1.一种穿山甲甲片的DNA提取方法,其包括以下步骤:
1)用无水乙醇浸泡穿山甲甲片10‐24h,每隔2‐3h更换一次无水乙醇,浸泡期间进行震荡清洗;然后以去离子水浸泡穿山甲甲片10‐24h,每隔2‐3h更换一次无水乙醇,浸泡期间进行震荡清洗;在60℃下烘干,然后在紫外灯下正反面分别照射灭菌,然后粉碎成细末;
2)取步骤1)所得粉末置于离心管中,加入浸泡液(10mmol/L Tris‐HCl、0.2mol/L EDTA、50mmol/L NaCl、pH8.0)于4℃放置过夜,5000r/min离心10min后弃上清液;
3)向步骤2)所得沉淀中加入含有0.1%胶原酶和1%胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h‐120h,充分震荡,10000r/min高速离心10min后弃上清液;
4)向步骤3)所得沉淀中加入含有10mmol/L Tris‐HCl、50mmol/L NaCl、2%SDS、1mmol/L DTT、1mmol/L CaCl2和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液,55℃水浴72h‐120h,期间每4h震荡混匀一次,10000r/min离心10min取上清;
5)以平衡酚以及氯仿:异戊醇(24∶1)混合液进行DNA抽提;
6)以无水乙醇进行沉淀;
7)以75%冰乙醇进行干燥;
8)干燥所得DNA,并以TE溶解DNA。
2.根据权利要求1所述的DNA提取方法,其中,穿山甲甲片为生穿山甲甲片或炮制穿山甲甲片。
3.根据权利要求1‐2任一项所述的DNA提取方法,其中,步骤1)中的粉碎为机械粉碎或以液氮研磨至细粉。
4.根据权利要求1‐3任一项所述的DNA提取方法,其中,步骤5)为:
抽提步骤1:加入等体积平衡酚约(700μl),混匀30min,13000r/min离心10min,取上清液;
抽提步骤2:加入等体积氯仿:异戊醇(24∶1)混合液,混匀30min,13000r/min离心10min,取上清液;重复抽提步骤1和抽提步骤2,直至抽提完全。
5.根据权利要求1‐4任一项所述的DNA提取方法,其中,步骤6)为:在上清液中加入两倍体积的冰冻无水乙醇,于‐20℃沉淀至少1h,13000r/min离心15min,弃上清液。
6.根据权利要求1‐5任一项所述的DNA提取方法,其中,步骤7)为加入500μl的75%冰乙醇,混匀漂洗以除去残余的盐,13000r/min离心2min,吸去上清液。