Atp-结合弹夹转运蛋白的调控剂的制作方法
【专利说明】
[0001]本申请是申请号为 2013104371415(原始母案 200580028055. 2,PCT/ US2005/022768)、申请日为2005年6月24日、发明名称为"ATP-结合弹夹转运蛋白的调控 剂"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉参考
[0003] 本申请根据35U.S.C. § 119要求如下专利申请的优先权：美国临时申请 No. 60/582, 676, 2004年6月24日提交，题为"ATP-结合弹夹转运蛋白的调控剂"；美国临 时申请No.60/630, 127, 2004年11月22日提交，题为"ATP-结合弹夹转运蛋白的调控剂"； 美国临时申请此.60/635,674,2004年12月13日提交，题为'11?-结合弹夹转运蛋白的调 控剂";美国临时申请No.60/658, 219, 2005年3月3日提交，题为"ATP-结合弹夹转运蛋白 的调控剂";和美国临时申请No. 60/661，311，2005年3月11日提交，题为"ATP-结合弹夹 转运蛋白的调控剂"，每个上述申请的完整内容引用在此作为参考。
技术领域
[0004] 本发明涉及ATP-结合弹夹（ABC)转运蛋白或其片段的调控剂、包括囊性纤维化 跨膜电导调节剂（CFTR)、其组合物和与之有关的方法。本发明也涉及使用这类调控剂治疗 ABC转运蛋白介导的疾病的方法。
【背景技术】
[0005]ABC转运蛋白是膜转运蛋白家族，调节多种药理成分、潜在毒性药物和异生素以及 阴离子的转运。ABC转运蛋白是同源性膜蛋白，它们结合和利用细胞三磷酸腺苷（ATP)供它 们的特异性活性。这些转运蛋白中有些被发现是多药耐受性蛋白（象MDR1-P糖蛋白或多 药耐受性蛋白MRP1)，为恶性癌细胞防御性化学治疗剂。迄今已经鉴别了 48种ABC转运蛋 白，基于它们的序列同一性和功能分为7个家族。
[0006] ABC转运蛋白在体内扮演多种重要的生理角色，并且提供对有害环境化合物的防 御。因为如此，它们代表重要的潜在药物靶，用于治疗与该转运蛋白缺陷有关的疾病，防止 药物从靶细胞中转运出去，和干预其他其中ABC转运蛋白活性的调控可能是有益的疾病。
[0007] 普遍与疾病有关的一种ABC转运蛋白家族成员是cAMP/ATP-介导的阴离子通道 CFTR。CFTR在多种细胞类型中被表达，包括吸收性和分泌性上皮细胞，在那里它调节阴离子 的跨膜流动以及其他离子通道和蛋白质的活性。在上皮细胞中，CFTR的正常功能发挥是维 持电解质在体内各处转运的关键，包括呼吸和消化组织。CFTR由大约1480个氨基酸组成， 它们编码由跨膜结构域的串联重复要素所构成的蛋白质，各自含有六个跨膜螺旋和一个核 苷酸结合结构域。两个跨膜结构域通过大型极性调节性（R)-结构域连接，具有多个调节通 道活性和细胞运输的磷酸化位点。
[0008] 编码CFTR的基因已被鉴别和测序（参见Gregory，R.J.etal. (1990)Nature 347 ：382-386 ；Rich,D.P.etal. (1990)Nature347 ：358-362 ；Riordan,J.R.etal. (1989) Science245:1066-1073)。这种基因的缺陷引起CFTR突变，导致囊性纤维化（CF)，这是人 类最常见的致命性遗传疾病。囊性纤维化影响大约两千五百分之一的美国新生儿。在全部 美国人口中，多达一千万人携带有缺陷基因的单一副本，没有明显的疾病效应。相反，带有 两个CF相关基因副本的个体遭受CF的衰弱与致命性效应，包括慢性肺疾病。
[0009] 在囊性纤维化患者中，在呼吸道上皮中被内源性表达的CFTR的突变引起顶端阴 离子分泌减少，导致离子和体液转运的失衡。所致阴离子转运疾病对肺中粘液蓄积增强和 伴随微生物感染起作用，最终导致CF患者死亡。除了呼吸疾病以外，CF患者通常患有胃肠 问题和胰腺机能不全，如果不加治疗则导致死亡。另外，大多数囊性纤维化男性是不育的， 囊性纤维化女性的生育力降低。与两个CF相关基因副本的严重效应相反，带有单一CF相 关基因副本的个体表现对霍乱和腹泻所致脱水的抗性增加一一这也许解释了人群内相对 高频率的CF基因的原因。
[0010] CF染色体CFTR基因的序列分析已经揭示了多种致病性突变（Cutting，G.R.et al. (1990)Nature346 ：366-369 ；Dean,M.etal. (1990)Cell61 ：863 ：870；andKerem, B-S.etal. (1989)Science245：1073-1080 ；Kerem,B-Setal. (1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA87 :8447-8451)。迄今已经鉴别了1000种以上致病性CF基因突变(http：//www. genet,sickkids.on.ca/cftr/)。最常见的突变是CFTR氨基酸序列508位苯丙氨酸的缺失， 普遍被称为AF508-CFTR。这种突变发生在大约70%的囊性纤维化病例中，与严重的疾病 有关。
[0011]AF508-CFTR中508残基的缺失防止初生蛋白正确地折叠。这导致该突变蛋 白不能退出ER和运输至质膜。其结果是，膜中通道数量远远少于表达野生型CFTR的细 胞。除了运输减低以外，突变还导致有缺陷的通道门控。总之，膜中通道数量减少和有 缺陷的门控引起跨越上皮的阴离子转运减少，引起有缺陷的离子和体液转运（Quinton， P.M. (1990)，FASEBJ. 4:2709-2727) ?不过，研宄已经显示，膜中AF508-CFTR的数量减少 是功能性的，尽管少于野生型CFTR(Dalemansetal. (1991)，NatureLond. 354:526-528; Denningetal.，supra;PasykandFoskett(1995)，J.Cell.Biochem. 270:12347-50)。除 了AF508-CFTR以外，其他导致有缺陷的运输、合成和/或通道门控的致病性CFTR突变可 能被增量或减量调节，以改变阴离子分泌和修改疾病进展和/或严重性。
[0012] 尽管CFTR除了阴离子以外还转运多种分子，不过显然这种角色（阴离子的转运） 代表了跨越上皮转运离子和水的重要机理中的一种要素。其他要素包括上皮Na+通道、 ENaC、Na+/2Cl7K+共同转运蛋白、Na+-K+-ATP酶泵和基底外侧膜K+通道，它们负责摄取氯化 物进入细胞。
[0013] 这些要素一起工作，经由它们在细胞内的选择性表达和定位实现跨越上皮的定向 转运。借助存在于顶端膜上的ENaC与CFTR和在细胞基底外侧表面上表达的Na+-K+-ATP酶 泵与cr通道的协调活性，发生氯化物的吸收。氯化物从腔侧的次级主动转运引起细胞内 氯化物的蓄积，然后可以被动地经由cr通道离开细胞，导致向量转运。Na+/2C17K+共同转 运蛋白、Na+-K+-ATP酶泵和基底外侧膜K+通道在基底外侧表面上的排列和腔侧上的CFTR协 调氯化物经由腔侧上CFTR的分泌。因为水可能从不主动转运自己，它跨越上皮的流动依赖 于由钠和氯的大量流动所生成的微小跨上皮渗透梯度。
[0014] 除了囊性纤维化以外，CFTR活性的调控也可以有益于其他不直接由CFTR突变所 导致的疾病，例如分泌性疾病和其他由CFTR介导的蛋白质折叠疾病。这些疾病包括但不限 于慢性阻塞性肺疾病（copd)、干眼病和斯耶格伦氏综合征。coro是以气流受限为特征的， 它是进行性的，不是完全可逆的。气流受限是由于粘液分泌过多、肺气肿和细支气管炎。突 变或野生型CFTR的活化剂提供coro常见的粘液分泌过多和粘液纤毛廓清率减低的潜在治 疗。具体而言，增加跨越CFTR的阴离子分泌可以有利于体液转运进入气道表面液体，以水 化粘液，优化纤毛周围的体液粘度。这将引起粘液纤毛廓清率增强和与coro有关的症状减 少。干眼病是以泪水产生降低和异常泪膜脂质、蛋白质与粘蛋白行为为特征的。干眼有很 多原因，其中一些包括年龄、Lasik眼手术、关节炎、药物治疗、化学/热灼伤、变态反应和疾 病，例如囊性纤维化和斯耶格伦氏综合征。增加经由CFTR的阴离子分泌将增强体液从角膜 内皮细胞和眼周围分泌腺体的转运，以增加角膜的水化作用。这将有助于缓解与干眼病有 关的症状。斯耶格伦氏综合征是一种自身免疫疾病，其中免疫系统攻击体内各处产生水分 的腺体，包括眼、口、皮肤、呼吸组织、肝、阴道和肠。症状包括眼、口和阴道干燥以及肺疾病。 该疾病也与类风湿性关节炎、系统性狼疮、系统性硬化和多肌炎/皮肤肌炎有关。有缺陷的 蛋白质运输据信会导致该疾病，治疗选择是有限的。CFTR活性调控剂可以水化各种受疾病 影响的器官，帮助改善有关症状。
[0015] 正如上文所讨论的，据信AF508-CFTR中508残基的缺失防止初生蛋白正确地折 叠，导致这种突变蛋白不能退出ER和运输至质膜。其结果是，存在于质膜的成熟蛋白数量 不足，上皮组织内氯化物的转运显著减少。事实上，这种ABC转运蛋白被ER机构有缺陷的 ER加工的细胞现象已被显示不仅是CF疾病的基础，而且是广泛的其他孤立性与遗传性疾 病的基础。ER机构可能发生故障的两种方式要么是与蛋白质的ER输出的偶联丧失，引起降 解，要么是这些有缺陷/误折叠的蛋白质的ER蓄积[AridorM，etal.，NatureMed.，豆(7)， pp745-751(1999) ;Shastry，B.S.，etal. ,Neurochem.International, 43,pp1-7 (2003); Rutishauser,J. ,etal. ,SwissMedffkly, 132,pp211-222(2002) ；Morello,JPetal., TIPS,21,pp.466-469(2000)；BrossP. ,etal. ,HumanMut. , 14,pp.186-198(1999)]。与 前一类ER故障有关的疾病有囊性纤维化（由误折叠的AF508-CFTR引起，正如上文所讨论 的）、遗传性肺气肿（由a1-抗胰蛋白酶非Piz变体引起）、遗传性血色素沉着、凝血-纤 维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷（例如家族 性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、0-脂蛋白血、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/ 伪-Hurler)、粘多糖病（由溶酶体加工酶引起）、Sandhof/Tay-Sachs(由|3 -己糖胺酶引 起）、Crigler_NajjarII型（由UDP-葡糖醛基-sialyc-转移酶引起）、多内分泌病/高胰 岛素血、糖尿病（由胰岛素受体引起）、Laron侏儒（由生长激素受体引起）、髓过氧化物酶 缺陷、原发性甲状旁腺机能减退（由前促甲状旁腺激素引起）、黑素瘤（由酪氨酸酶引起）。 与后一类ER故障有关的疾病有聚糖病（Glycanosis)⑶G1型、遗传性肺气肿（由a1-抗 胰蛋白酶PiZ变体引起）、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全（由I、II、IV型前胶原引起）、 遗传性低纤维蛋白原血（由纤维蛋白原引起）、ACT缺陷（由a1-抗凝乳蛋白酶引起）、尿 崩症01)、后叶激素运载蛋白性DI(由后叶加压素/V2-受体引起）、肾原性DI(由水通道 蛋白II引起）、夏-马二氏神经性进行性肌肉萎缩综合征（由外周髓磷脂蛋白22引起）、 佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病（由0APP和早老蛋白引起）、帕金森氏 病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学障碍（例 如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状红核pallidoluysian 和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病（由朊病毒蛋白加工缺 陷引起）、法布里氏病（由溶酶体a-半乳糖苷酶A引起）