一种穿山甲甲片的DNA提取方法与流程

本发明涉及一种中药DNA的提取方法，具体涉及穿山甲甲片的DNA提取方法。

背景技术：

穿山甲为鲮鲤科动物Manis pentadactyla L.的鳞甲，临床主要用于经闭、癥瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、关节痛、麻木拘挛，为妇科常用贵重中药材。近年来，由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化，穿山甲数量急剧下降，资源短缺现象严重，穿山甲药材价格逐年攀升，市场上出现了大量的混伪品。常有不法分子以东南亚产马来穿山甲、非洲产大穿山甲及树穿山甲等的甲片混用，甚至用猪、牛、羊等的蹄甲经加工制造伪品，从中牟取暴利，严重影响了药材质量及用药安全。对穿山甲片及混伪品进行准确鉴别是十分必要的。

由于穿山甲片与混伪品外观很相似，传统的性状鉴定和显微鉴定难度较大，且需要丰富的经验。理化鉴定目前尚缺乏专属性指标成分。近年来，DNA分子标记技术广泛用于解决中药材鉴定中的难题，如DNA条形码技术等，可对物种进行快速、准确和自动化鉴定。发展穿山甲甲片的DNA分子标记鉴定技术，有望提供一种准确、客观的鉴别穿山甲片及混伪品的鉴别手段。而从甲片药材中获取足量的高质量DNA是对其进行分子标记鉴定的基础。

中药材DNA提取是开展中药材DNA分子标记鉴定研究的首要环节。由于商品药材多数经过加工处理，DNA可能会出现不同程度的降解；动物药材中的蛋白质，会影响DNA的提取和PCR的扩增；药材贮存时间的长短，药材的种类不同，如动物药材中的骨甲类与肌肉和分泌类，DNA的提取方法相应有所不同。

由于穿山甲甲片高度角质化，提取DNA难度大。邢亚林等人曾报道了一种从穿山甲甲片中提取DNA的方法，但是此提取方法DNA得率低，重复性不好；除此之外，尚无人成功从穿山甲甲片中成功提取出总DNA，特别是从炮山甲中提取DNA的方法尚属空白。

本发明提出了一种从穿山甲片和炮山甲片中提取基因组DNA的适宜方法，DNA得率高，成功率100％，可用于穿山甲药材的分子鉴定、系统发育研究等工作。

技术实现要素：

在我国，穿山甲主要分布于海南、福建、台湾、广东、广西、云南等地，被列为国家Ⅱ级保护野生动物，并被《中国濒危动物红皮书》列为易危级(vulnerable，VU)，列入国际濒临绝种动植物贸易公约附录Ⅱ。近年来，由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化，穿山甲数量急剧下降，资源短缺现象严重，穿山甲药材价格逐年攀升，药材市场上不断出现产于东南亚的马来穿山甲(Manis javanica)甲片、产于非洲的大穿山甲(M.gigantea)和树穿山甲(M.tricuspis)甲片等混淆品，以及猪(Sus scrofa domestica)蹄甲、黄牛(Bos taurus)蹄甲、耗牛(B.grunniens)蹄甲、山羊(Capra hircus)蹄甲、绵羊(Ovis aries)蹄甲等伪品，严重影响了药材质量及用药安全。由于穿山甲片与混伪品外观很相似，传统的性状鉴定和显微鉴定难度较大，且需要丰富的经验。理化鉴定目前尚缺乏专属性指标成分。用DNA分子标记技术对穿山甲片及其混伪品进行鉴别，可望为穿山甲片商品药材的鉴定提供新手段。

中药材DNA提取是开展中药材DNA分子标记鉴定研究的首要环节。由于商品药材多数经过加工处理，DNA可能会出现不同程度的降解；动物药材中的蛋白质，会影响DNA的提取和PCR的扩增；药材贮存时间的长短，药材的种类不同，如动物药材中的骨甲类与肌肉和分泌类，DNA的提取方法相应有所不同。

由于穿山甲甲片高度角质化，提取DNA难度大。邢亚林等人曾报道了一种从穿山甲甲片中提取DNA的方法，但是此提取方法DNA得率低，重复性不好；除此之外，尚无人成功从穿山甲甲片中成功提取出总DNA，特别是从炮山甲中提取DNA的方法尚属空白。

因此，有必要设计一种优良的DNA提取方法，能从穿山甲片中提取出足够量的高质量总DNA，用于穿山甲生甲片、炮甲片某些基因片段的扩增和测序及相关的分子鉴定工作。

为了解决上述问题，本发明提供了一种穿山甲甲片(含炮甲片)的DNA提取方法，其包括以下步骤：

1)用无水乙醇浸泡穿山甲甲片10-24h，每隔2-3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；然后以去离子水浸泡穿山甲甲片10-24h，每隔2-3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；在60℃下烘干，然后在紫外灯下正反面分别照射灭菌，然后粉碎成细末；

2)取步骤1)所得粉末置于离心管中，加入浸泡液(10mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L EDTA、50mmol/L NaCl、pH8.0)于4℃放置过夜，5000r/min离心10min后弃上清液；

3)向步骤2)所得沉淀中加入含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h-120h，充分震荡，10000r/min高速离心10min后弃上清液；

4)向步骤3)所得沉淀中加入含有10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、2％SDS、1mmol/L DTT、1mmol/L CaCl₂和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h-120h，期间每4h震荡混匀一次，10000r/min离心10min取上清；

5)以平衡酚以及氯仿：异戊醇(24∶1)混合液进行DNA抽提；

6)以无水乙醇进行沉淀；

7)以75％冰乙醇进行干燥；

8)干燥所得DNA，并以TE溶解DNA。

其中，穿山甲甲片为生穿山甲甲片或炮制穿山甲甲片。

其中，步骤1)中的粉碎为机械粉碎或以液氮研磨至细粉。

其中，步骤5)为：

抽提步骤1：加入等体积平衡酚约(700μl)，混匀30min,13000r/min离心10min，取上清液。

抽提步骤2：加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)混合液，混匀30min,13000r/min离心10min，取上清液；重复抽提步骤1和抽提步骤2，直至抽提完全。

其中，步骤6)为：在上清液中加入两倍体积的冰冻无水乙醇，于-20℃沉淀至少1h，13000r/min离心15min，弃上清液。

其中，步骤7)为加入500μl的75％冰乙醇，混匀漂洗以除去残余的盐，13000r/min离心2min，吸去上清液。

目前市场上已有DNA提取试剂盒，这种试剂盒比较适合新鲜的植物叶和动物肌肉类DNA的微量提取；由于中药材的特殊性，DNA有大量降解，有时要根据药材本身的特点，如植物药材的根茎，动物药材的骨甲，胆囊等，药材的提取量要有所不同；同时试剂盒的价格也很昂贵，因此实际中并不太适用。虽然穿山甲片中提取DNA的现有技术中已有报道(邢亚林等，2013)，但其重复性不好；而大多数的实验是从穿山甲肌肉组织或甲片内皮中提取出DNA(贾静等，2014)。由于穿山甲甲片材质很硬，角质化程度高，采用普通的DNA提取方法不能提取出DNA，且炮甲片中的DNA比生甲片更难提出，因此需要探索适宜的DNA提取方法，以从穿山甲甲片中高效提取DNA。

本发明提出一种穿山甲片(含炮甲片)的DNA提取方法，包括样品预处理、消化、提取等步骤。穿山甲甲片为表皮高度角质化形成的角质鳞，角化细胞内富含二硫键的角蛋白不易被破坏，容易导致消化不充分；发明人将生甲片的消化时间延长至72h，炮甲片的消化时间延长至120h。DNA提取方法中SDS是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解析，有利于DNA的释放。试剂中含有Tris—HCl、NaCl等成分，可以为裂解试剂和蛋白酶K提供稳定的缓冲反应环境。而在裂解过程中加入的蛋白酶K可以水解蛋白质，将之分离出去，可提高DNA的浓度和纯度。DTT(二硫苏糖醇)具有抗氧化作用，可以保护酶分子上的还原性基团，稳定酶的活性。对于胶原蛋白的处理，主要采用0.1％的高浓度胶原酶来水解胶原蛋白。

由于穿山甲为国家Ⅱ级保护野生动物，且数量急剧下降，很难获得，一般工作中遇到的穿山甲甲片均为存放多年或者是已经炮制，在这一过程中DNA可能会有一定程度的降解，导致提取的DNA量相对较少。本发明提出的DNA提取法，所需的甲片量很少，约0.4g；且获得的DNA量多，用多种引物都可扩增出亮带，检测效果非常好，十分经济高效。为穿山甲药材鉴定提供了可靠的技术支持，在保护遗传学上也具有很大的意义。

附图说明

图1为mtDNA cyt-b通用引物PCR扩增结果，其中，M:Marker D2000、A:亚洲片(马来穿山甲)B:非洲片(树穿山甲)C:非洲片(大穿山甲)D:炮甲片(会同)E:炮甲片(台州)F:炮甲片(远安)O:空白对照。

图2为UPGMA系统发育树(每个分支上的数字为自展支持率)。

具体实施方式

实施例所采用的实验材料与仪器

ABI 3700基因扩增仪(美国ABI公司)、紫外凝胶成像分析仪(北京赛百奥科技有限公司)等。

用于DNA提取的穿山甲生甲片分别为市场上购买的亚洲片(马来穿山甲)、树甲片(树穿山甲)、非洲片(大穿山甲)，炮甲片分别购买于会同、台州、远安。

实施例1 穿山甲生甲片的DNA提取

①用无水乙醇浸泡穿山甲甲片12h，每隔3h更换一次乙醇，期间在振荡器上轻微震荡清洗；浸泡完毕后，用去离子水做同样的操作。在60℃下烘干，在紫外灯下正反面分别照射灭菌30min，然后用已灭菌的剪刀剪至细末。

②取0.2g置于1.5ml离心管中，加入1ml浸泡液(10mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L EDTA、50mmol/L NaCl、pH8.0)于4℃放置过夜，5000r/min离心10min后弃上清液。

③加入1ml含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h，充分震荡，10000r/min高速离心10min后弃上清液。

④向沉淀中加入1ml含有10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、2％SDS、1mmol/L DTT、1mmol/L CaCl₂和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h，期间每4h轻轻震荡混匀一次，10000r/min离心10min取上清。

⑤此后抽提等步骤按常规DNA提取方法进行。

抽提步骤1：加入等体积平衡酚约(700μl)，混匀30min,13000r/min离心10min,取上清液。

抽提步骤2：加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)混合液，混匀30min,13000r/min离心10min,取上清液。如中间还有白色蛋白层，重复抽提步骤1、2，直至没有白色蛋白层。

沉淀：在上清液中加入两倍体积的冰冻无水乙醇，于-20℃沉淀至少1h，13000r/min离心15min，弃上清液。

漂洗：加入500μl的75％冰乙醇，混匀漂洗以除去残余的盐，13000r/min离心2min，吸去上清液。若杂质较多，可重复此步骤几次。

干燥：将管倒立在卷纸上，干燥DNA沉淀块，除去多余乙醇。

溶解：加入适量TE溶解DNA。

实施例2 穿山甲炮甲片的DNA提取

用无水乙醇浸泡穿山甲甲片12h，每隔3h更换一次乙醇，期间在振荡器上轻微震荡清洗；浸泡完毕后，用去离子水做同样的操作。在60℃下烘干，在紫外灯下正反面分别照射灭菌30min，然后在已灭菌的研钵中用液氮研磨至细末。消化时间延长至120h，其余步骤和生甲片DNA提取一样。

实施例3 PCR扩增

对提取的DNA用mtDNA cyt-b通用引物(L148415’-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’和H151495’-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’)进行PCR扩增，以鉴定DNA提取效果。

引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，PCR反应体积为25μL,体系内包含ddH2O 9.5μL,2.5μmol/L引物各1.0μL[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]，2xTaq PCR Mix 12.5μL，模板DNA 1.0μL。PCR扩增程序为：94℃，10min；94℃30s，45℃45s，72℃30s，35个循环；72℃，10min。

PCR扩增结果

提取的DNA用mtDNA cyt-b通用引物进行PCR扩增的电泳结果如图一所示，在提取结果中，将穿山甲生甲片与炮甲片的总DNA用mtDNA cyt-b通用引物进行PCR扩增，扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶下进行检测，在约300bp处均有明显条带；

实施例4 DNA测序及分子鉴定

为了进一步鉴定提取效果，对穿山甲生甲片与炮甲片提取出的总DNA进行PCR扩增后，将产物送于上海英潍捷基公司测序。结果证明确实为穿山甲属动物cytb序列，表明此DNA为穿山甲DNA。

用生物条形码数据库(Barcodes of Life Database,BOLD)系统对3个穿山甲样品的鉴定结果见表1。利用UPGMA法对穿山甲3个样品进行聚类分析(如图1)，共聚成3个分支，每个分支均为单系，各分支的自展支持率均为99％以上。表1穿山甲部分样品信息和鉴定结果