一种人全血冻存样本RNA的提取方法与流程

本发明涉及一种RNA的提取方法，特别涉及一种人全血冻存样本RNA的提取方法。

背景技术：

当前，人全血是临床上最容易获得的样本之一，被广泛应用于医学研究、特别是临床诊断治疗研究。只有从人全血提取高质量的总RNA，才能进行RT-PCR、基因测序等进一步检测。但是从人全血提取高质量的总RNA存在很大的技术难点。人体外周血中无核细胞和有核细胞的比例约500:1，大量红细胞的存在会影响有核细胞中的RNA的提取。受实验时间空间的限制，拿到人全血样本后,有时不方便马上提取RNA,需要冻存全血样本，再选择合适的时间提取RNA。冻存血细胞在处理保存过程中，特别是溶化过程中，总RNA难免降解。

已经上市的QIAGEN生产的QIAamp RNA Blood Mini Kit用于从人全血提取总RNA,但是只能用于新鲜全血的RNA提取，价格也比较贵。Takara宝生物生产的RNAiso plus是一款广谱型总RNA提取试剂，说明书中提到它可以用于动物组织、植物材料、各种微生物和培养细胞，但是没提到它可以用于人全血。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中从人全血提取高质量的RNA比较困难的问题而提供的一种人全血冻存样本RNA的提取方法。

本发明提供的人全血冻存样本RNA的提取方法，其方法如下所述：

步骤一、人血的处理：

(1)、用紫帽采血管取血液标本，采6ml，每次RNA提取0.1ml血细胞；

(2)、使用通用台式离心机离心，在3000rpm离心条件下离心10分钟，离心后上层为淡黄色血浆，下层为全血细胞；

(3)、标记1.5ml无RNA酶管，P代表血浆，B代表全血细胞，此外管上标记样本号、日期，以无菌无RNA酶枪头小心地将血浆、全血细胞分别装入EP管；

(4)、取全血细胞0.1ml，加入Trizol 1ml，用于裂解细胞，保护RNA，使用振荡器充分振荡，振荡20秒，用枪吹吸5次，至均质状；

(5)、血液标本处理完成后，继续下面的步骤，或者将样本放入-80℃冰箱保存；

步骤二、从血液细胞提取RNA：

(1)、全血细胞和Trizol的混合物，冻存样本先解冻，室温静止孵育5分钟；

(2)、每管加入0.2ml的氯仿，1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用手振荡15秒，之后室温静置3分钟；

(3)、用冷冻微量离心机，在12000g离心条件下离心15分钟；

(4)、在1.5ml无RNA酶的EP新管上标号，将(3)中离心后倾斜45度上层透明部分全部转入新管，加入异丙醇0.5ml，1ml Trizol对应用量0.5ml异丙醇，振荡，室温静置10分钟；

(5)、用冷冻微量离心机，在4℃、12000g离心条件下离心10分钟；

(6)、RNA沉于管低，完全除去上清，加入75％乙醇1ml，0.75ml无水乙醇加0.25ml DEPC处理水，温和地上下翻转；

(7)、用冷冻微量离心机，在4℃、7500g离心条件下离心5分钟；

(8)、倒上清液，在RNA沉淀对侧倒液，别倒掉RNA pellet，用枪头取出尽可能多的乙醇；

(9)、干燥，空气中3分钟晾干；

(10)、根据RNA沉淀大小加入去核糖核酸酶水20-40ul，用枪吹打数次，55度温度条件孵育10分钟，溶解RNA，最后小管分装；

(11)、使用酶标仪，测定RNA浓度，上样量为2微升，RNA浓度：(A260-A320)×稀释倍数×40μg/ml，A260/A280：1.8-2.1可以满足要求，>2.1可能说明RNA降解，<1.6可能说明有蛋白杂质；

(12)、RNA样品的保存：可以-80℃保存或继续下一步；

(13)、使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000Nano分析试剂盒测定RNA质量，按说明书操作，上样量1微升，检测核糖体18S和28S的强度，RIN值越接近于10说明RNA完整性越好。

本发明的有益效果：

降低样本量，只需要全血细胞0.1ml,相当于全血约0.2ml；提高RNA质量，RIN值达到7.7以上；Trizol法简化操作，为医学研究、临床诊断治疗研究提供方法。

附图说明

图1为现有方法中所获得的RNA质量结果图。

图2为本发明提供方法所获得的RNA质量结果图。

具体实施方式

本发明提供的人全血冻存样本RNA的提取方法，其方法如下所述：

步骤一、人血的处理：

(1)、用紫帽采血管取血液标本，采6ml，每次RNA提取0.1ml血细胞；

(2)、使用通用台式离心机离心，在3000rpm离心条件下离心10分钟。离心后上层为淡黄色血浆，下层为全血细胞；

(3)、标记1.5ml无RNA酶管，P代表血浆，B代表全血细胞，此外管上标记样本号、日期，以无菌无RNA酶枪头小心地将血浆、全血细胞分别装入EP管；

(4)、取全血细胞0.1ml，加入Trizol 1ml，用于裂解细胞，保护RNA，使用振荡器充分振荡，振荡20秒，用枪吹吸5次，至均质状；

(5)、血液标本处理完成后，继续下面的步骤，或者将样本放入-80℃冰箱保存；

步骤二、从血液细胞提取RNA：

(1)、全血细胞和Trizol的混合物，冻存样本先解冻，室温静止孵育5分钟；

(2)、每管加入0.2ml的氯仿，1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用手振荡15秒，之后室温静置3分钟；

(3)、用冷冻微量离心机，在12000g离心条件下离心15分钟。

(4)、在1.5ml无RNA酶的EP新管上标号，将(3)中离心后倾斜45度上层透明部分全部转入新管，加入异丙醇0.5ml，1ml Trizol对应用量0.5ml异丙醇，振荡，室温静置10分钟；

(5)、用冷冻微量离心机，在4℃、12000g离心条件下离心10分钟；

(6)、RNA沉于管低，完全除去上清，加入75％乙醇1ml，0.75ml无水乙醇加0.25ml DEPC处理水，温和地上下翻转；

(7)、用冷冻微量离心机，在4℃、7500g离心条件下离心5分钟；

(8)、倒上清液，在RNA沉淀对侧倒液，别倒掉RNA pellet，用枪头取出尽可能多的乙醇；

(9)、干燥，空气中3分钟晾干；

(10)、根据RNA沉淀大小加入去核糖核酸酶水20-40ul，用枪吹打数次，55度温度条件孵育10分钟，溶解RNA，最后小管分装；

(11)、使用全功能酶标仪，测定RNA浓度，上样量为2微升，RNA浓度：(A260-A320)×稀释倍数×40μg/ml，A260/A280：1.8-2.1可以满足要求，>2.1可能说明RNA降解，<1.6可能说明有蛋白杂质；

(12)、RNA样品的保存：可以-80℃保存或继续下一步；

(13)、使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000Nano分析试剂盒测定RNA质量，按说明书操作，上样量1微升，检测核糖体18S和28S的强度，RIN值越接近于10说明RNA完整性越好。

上述方法中所用的试剂及设备如下所述：

(一)试剂耗材：

苯酚：英杰生命科技有限公司；

异丙醇：英杰生命科技有限公司(货号:I9030)；

氯仿：广州瑞舒；

Trizol:为总RNA提取试剂TRIzol，为英杰生命科技有限公司生产，货号:15596-018；

去核糖核酸酶水：上海生工(货号:7732-18-5)；

乙醇：阿拉丁生化科技股份有限公司(货号:E1230038)；

RNA 6000Nano分析试剂盒：为微量总RNA分析试剂盒：安捷伦科技有限公司(货号:5067-1511)；

采血管：紫帽管(含2％EDTA抗凝剂)；

1.5ml无RNA酶EP管；

无菌无RNA酶枪头；

(二)设备:

Agilent 2100生物分析仪：为安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉市)，利用微流控技术平台检测核糖体18S和28S的强度，使用RNA分子完整值(RIN)来确定RNA的完整性(RIN值已经成为RNA研究领域内质量评估的黄金标准)。

全功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司，美国佛蒙特州威努斯基市，测量RNA浓度，通过样本在260nm和280nm波长的吸收度确定RNA纯度。

通用台式离心机：型号：heraeus multifuge x1r赛默飞世尔科技有限公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市。

冷冻微量离心机：型号：Thermo Scientific Heraeus Fresco 21赛默飞世尔科技有限公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市。

振荡器：型号：QL901海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

本发明所述方法与现有技术方法的结果比较：

(一)现有技术：冻存全血细胞，细胞的量/Trizol的量＝1:3的结果(图1所示)，图1中用现有技术从冻存全血细胞提取的RNA样本，用Agilent 2100生物分析仪检测的结果。样本1.RIN:2.60；样本3.RIN:3.00；样本6.RIN:6.60；样本11.RIN:2.30；其他样本的RIN值都测不到。图片上方黑色长方形表示RIN值测不到。

(二)本发明提供方法：冻存或新鲜全血，细胞的量/Trizol的量＝1:10的结果(图2所示)，图2中用本发明提供方法技术从全血细胞提取的RNA样本，用Agilent 2100生物分析仪检测的结果。样本1.RIN:9.20；样本2.RIN:9.30；样本3.RIN:2.00；样本4.RIN:1.10；样本5.RIN:8.80；样本6.RIN:7.70；样本7.RIN:3.20；样本8.RIN:6.10；样本9.RIN:8.00；样本10.RIN:8.50；样本11.RIN:测不到。图片上方黑色长方形表示RIN值测不到。样本1和2是新鲜全血按照试剂盒说明书用柱提(QIAamp RNA Blood Mini kit)的结果；样本3、4和11是冻存全血按照试剂盒说明书用柱提(QIAamp RNA Blood Mini kit)的结果；样本5和6是新鲜全血用发明技术提的结果；样本7和8是冻存全血用发明技术提的结果；样本9和10是加Trizol后冻存全血用发明技术提的结果。