ignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglpp1501stdfivylsglapsirtktisatattealpllenltisdinpygftvswmasenafdsfl1561vtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyevmvsgftqghqtkplraeivteae1621pevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrditgl1681reateyeielygiskgrrsqtvsaiattamgspkevifsditensatvswraptaqvesf1741rityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvklipgveylvsiiamkgfeesepvsgsfttald1801gpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepa1861teytlrifaekgpqksstitakfttdldsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllv1921yesvdgtvkevivgpdttsysladlspsthytakiqalngplrsnmiqtifttigllypf1981pkdcsqamlngdttsglytiylngdkaealevfcdmtsdgggwivflrrkngrenfyqnw2041kayaagfgdrreefwlgldnlnkitaqgqyelrvdlrdhgetafavydkfsvgdaktryk2101lkvegysgtagdsmayhngrsfstfdkdtdsaitncalsykgafwyrnchrvnlmgrygd2161nnhsqgvnwfhwkghehsiqfaemklrpsnfrnlegrrkra>seqidno：101prt智人cmet1mkapavlapgilvllftlvqrsngeckealaksemnvnmkyqlpnftaetpiqnvilheh61hiflgatnyiyvlneedlqkvaeyktgpvlehpdcfpcqdcsskanlsggvwkdninmal121vvdtyyddqliscgsvnrgtcqrhvfphnhtadiqsevhcifspqieepsqcpdcvvsal181gakvlssvkdrfinffvgntinssyfpdhplhsisvrrlketkdgfmfltdqsyidvlpe241frdsypikyvhafesnnfiyfltvqretldaqtfhtriirfcsinsglhsymemplecil301tekrkkrstkkevfnilqaayvskpgaqlarqigaslnddilfgvfaqskpdsaepmdrs361amcafpikyvndffnkivnknnvrclqhfygpnhehcfnrtllrnssgcearrdeyrtef421ttalqrvdlfmgqfsevlltsistfikgdltianlgtsegrfmqvvvsrsgpstphvnfl481ldshpvspevivehtlnqngytlvitgkkitkiplnglgcrhfqscsqclsappfvqcgw541chdkcvrseeclsgtwtqqiclpaiykvfpnsapleggtrlticgwdfgfrrnnkfdlkk601trvllgnesctltlsestmntlkctvgpamnkhfnmsiiisnghgttqystfsyvdpvit661sispkygpmaggtlltltgnylnsgnsrhisiggktctlksvsnsilecytpaqtistef721avklkidlanretsifsyredpivyeihptksfistwwkeplnivsflfcfasggstitg781vgknlnsvsvprmvinvheagrnftvacqhrsnseiiccttpslqqlnlqlplktkaffm841ldgilskyfdliyvhnpvfkpfekpvmismgnenvleikgndidpeavkgevlkvgnksc901enihlhseavlctvpndllklnselniewkqaisstvlgkvivqpdqnftgliagvvsis961talllllgfflwlkkrkqikdlgselvrydarvhtphldrlvsarsvspttemvsnesvd1021yratfpedqfpnssqngscrqvqypltdmspiltsgdsdisspllqntvhidlsalnpel1081vqavqhvvigpsslivhfnevigrghfgcvyhgtlldndgkkihcavkslnritdigevs1141qfltegiimkdfshpnvlsllgiclrsegsplvvlpymkhgdlrnfirnethnptvkdli1201gfglqvakgmkylaskkfvhrdlaarncmldekftvkvadfglardmydkeyysvhnktg1261aklpvkwmaleslqtqkfttksdvwsfgvllwelmtrgappypdvntfditvyllqgrrl1321lqpeycpdplyevmlkcwhpkaemrpsfselvsrisaifstfigehyvhvnatyvnvkcv1381apypsllssednaddevdtrpasfwets>seqidno：179prt人工结合egfr的fn3域的fg环hnvykdtnx9rgl；其中x9为m或i>seqidno：180prt人工结合egfr的fn3域的fg环lgsyvfehdvml(seqidno：180)，>seqidno：181prt人工结合egfr的fn3域的bc环x1x2x3x4x5x6x7x8(seqidno：181)；其中x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；并且x8为y、f或l。>seqidno：182prt人工结合egf的rfn3域lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnx9rglplsaeftt(seqidno：182)，x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；x8为y、f或l；并且x9为m或i。>seqidno：183prt人工结合egf的rfn3域lpapknlvvsevtedslrlswx1x2x3x4x5x6x7x8dsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvlgsyvfehdvmlplsaeftt(seqidno：183)，其中x1为a、t、g或d；x2为a、d、y或w；x3为p、d或n；x4为l或不存在；x5为d、h、r、g、y或w；x6为g、d或a；x7为a、f、g、h或d；并且x8为y、f或l。>seqidno：184prt人工结合c-met的fn3域c链和cd环序列dsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16(seqidno：184)，其中x10为w、f或v；x11为d、f或l；x12为v、f或l；x13为v、l或t；x14为v、r、g、l、t或s；x15为g、s、a、t或k；并且x16为e或d；并且>seqidno：185prt人工结合c-met的fn3域f链和fg环teyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23(seqidno：185)，其中x17为y、w、i、v、g或a；x18为n、t、q或g；x19为l、m、n或i；x20为g或s；x21为s、l、g、y、t、r、h或k；x22为i、v或l；并且x23为v、t、h、i、p、y或l。>seqidno：186prt人工结合c-met的fn3域lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfx10iryx11ex12x13x14x15gx16aivltvpgsersydltglkpgteyx17vx18ix19x20vkggx21x22sx23plsaeftt(seqidno：186)，其中x10为w、f或v；并且x11为d、f或l；x12为v、f或l；x13为v、l或t；x14为v、r、g、l、t或s；x15为g、s、a、t或k；x16为e或d；x17为y、w、i、v、g或a；x18为n、t、q或g；x19为l、m、n或i；x20为g或s；x21为s、l、g、y、t、r、h或k；x22为i、v或l；并且x23为v、t、h、i、p、y或l。>seqidno：187prt人工包含egfr/c-metfn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