本发明系关于生化反应材料与装置以及体外处理血液或血浆的方法。
背景技术：
：：低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein,LDL)为一种脂蛋白粒子，为经由脂蛋白水解酶作用后的产物。低密度脂蛋白在正常生理上扮演在血液内运载脂肪酸分子至全身供细胞使用的角色。已知低密度脂蛋白携带的胆固醇水平与心血管疾病的发生存在紧密的正相关。目前医学界仍以血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDLcholesterol,LDL-C)做为评估心血管疾病指标，然而急性心肌梗塞的病人，其血浆中的低密度脂蛋白并没有增加的趋势。因过多氧化压力等外界因素，低密度脂蛋白会被转译后修饰，而呈现较高的负电性，成为负电性低密度脂蛋白(electronegativeLDLorL5)。LDL-5(L5)负电性低密度脂蛋白是造成心血管疾病的主要因素，正常人体内几乎测不到L5，又，L5在体外细胞实验及动物实验皆被证实会伤害血管内皮细胞与活化血小板，造成动脉粥状硬化与心肌梗塞。因此，目前亟需一种新颖的用以移除负电性低密度脂蛋白的材料、装置及/或方法。技术实现要素：本发明提供一种生化反应材料，包括：基材；以及酶组成物固定于该基材上，其中，该酶组成物选自：用以清除负电性低密度脂蛋白(electronegativelow-densitylipoprotein,electronegativeLDL)的醣基的第一酶；用以清除负电性低密度脂蛋白的所携带的神经酰胺(ceramide)的第二酶；以及上述的组合，其中该生化反应材料具有去除负电性低密度脂蛋白的能力。本发明也提供一种生化反应装置，包括：如前方所述的生化反应材料；以及容器，用以容纳该生化反应材料，其中该容器具有至少一入口与至少一出口；其中，液体样本自该至少一开口进入该生化反应装置，且流经该生物反应材料以与该生化反应材料反应，并之后自该至少一出口流出。本发明还提供一种体外处理血液或血浆的方法，包括：(a)于体外使血液或血浆与酶组成物接触，以使该酶组成物对该血液或血浆进行反应，其中，该酶组成物具有清除负电性低密度脂蛋白的能力，且该酶组成物选自：用以清除负电性低密度脂蛋白的醣基的第一酶；用以清除负电性低密度脂蛋白的所携带的神经酰胺的第二酶；以及上述的组合；以及(b)终止该血液或血浆与该酶组成物接触，以终止该酶组成物对该血液或血浆进行反应。为了让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：附图说明图1A为本发明生化反应装置的一实施例的剖面示意图。图1B为本发明生化反应装置的另一实施例的剖面示意图。图1C为本发明生化反应装置的又另一实施例的剖面示意图。图2，显示NEU2的转形结果。图3显示，ASAH2的转形结果。图4显示，藉由西方墨点法确认NEU4/ASAH2的基因转染结果。图5显示NEU2的纯化结果。图6显示ASAH2的纯化结果。图7显示将L5(25μg/mL；50μg/mL)、与经过固定化NEU2填充装置处理的L5(1.25μg)分别与血管内皮细胞共培养，并进行细胞凋亡测定。图8显示将不经处理、以37℃处理或经过固定化NEU2填充装置处理2小时的由心脏病患所获得的LDL样本分别进行负电性低密度脂蛋白定量分析。图9A、图9B与图9C显示将L5进行质谱分析，可侦测apoE脂蛋白具有L5特有的醣化修饰作用。图10A1-2与图10B1-2显示，将经过NEU2处理的L5进行质谱分析，结果显示apoE特有的醣化修饰作用已经被移除。图11A、图11B显示经由固定化在不同材质上的NEU2、NEU4皆能有效清除脂蛋白上的醣化修饰作用:LDL最常见被醣基修饰的序列在于1.apoB100的(R)IGQDGISTSATTNLK(C)2.apoB100的(K)VLVDHFGYTK(D)3.apoB100的(K)GVISIPR(L)4.apoB100的(K)SGSSTASWIQNVDTKYQIR(I)5.apoB100的(K)AKPALEDLRQGLLPVLESFK(V)，ITRI-A-01(NEU2),ITRI-CD-01(NEU2),ITRI-Si-Nu-01(NEU4)皆能有效清除apoB上的醣基。图12显示，L5与经ASAH2处理24小时的L5的神经酰胺(ceramide)含量。图13显示，L5与经ASAH2处理24小时的L5的神经酰胺含量。图14显示，L5以及经ASAH2于缓冲溶液(200mMTris-HClpH8.4,1.5MNaCl,25mMCaCl2)存在或不存在下处理2或24小时的L5的神经酰胺含量。图15显示，L5以及经ASAH2于缓冲溶液(200mMTris-HClpH8.4,1.5MNaCl,25mMCaCl2)存在或不存在下处理24小时的L5的神经酰胺含量。图16A显示，L5与经ASAH2处理24小时的L5，利用质谱仪定量分析所含有的脂质成分，并比较神经酰胺(ceramide)含量的差异，图式为利用质谱仪定量的结果。图16B显示，L5以及经ASAH2于缓冲溶液(200mMTris-HClpH8.4,1.5MNaCl,25mMCaCl2)存在下处理2小时的L5的神经酰胺含量。图17A、图17B显示经由固定化后的ASAH2能有效清除神经酰胺酸，并且增加产物鞘氨醇(Sphingosine):L5最常见的神经酰胺酸之一为Cer(d18:0/25:0)，经由ASAH2作用之后产物为鞘氨醇。实验结果显示经由固定化后的ASAH2(ITRI-EC-AS-01)可以减少LDL检体所含的Cer(d18:0/25:0)，并且增加产物鞘氨醇。符号说明100～生化反应装置101～生化反应材料103～容器105～至少一入口1051～第一入口1052～第二入口107～至少一出口1071～第一出口1072～第二出口109～滤材实施方式在本发明一实施例中，本发明提供一种生化反应材料，其具有去除负电性低密度脂蛋白(electronegativelow-densitylipoprotein,electronegativeLDL)的能力。于所述负电性低密度脂蛋白的例子，可包括，但不限于L1、L2、L3、L4及/或L5等。在一实施例中，所述负电性低密度脂蛋白为负电性低密度脂蛋白L5。本发明的生化反应材料，可包括，但不限于，基材与酶组成物，其中酶组成物固定于基材上。适合的基材的例子，可包括硅胶(silicagel)、纤维素(cellulose)、二乙氨基乙基纤维素(diethylaminoethylcellulose,DEAEcellulose)、壳聚糖(chitosan)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚砜(polysulfone)、聚醚砜(polyethersulfone)、树脂与多糖等，但不限于此。基材可具有颗粒结构或中空管状结构等。在一实施例中，基材可为纤维素珠子(bead)。在另一实施例中，基材为壳聚糖珠子。又，在另一实施例中，基材可为纤维素中空纤维(cellulosehollowfiber)。而上述酶组成物可包括，用以清除负电性低密度脂蛋白的糖基的第一酶、用以清除负电性低密度脂蛋白的所携带的神经酰胺(ceramide)的第二酶，或上述的组合，但不限于此。上述第一酶与第二酶的物种来源并无特别限制。在一实施例中，第一酶与第二酶的物种来源为人类。上述第一酶可为唾液酸酶(sialidase)或糖苷酶(glycosidase)。唾液酸酶可包括来自人体的神经氨酸酶1(neuraminidase1,NEU1)、神经氨酸酶2(neuraminidase2,NEU2)、神经氨酸酶3(neuraminidase3,NEU3)、神经氨酸酶4(neuraminidase4,NEU4)、O-唾液酸酶(O-sialidase)等，或是以基因转殖、表现并纯化而来的上述酶之一，又或者是来自病毒、细菌或其他物种的唾液酸酶(别名，乙酰神经氨酸基水解酶(acetylneuraminylhydrolase))等，但不限于此。而糖苷酶的例子，则可包括来自于人体或动物体的α与β葡萄糖苷酶(alpha-andbeta-glucosidase)、麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(maltase-glucoamylase)、蔗糖酶-异麦芽糖酶(sucrase-isomaltase)等，或是以基因转殖、表现并纯化而来的上述酶之一，或者是来自于病毒、细菌或其他物种的N-糖苷酶F(N-glycosidaseF,PNGaseF)、葡萄糖苷酶(glucosidase)等，但不限于此。又，上述第二酶可为神经酰胺酶(ceramidase)。神经酰胺酶则可包括N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(N-acylsphingosineamidohydrolase)，例如N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(N-acylsphingosineamidohydrolase1,ASAH1)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2(N-acylsphingosineamidohydrolase2,ASAH2)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2B(N-acylsphingosineamidohydrolase2B,ASAH2B)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2C(N-acylsphingosineamidohydrolase2C,ASAH2C)等、N-酰基乙醇胺酸酰化酶(N-acylethanolamineacidamidase)、碱性神经酰胺酶1(alkalineceramidase1)、碱性神经酰胺酶2(alkalineceramidase2)、碱性神经酰胺酶3(alkalineceramidase3)，但不限于此。在一实施例中，于本发明生化反应材料中的酶组成物为上述第一酶。于此实施例中，所述第一酶可为神经氨酸酶2，但不限于此。在另一实施例中，于本发明生化反应材料中的酶组成物为上述第二酶。于此实施例中，所述第二酶可为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2，但不限于此。在又另一实施例中，于本发明生化反应材料中的酶组成物为上述第一酶与第二酶的组合。于此实施例中，所述第一酶可为神经氨酸酶2，但不限于此，且所述第二酶可为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2，但也不限于此。在本发明另一实施例中，本发明提供一种生化反应装置，而此装置可用于清除液体样本中的负电性低密度脂蛋白。上述液体样本的例子，可包括水溶液、缓冲溶液、血液、血浆等，但不限于此。又前方所述负电性低密度脂蛋白的例子，可包括，但不限于，L1、L2、L3、L4及/或L5等。在一实施例中，所述负电性低密度脂蛋白为负电性低密度脂蛋白L5。本发明的生化反应装置的结构剖面图如图1所示。参见图1A。上述本发明的生化反应装置100，可包括，生化反应材料101、容器103，用以容纳该生化反应材料101。容器103具有至少一入口105与至少一出口107。前述液体样本自至少一开口105进入生化反应装置100，且流经生物反应材料101以与生化反应材料101反应，并之后自至少一出口107流出。上述生化反应材料101，可包括，但不限于，基材与酶组成物，其中酶组成物固定于基材上。前述基材，可包括，但不限于，硅胶、纤维素、二乙氨基乙基纤维素、壳聚糖、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、树脂与多糖等。基材可具有颗粒结构或中空管状结构等，但不限于此。酶组成物则可包括，但不限于，用以清除负电性低密度脂蛋白的醣基的第一酶、用以清除负电性低密度脂蛋白的所携带的神经酰胺的第二酶，或上述的组合。上述第一酶与第二酶的物种来源并无特别限制。在一实施例中，第一酶与第二酶的物种来源为人类。上述第一酶可为唾液酸酶或糖苷酶。唾液酸酶可包括，但不限于，来自人体的神经氨酸酶1、神经氨酸酶2、神经氨酸酶3、神经氨酸酶4、O-唾液酸酶等，或是以基因转殖、表现并纯化而来的上述酶之一，又或者是来自病毒、细菌或其他物种的唾液酸酶等。而糖苷酶，则可包括，但不限于，来自于人体或动物体的α与β葡萄糖苷酶、麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶等，或是以基因转殖、表现并纯化而来的上述酶之一，或者是来自于病毒、细菌或其他物种的N-糖苷酶F、葡萄糖苷酶等。又，上述第二酶可为神经酰胺酶。神经酰胺酶可包括，但不限于，N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶，例如N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2B、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2C等、N-酰基乙醇胺酸酰化酶、碱性神经酰胺酶1、碱性神经酰胺酶2、碱性神经酰胺酶3，但不限于此。在一实施例中，前述生化反应材料101中的酶组成物为上述第一酶。于此实施例中，所述第一酶可为神经氨酸酶2，但不限于此。在另一实施例中，前述生化反应材料101中的酶组成物为上述第二酶。于此实施例中，所述第二酶可为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2，但不限于此。在又另一实施例中，前述生化反应材料101中的酶组成物为上述第一酶与第二酶的组合。于此实施例中，所述第一酶可为神经氨酸酶2，但不限于此，且所述第二酶可为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2，但也不限于此。此外，本发明生化反应装置100中的容器103的材料，可包括玻璃、压克力、聚丙烯、聚乙烯、不锈钢或钛合金等，但不限于此。在一实施例中，本发明生化反应装置100中的容器103的材料为聚丙烯。又，容器的形状并无特别限定，而在一实施例中，容器为中空柱状体。在一实施例中，如图1B所示，本发明的生化反应装置100，还可更包括滤材109，其设置于上述至少一入口105后方与上述至少一出口107后方。又，上述滤材的孔径小于上述生化反应材料101，以避免生物反应材料101自上述至少一入口105及/或至少一出口107漏出，然其可使液体样本通过。上述滤材的材料包括滤纸、玻璃、压克力、聚丙烯、聚乙烯等，但不限于此。于此实施例中，生物反应材料101的基材可具有颗粒结构或中空管状结构。在一特定实施例中，生物反应材料101的基材具有颗粒结构，又于此特定实施例中，生物反应材料101的基材可为纤维素珠子或壳聚糖珠子，但不限于此。当生物反应材料101的基材为中空管状结构时，亦可使用聚氨基甲酸酯(polyurethane,PUR)胶封装，而不使用滤材。在一实施例中，容器103可为中空柱状体，且其中空柱状体的两端分别具有上述至少一入口105的第一入口1051与上述至少一出口107的第一出口1071。于此实施例中，生物反应材料101的基材可具有颗粒结构或中空管状结构。在另一实施例中，如图1C所示，容器103可为中空柱状体，且其中空柱状体的两端分别具有上述至少一入口的第一入口1051与上述至少一出口的第一出口1071，又上述至少一入口的第二入口1052与上述至少一出口的第二出口1072位于空柱状体的侧壁上。于此实施例中，第一液体样本可自容器103的第一入口1051流入生化反应装置100，流经生物反应材料101，并从第一出口1071流出。另有一第二液体，可为水、透析液、含盐类水溶液由第二入口1052流入生化反应装置100，流经生物反应材料101，并从第二出口1072流出。第二液体可以带出反应或透析后的副产物。于此实施例中，生物反应材料101的基材可具有颗粒结构或中空管状结构。在一特定实施例中，生物反应材料101的基材具有中空管状结构，又于此特定实施例中，生物反应材料101的基材可为纤维素中空纤维，但不限于此。在本发明又另一实施例中，本发明提供一种体外处理血液或血浆的方法。藉由本发明体外处理血液或血浆的方法，可清除血液中的负电性低密度脂蛋白。前述负电性低密度脂蛋白，可包括，但不限于，L1、L2、L3、L4及/或L5等。在一实施例中，所述负电性低密度脂蛋白为负电性低密度脂蛋白L5。本发明的体外处理血液或血浆的方法可包括下述步骤，但不限于此。首先，于体外使血液或血浆与酶组成物接触，以使酶组成物对血液或血浆进行反应，其中，所述酶组成物具有清除负电性低密度脂蛋白的能力。上述酶组成物可包括，用以清除负电性低密度脂蛋白的糖基的第一酶、用以清除负电性低密度脂蛋白的所携带的神经酰胺的第二酶，或上述的组合，但不限于此。上述第一酶与第二酶的物种来源并无特别限制。在一实施例中，第一酶与第二酶的物种来源为人类。上述第一酶可为唾液酸酶或糖苷酶。唾液酸酶可包括来自人体的神经氨酸酶1、神经氨酸酶2、神经氨酸酶3、神经氨酸酶4、O-唾液酸酶等，或是以基因转殖、表现并纯化而来的上述酶的一，又或者是来自病毒、细菌或其他物种的唾液酸酶等，但不限于此。而糖苷酶的例子，则可包括来自于人体或动物体的α与β葡萄糖苷酶、麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶等，或是以基因转殖、表现并纯化而来的上述酶之一，或者是来自于病毒、细菌或其他物种的N-糖苷酶F、葡萄糖苷酶等，但不限于此。又，上述第二酶可为神经酰胺酶。神经酰胺酶则可包括N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(N-acylsphingosineamidohydrolase)，例如N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(N-acylsphingosineamidohydrolase1,ASAH1)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2(N-acylsphingosineamidohydrolase2,ASAH2)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2B(N-acylsphingosineamidohydrolase2B,ASAH2B)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2C(N-acylsphingosineamidohydrolase2C,ASAH2C)等、N-酰基乙醇胺酸酰化酶(N-acylethanolamineacidamidase)、碱性神经酰胺酶1(alkalineceramidase1)、碱性神经酰胺酶2(alkalineceramidase2)、碱性神经酰胺酶3(alkalineceramidase3)，但不限于此。在一实施例中，于本发明体外处理血液或血浆的方法中所使用的酶组成物为上述第一酶。于此实施例中，所述第一酶可为神经氨酸酶2，但不限于此。在另一实施例中，于本发明体外处理血液或血浆的方法中所使用的酶组成物为上述第二酶。于此实施例中，所述第二酶可为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2，但不限于此。此外，在一实施例中，于本发明体外处理血液或血浆的方法中所使用的酶组成物可固定于基材上。上述基材的例子，可包括硅胶、纤维素、二乙氨基乙基纤维素、壳聚糖、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、树脂与多糖，但不限于此。又，上述基材可具有球状结构或中空管状结构。在又另一实施例中，于本发明体外处理血液或血浆的方法中所使用的酶组成物为上述第一酶与第二酶的组合。于此实施例中，所述第一酶可为神经氨酸酶2，但不限于此，且所述第二酶可为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2，但也不限于此。于本发明体外处理血液或血浆的方法中，于体外使血液或血浆与酶组成物接触的时间可为约0.25-8小时。在一实施例中，可为约2小时。又，于本发明体外处理血液或血浆的方法中，于体外使血液或血浆与酶组成物接触的温度可为约4-40℃。在一实施例中，于体外使血液或血浆与酶组成物接触的温度可为约37℃。另外，于本发明体外处理血液或血浆的方法中，于体外，可使血液或血浆与酶组成物在约pH5-10下进行接触。在一实施例中，于体外，可使血液或血浆与酶组成物在约pH7.4下进行接触。然后，终止血液或血浆与酶组成物接触，以终止酶组成物对血液或血浆进行反应。终止血液或血浆与酶组成物接触的方式并无特别限定，例如将血液或血浆与酶组成物分离，或使酶组成物失去活性等。实施例实施例1A.方法1.低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein,electronegativeLDL)的取得(1)低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein,electronegativeLDL)的纯化用于低密度脂蛋白分离的血液样本为个体获得。在初步筛选后，在避免凝结与离体(exvivo)氧化的预防措施下将血液从个体移出。CompleteProteaseInhibitorCocktail(Roche；Cat.No.05056489001；1tablet/100mL)来处理血浆以避免蛋白质降解。从人类的脂蛋白制备(Lipoproteinpreparationfromhuman)。以2mLMilli-Q水覆盖血浆且于20,000rpm离心2小时。移除上层白色级分，乳糜微粒(chylomicrons)，而保留含有极低密度脂蛋白(very-low-densitylipoprotein,VLDL)、中低密度脂蛋白(intermediate-densitylipoproteins,IDL)、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein,HDL)的剩下的下层，以用于一系列的分离步骤。为了进一步将极低密度脂蛋白(d＝0.93-1.006)、中低密度脂蛋白(d＝1.006-1.019)、低密度脂蛋白(1.019-1.063g/dL)与高密度脂蛋白(1.063-1.210g/dL)彼此分离，藉由添加溴化钾，分别将剩余样本相继地调整至d＝1.006、d＝1.019、d＝1.063,d＝1.210，且接着于4℃以45,000rpm离心20小时。在各分离步骤的离心之后，中低密度脂蛋白会被丢弃，而极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白则会被收集。将经分离的极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白样本以5mMEDTA与氮气进行处理以避免离体(exvivo)氧化。将极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白样本以缓冲溶液A(0.02MTris-HCl，pH8.0与0.5mMEDTA)进行透析24小时，连续重复以上透析步骤共计3次，以移除过量的溴化钾，且以0.22-μm孔径的滤膜(Sartorius；)进行过滤以使样本无菌。(2)LDL亚级分(subfractions):藉由使用快速蛋白质液体色层分析(fast-proteinliquidchromatography,FPLC)泵(GEHealthcareLifeSciences,Pittsburgh,PA)，将约30mg的低密度脂蛋白材料注入至UnoQ12anion-exchangecolumn(BioRad)。藉由使用多步梯度(multistepgradient)的缓冲溶液B(1mol/LNaCl在缓冲溶液A中)，在2mL/分钟的流速下，LDL会依据电负度(electronegativity)而被洗提出。简而言之，会将样本会以缓冲溶液A平衡10分钟，接着，于10分钟内线性增加至15％缓冲溶液B(级分(fraction)1)、于30分钟内线性增加至20％缓冲溶液B(级分2、3)、维持于20％缓冲溶液B达，10分钟(级分4)与于20分钟内线性增加至100％缓冲溶液B(级分5)。最后，于280nm下监测洗提物(effluents)。(3)分级的低密度脂蛋白的纯化:根据梯度曲线(gradientprofile)，将各低密度脂蛋白级分汇集。各亚级分(subfraction)的体积为固定的。在色层分析期间，低密度脂蛋白的稀释依据注入体积。会将个别的级分以filters(YM-30；EMDMilliporeCorp.,Billerica,MA)浓缩、以缓冲溶液A(0.02MTris-HCl，pH8.0与0.5mMEDTA)进行透析24小时，连续重复以上透析步骤共计3次，并通过0.22-μm滤膜(Sartorius；)以使其无菌。藉由Lowry方法将经分离的级分定量出其蛋白质浓度且之后储存于4℃。2.NEU2或NEU4的筛选(1)转形(Transformation)(具有NEU2与NEU4基因的pCMV6载体的基因选殖)：NEU2(neuraminidase2)、与NEU4(neuraminidase4)为购自Origene，RC219858与RC203948。藉由ECOSTM101DH5α胜任细胞(Yeastern,FYE608)，根据制造商指示来放大基因。简而言之，将1小玻璃瓶(vial)的胜任细胞与5μL质体震荡一秒，且之后培养于冰上5分钟。在42℃的45秒热休克(heat-shoc)后，将混合物涂盘于具有卡那霉素(kanamycin)的LB琼脂上。以聚合酶链锁反应藉由VP1.5与XL39引子来确认菌落(colonies)，聚合酶链锁反应95℃，1分钟，用于前聚合酶链锁反应变性(pre-PCRdenaturation)；2次循环的95℃，10秒，62℃，20秒，72℃，4分钟；2次循环的95℃，10分钟，60℃，20秒，72℃，4分钟；2次循环的95℃，10秒，58℃，20秒，72℃，4分钟；15次循环的95℃，10秒，56℃，20秒，72℃，4分钟；于72℃，10分钟用以后-聚合酶链锁反应培养并维持于4℃。(2)质体萃取在确认经转形的菌落的插入后，将经转形细胞置于具有25mg/mL卡那霉素的5mLLB培养液中，之后隔夜培养37℃。根据PlasmidMiniprepPlusPurificationKit(GeneMark,DP01P)的步骤来萃取质体DNA。简而言之，将细菌于14,000xg下离心1分钟，移除培养基。将沉淀物重新悬浮于200μLSolutionI，之后添加200μLSolutionII，并藉由倒置试管来混合。添加200μLSolutionIII且藉由倒置试管5物来混合。将细胞溶解物(lysate)以最高速离心5分钟，且一紧密的白色沉淀会沿着管壁形成。将离心管柱(spincolumn)插入一收集管柱，并将清澈的细胞溶解物移至离心管柱，并以最高速离心1分钟。将流出液丢弃，将500μLEndotoxinRemovalWashSolution载入离心管柱中并等待2分钟以平衡膜，然后以最高速离心1分钟。将滤出液丢弃且加入700μLWashingSolution、于最高速离心1分钟，并重复此步骤。丢弃滤出液且于5分钟以移除残留的微量乙醇。将离心管柱移至一新的试管中并添加35μL水，等待1-2分钟，且于于最高速离心2分钟以洗提出DNA。藉由微孔盘光谱仪(microplatespectrophotometer)(Epoch,BioTek)将DNA定量。(3)对于HEK细胞的转染(transfection)与蛋白质纯化在转染前一天，将1.25*105HEK293T细胞置于500μLDMEM培养基中于24-孔盘中。对于要被转染的各孔洞中细胞而言，1μg的DNA稀释于100μL无血清培养基中，并添加1.5μL的Lipofectamine2000TransfectionReagent(Invitrogen)、温和混合并培养于室温30分钟。在培养后，添加上述复合物至含有细胞的各孔洞并温和混合。将细胞培养于37℃的CO2培养箱中20小时。藉由含蛋白酶抑制剂的RIPA将经转染的细胞溶解，且准备准化蛋白质。简而言之，将80μLANTI-FLAGM2MagneticBeads(Sigma-Aldrich)进行平衡以用于单孔(one-well)细胞裂解物纯化，在蛋白质-树脂结合于4℃隔夜之后，藉由以150μg/mL3XFLAG胜肽的竞争洗提两次以洗提出经结合的FLAG融合蛋白，收集洗提物并藉由西方墨点法(westernblot)来确认蛋白质。3.NEU2或NEU4的功效测试(1)蛋白质定量:使用PierceBCAProteinAssayKit(Thermo)，根据制造商指示，将蛋白质进行定量。简单而言，吸取25μL连续稀释的BSA标准品与在20uL样品稀释液中的5μL样本至96-孔培养盘。为了制备BCA工作试剂，混合50份的BCA试剂A与1份的BCA试剂B且置于冰上直到使用。添加200μL的BCA工作试剂至每孔洞并彻底混合，覆盖培养盘并于37℃培养30分钟。藉由光谱仪(Epoch,BioTek)于562nm测定吸光值。(2)细胞凋亡(Apoptosis)测定血管内皮细胞、肾细胞在3或4代后被使用且维持于含有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen)。在处理期间胎牛血清减低至5％于DMEM中。将1×104个细胞种入96孔盘24小时稀疏培养(subconfluentcultures)的培养细胞被暴露于PBS(无脂蛋白，负控制组)或分类的(25、50与100μg/mL)LDL亚级分(subfractions)、未分级正常血脂的(unfractionatednormolipidemic)LDL与LDL/L1/L5与唾液酸酶(sialidase)培养24小时。藉由以ZeissAxiovert200荧光显微镜与抓住根据细胞核、细胞凋亡DNA膜完整性(integrity)的Hoechst33342、碘化丙啶(propidiumiodide)(红)与钙黄绿素(calcein)AM(绿)的染色的数位影像的滤光片的可视化来分析细胞凋亡。藉由使用CellDeathDetectionELISAAssay(Roche)，根据制造商的程序来检查细胞质组蛋白相关片段(cytoplasmichistone-associatedDNAfragmentation)。(4)用于蛋白质组成的LC/MSE分析藉由使用利用连续耦合液相层析数据独立平行片段质谱仪(seriallycoupledliquidchromatographydata-independentparallel-fragmentationmassspectrometry,LC/MSE)的定量蛋白质体学技术来定量低密度脂蛋白亚级分的蛋白质含量。此种分析已被显示，在关于在一复合蛋白质混合物中的相对及/或绝对(当在数据收集/分析中并入spikedinternalpeptide标准品)蛋白质丰富度的方面，是高度定量的。除了WatersXevoG2与SynaptTMHDMS质谱仪(WatersCorporation,MA,USA)之外，可实质上如先前所述来执行定量分析。简单而言，从各低密度脂蛋白级分分离出的总蛋白质被胰蛋白酶分解，且所产生的胰蛋白酶分解胜肽被被色层分离藉由Nano-Acquityseparationsmodule(WatersCorporation,MA,USA)，合并酵母菌醇脱氢酶(yeastalcoholdehydrogenase)的50fmol-on-columntrypticdigest为内在spikedprotein定量标准品。经由75ìm×25cmBEHC-18管柱在一梯度条件下，在30分钟以300nL/分钟的流速，于35℃执行胜肽洗提。移动相是由为有机改质剂(organicmodifier)的乙腈(acetonitrile)与用于分子质子化(moleculeprotonation)的甲酸(formicacid)(0.1％v/v)所构成。质谱仪被执行于装配有纳米电喷洒离子化界面(nano-electrosprayionizationinterface)的SynaptHDMS仪器，并操作于数据独立收集模式(data-independentcollectionmode,MSE)。制定平行离子碎裂(Parallelionfragmentation)以在碰撞室中在低(4eV)与高(15-45eV)能量之间进行切换，且使用glu-血纤维蛋白肽(glu-fibrinopeptide)B为分开数据通道固定质量校准(separatedatachannellockmasscalibrant)，从50至2000m/z收集数据。以ProteinLynxGlobalServerv2.4(Waters)处理数据。从Uniprot(www.uniprot.org)人类蛋白质数据库搜寻去同位素结果(Deisotopedresultswill)的蛋白质相关。4.ASAH2的筛选(1)转形(具有ASAH2基因的pCMV6载体的基因选殖)：ASAH2(N-acylsphingosineamidohydrolase2)为购自Origene，RC203706。藉由ECOSTM101DH5α胜任细胞(Yeastern,FYE608)，根据制造商指示来放大基因。简而言之，将1小玻璃瓶(vial)的胜任细胞与5μL质体震荡一秒，且之后培养于冰上5分钟。在42℃的45秒热休克(heat-shoc)后，将混合物涂盘于具有卡那霉素的LB琼脂上。以聚合酶链锁反应藉由VP1.5与XL39引子来确认菌落(colonies)，聚合酶链锁反应95℃，1分钟，用于前聚合酶链锁反应变性(pre-PCRdenaturation)；2次循环的95℃，10秒，62℃，20秒，72℃，4分钟；2次循环的95℃，10分钟，60℃，20秒，72℃，4分钟；2次循环的95℃，10秒，58℃，20秒，72℃，4分钟；15次循环的95℃，10秒，56℃，20秒，72℃，4分钟；于72℃，10分钟用以后-聚合酶链锁反应培养并维持于4℃。(2)质体萃取在确认经转形的菌落的插入后，将经转形细胞置于具有25mg/mL卡那霉素的5mLLB培养液中，之后隔夜培养37℃。根据PlasmidMiniprepPlusPurificationKit(GeneMark,DP01P)的步骤来萃取质体DNA。简而言之，将细菌于14,000xg下离心1分钟，移除培养基。将沉淀物重新悬浮于200μLSolutionI，之后添加200μLSolutionII，并藉由倒置试管来混合。添加200μLSolutionIII且藉由倒置试管5物来混合。将细胞溶解物(lysate)以最高速离心5分钟，且一紧密的白色沉淀会沿着管壁形成。将离心管柱(spincolumn)插入一收集管柱，并将清澈的细胞溶解物移至离心管柱，并以最高速离心1分钟。将流出液丢弃，将500μLEndotoxinRemovalWashSolution载入离心管柱中并等待2分钟以平衡膜，然后以最高速离心1分钟。将滤出液丢弃且加入700μLWashingSolution、于最高速离心1分钟，并重复此步骤。丢弃滤出液且于5分钟以移除残留的微量乙醇。将离心管柱移至一新的试管中并添加35μL水，等待1-2分钟，且于最高速离心2分钟以洗提出DNA。藉由微孔盘光谱仪(microplatespectrophotometer)(Epoch,BioTek)将DNA定量。(3)对于HEK细胞的转染(transfection)与蛋白质纯化在转染前一天，将1.25*105个HEK293T细胞置于500μLDMEM培养基中于24-孔盘中。对于要被转染的各孔洞中细胞而言，1μg的DNA稀释于100μL无血清培养基中，并添加1.5μL的Lipofectamine2000TransfectionReagent(Invitrogen)、温和混合并培养于室温30分钟。在培养后，添加上述复合物至含有细胞的各孔洞并温和混合。将细胞培养于37℃的CO2培养箱中20小时。藉由含蛋白酶抑制剂的RIPA将经转染的细胞溶解，且准备准化蛋白质。简而言之，将80μLANTI-FLAGM2MagneticBeads(Sigma-Aldrich)进行平衡以用于单孔(one-well)细胞裂解物纯化。在蛋白质-树脂结合于4℃隔夜之后，藉由以150μg/mL3XFLAG胜肽的竞争洗提两次以洗提出经结合的FLAG融合蛋白，收集洗提物并藉由西方墨点法(westernblot)来确认蛋白质。5.ASAH2功效测试(1)蛋白质定量:使用PierceBCAProteinAssayKit(Thermo)，根据制造商指示，将蛋白质进行定量。简单而言，吸取25μL连续稀释的BSA标准品与在20μL样品稀释液中的5μL样本至96-孔培养盘。为了制备BCA工作试剂，混合50份的BCA试剂A与1份的BCA试剂B且置于冰上直到使用。添加200μL的BCA工作试剂至每孔洞并彻底混合，覆盖培养盘并于37℃培养30分钟。藉由光谱仪(Epoch,BioTek)于562nm测定吸光值。(2)脂质萃取将30μgLDL/L1/L5与5μg的ASAH2于ASAH2缓冲冲溶液(200mMTris-HCl于pH8.4，1.5MNaCl、25mMCaCl2)中培养于37℃。在培养2或24小时后，将样本转移至玻璃试管中。将1mL水、2.5mL甲醇与1.25mLCHCl3加至样本中，震荡15秒。之后，提供额外的0.9mL水与1.25mLCHCl3至样本，震荡15秒且于3000rpm离心10分钟。使用玻璃注射器将底层有机溶剂移至2.0mL玻璃试管。将沉淀以氮气冲各样本直到干燥，并以0.25mL样本溶液(isopropanol/acetonitrile/水＝2:1:1)溶解。(3)用于脂质组成的LC/MSE分析藉由使用液相层析数据独立平行片段质谱仪(LC/MSE)来定量来自低密度脂蛋白各亚级分的总脂质、磷脂质(phospholipids)、中性脂质(neutrallipids)与游离脂肪酸(freefattyacid)的脂质含量。可实质上如先前所述来执行定量分析。简单而言，脂质经由合并CSHTM1.7μm,2.1mm×10cmC-18管柱的Acquityseparationsmodule(WatersCorporation,MA,USA)，在一梯度条件下，在18分钟内以400μL/分钟的流速，于55℃层析分离。移动相A由在ACN/H2O(60/40)中的10mMNH4HCO2与0.1％甲酸(0.1％v/v)所构成，移动相B由在IPA/ACN(90/10)中的10mMNH4HCO2与用于分子质子化的0.1％甲酸所构成(0.1％v/v)所构成。质谱仪被执行于装配有纳米电喷洒离子化界面(nano-electrosprayionizationinterface)的SynaptHDMS仪器，并操作于数据独立收集模式(data-independentcollectionmode,MSE)。制定平行离子碎裂(Parallelionfragmentation)以在碰撞室中在低(4eV)与高(35-55eV)能量之间进行切换，且使用亮氨酸(leucin)为分开数据通道固定质量校准(separatedatachannellockmasscalibrant)，从50至1600m/z收集数据。以MarkerLynx(Waters)处理数据。B.结果1.转形(1)NEU2与NEU4NEU2的转形结果如图2与所示。由图2A可知，菌落3、5与6(分别参见电泳轨迹(lane)3、5与6)的NEU2转形成功。因此选择菌落3、5与6放大与保存NEU2的质体。(1)ASAH2ASAH2的转形结果如图3所示。选择菌落7放大与保存ASAH2的质体。2.转染藉由西方墨点法确认NEU4/ASAH2的基因转染，结果如图4所示。转染条件如下：HEK293T1.25x105个细胞于24孔中质体：NEU4与ASAH2DNA量：1μg藉由Lipofectamine进行转染。西方墨点条件如下：SDS-PAGE：使用5μL样本一次抗体：抗-DDK(1:2000)3.蛋白质纯化(1)NEU2的纯化NEU2的纯化结果如图5所示。图5显示确实纯化出NEU2。NEU2的氨基酸序列如序列辨识号：1所示。(2)ASAH2纯化ASAH2的纯化结果如图6所示。图6显示确实纯化出ASAH2(萃取1与萃取2为不同批次所获得的蛋白质)。ASAH2的氨基酸序列如序列辨识号：2所示。实施例2酶固定方法1将热活化后的0.4454g硅胶置于7mLCHCl3，并加入1/5份重量APTS常温搅拌24小时后将之过滤，所得固体于真空下50℃抽干，抽干后的固体物加入5％戊二醛(glutaraldehyde)(pH＝8的磷酸缓冲溶液1XTBS)后于常温下搅拌21小时，过滤水洗并取出其中固体物，加入NEU21/100-10000(wt％)以磷酸缓冲溶液1XTBSpH＝8稀释到体积为2mL，于常温反应24小时最后将固体过滤，以磷酸缓冲溶液pH＝8洗涤即可得到酶固定化产物(ITRI-Siw-Nu-01)。方法2热活化硅胶于甲苯(toluene)中加入1/5份重量3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane)回流20小时后将之过滤，并以丙酮洗涤后将所得固体于真空下抽干。NEU2加入上述处理后树脂1/100～1/10000(wt％)于磷酸缓冲溶液搅拌2小时15分后将固体过滤，并分别以去离子水及pH＝8的缓冲溶液洗涤得酶固定产物。方法3取1g纤维素珠子于15mL水中以NaOH溶液调整pH到11左右，保持常温下加入1g溴化氰(cyanogenbromide)，约30分钟后将珠子依续以去离子水、pH＝8的磷酸缓冲溶液清洗，将此珠子加入1/600重量比NEU2于磷酸缓冲溶液中，搅拌隔夜后再以pH＝8的磷酸缓冲溶液清洗得酶固定化产物。方法4取0.5g纤维素珠子于1.5mLAPTS10mL甲苯溶剂中回流4小时，纤维素珠子过滤并分别以丙酮、及pH＝8的磷酸缓冲溶液清洗，将获得的珠子加入5％(w/v)戊二醛/pH＝8的磷酸缓冲溶液后于常温下搅拌21小时，过滤取出固体物，并以磷酸缓冲溶液(pH＝8)洗涤得到戊二醛活化硅胶，将此珠子加入2/1000重量比NEU2于磷酸缓冲溶液中搅拌隔夜后再以pH＝8的磷酸缓冲溶液清洗得酶固定化产物。方法5取加入5％戊二醛(pH＝8的磷酸缓冲溶液)后于常温下搅拌21小时，过滤取出固体物，并以磷酸缓冲溶液(pH＝8)洗涤得到戊二醛活化硅胶，取NEU21/10000(wt％)以磷酸缓冲溶液pH＝8稀释到体积为15mL，再与上述1.13g戊二醛活化硅胶于常温下搅拌20小时，最后将固体过滤，以磷酸缓冲溶液pH＝8洗涤即可得到酶固定化产物。方法61g二乙氨基乙基纤维素(diethylaminoethylcellulose,DEAEcellulose)以10mL水水洗后悬浮在NaOH(1M10mL水溶液)，搅拌10分钟后将之过滤水洗，将获得的固体悬浮于10mL二噁烷(dioxane)中，另外将2g三聚氯氰(cyanuricchloride)及10mL甲苯加入上述固体悬浮溶液中搅拌30分钟后将其中固体过滤，分别再以二噁烷、水、丙酮清洗后减压干燥。然后，将此活化固体(activatedsolidsupport)加入NEU21/10000(wt％)搅拌18小时将之过滤、水洗获得酶固定化产物。方法70.5g壳聚糖(chitosan)珠子加入10mL0.5％戊二醛，常温下搅拌1小时之后连续以水彻底清洗，将此活化固体加入NEU21/3500(wt％)常温反应2小时后将反应物过滤并以去离子水彻底洗涤获得酶固定化产物。方法81g纤维素中空纤维(cellulosehollowfiber)同例4的方法分别经APTS、戊二醛活化后加入NEU23/10000(wt％)pH＝8的磷酸缓冲溶液搅拌隔夜后再以pH＝8的磷酸缓冲溶液清洗得酶固定化产物。方法91g纤维素中空纤维，同例3的方法别经CNBr活化后加入NEU2pH＝8的磷酸缓冲溶液搅拌隔夜后再以pH＝8的磷酸缓冲溶液清洗得酶固定化产物。方法10取ECR-8204F环氧-丙烯酸酯(epoxy-acrylate)树脂以去离子水洗涤后，加入ASAH21/10000(wt％)，并以0.2M磷酸钠盐缓冲溶液调整总体积至2ml，并旋转24hr将之过滤，并分别以去离子水、2MpH＝8磷酸缓冲溶液清洗。得湿产物约52mg。(ITRI-EC-AS-01)方法11取IontosorbMT200纤维珠子先以去离子水清洗后再分别以3:7水/二噁烷,7:3水/二噁烷,100％二噁烷清洗后加入二噁烷，并加入1/3份CDI旋转约0.5-1hr，于减压下抽除二噁烷，随即加入Neu2旋转搅拌约2hr15min，反应后将溶液过滤并以缓冲液pH＝6.5冲洗得得湿产物约0.2g(ITRI-CD-01)。方法12取0.5ugNeu2加入2％w/v藻酸盐(aliginate)水溶液中以针头滴入搅拌中的2％CaCl2(wt/v)水溶液，滴完后继续搅拌30min，将溶液中颗粒过滤并以去离子水水洗得湿产物(ITRI-A-01)。实施例3固定化NEU2填充装置的功效以实施例2中所示的方法2将NEU2进行固定，并将固定的酶填充于一管柱中以形成如图1B中的生化反应装置(固定化NEU2填充装置)。(1)细胞凋亡测定将L5(25μg/mL；50μg/mL)、与经过固定化NEU2填充装置处理2小时的L5(1.25μg)(处理温度37℃，pH7.4)分别与血管内皮细胞共培养24小时，并进行细胞凋亡测定，结果如图7所示。根据图7可以得知25μg/mLL5引起约15％血管内皮细胞凋亡反应，50μg/mLL5引起约30％细胞凋亡，而经过1.25μgNEU2作用后，L5对于血管内皮细胞的细胞凋亡影响减低。(2)负电性低密度脂蛋白定量分析将不经处理、以37℃不加酶处理2小时或经过NEU2处理2小时(处理温度37℃，pH7.4)的由心脏病患所获得的LDL样本分别进行L5定量分析，以确定L5的含量，结果如图8所示。根据图8可知，将LDL检体经过NEU2酶作用2小时过后，L5的含量降低，从原本12.4％降低为8.48％。(3)质谱分析将L5与经过经过NEU2处理2小时(处理温度37℃，pH7.4)的L5进行质谱分析，结果分别图9A、图9B与图9C所示。已知L5的特征为载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)的丝氨酸(serine)与苏氨酸(threonine)常常被醣基化修饰。参见图9A与图9B，分子量1497为无毒性LDL，LDL加上一个糖基分子为1700，LDL加上二个醣基分子为1884，而LDL加上三个糖基分子为2154。图9C显示载脂蛋白E的氨基酸序列被醣修饰作用，使原本胜肽链荷质比1497.8009增加为1700.8868、1884.9021与2154.0300。图10A1-2显示，经过固定化NEU2填充装置处理2小时的L5，已经测不到荷质比为1700、1884或2154的分子，代表载脂蛋白E的丝氨酸与苏氨酸上已不具醣基修饰，表示LDL的醣基已被移除。相似地，图10B1-2显示，经过固定化NEU2填充装置处理2小时的L5，在载脂蛋白E的其他位点也未出现醣基化修饰作用，代表LDL的醣基已被移除，代表LDL的醣基已被移除。实施例4ASAH2的功效(1)以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析将L5以ASAH2处理24小时，并将未经处理的L5与经前述处理的L5进行LC/MSE分析以测定其神经酰胺(ceramide)含量(详细实验方式参见实施例1的“A.方法”中的“5.ASAH2功效测试”)。LC/MSE分析结果如表1所示(每组中所示的四个数值来自将相同的样本测定4次)。将表1中各样本讯号进行换算而获得各样本神经酰胺含量百分比(以未经处理的L5的最高讯号最为100％)，结果如图12所示。图12中的ASAH2#1与ASAH2#2为不同批次所获得的ASAH2。表1、未处理的L5与以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析结果24小时基线以ASAH2#1处理以ASAH2#2处理讯号459.6464295.3353202.1154443.4776236.9632177.1598449.8201230.7273173.031451.5772249.0337175.7823平均值451.1303253.0149182.0221标准差6.65843129.2190613.50503减少43.959.724小时基线代表未经处理的L5所含有的神经酰胺含量根据表1与图12可知，L5经ASAH2处理24小时后，其神经酰胺含量明显下降。(2)以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析(详细实验方式参见实施例1的“A.方法”中的“5.ASAH2功效测试”)。将L5以ASAH2处理24小时，并将未经处理的L5与经前数处理的L5进行LC/MSE分析以测定其神经酰胺含量。LC/MSE分析结果如表2所示(每组中所示的四个数值来自将相同的样本测定4次)。将表2中各样本讯号进行换算而获得各样本神经酰胺含量百分比(以未经处理的L5的最高讯号最为100％)，结果如图13所示。表2、未处理的L5与以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析结果24小时基线以ASAH2#1处理以ASAH2#2处理讯号2008.4651827.8231638.1862007.3211747.4221627.0671946.9851725.0321622.8481989.7281688.3821616.651平均值1988.1251747.1651626.188标准差28.7359459.022719.070668减少12.1199718.2049524小时基线代表未经处理的L5所含有的神经酰胺含量根据表2与图13可知，L5经ASAH2处理24小时后，其神经酰胺含量明显下降。(3)在缓冲溶液存在或不存在下以ASAH2处理2或24小时的L5的LC/MSE分析在缓冲溶液(200mMTris-HClpH8.4,1.5MNaCl,25mMCaCl2)存在或不存在下将L5以ASAH2处理2或24小时，并将未经处理的L5与经前述处理的L5进行LC/MSE分析以测定其神经酰胺含量(除有无缓冲溶液混合外，详细实验方式参见实施例1的“A.方法”中的“5.ASAH2功效测试”)。LC/MSE分析的各样本讯号进行换算而获得各样本神经酰胺含量百分比(以未经处理的L5放置2小时后的最高讯号最为100％)，结果如图14所示。于图14中，LDL基线是指未经处理的L5放置0小时后所含有的神经酰胺含量；LDL2小时是指未经处理的L5放置2小时后所含有的神经酰胺含量；LDL24小时是指未经处理的L5放置24小时后所含有的神经酰胺含量。根据图14可知，在缓冲溶液存在下，L5经ASAH2处理2小时后，其神经酰胺含量可明显下降。而在缓冲溶液存在或不存在下，L5经ASAH2处理24小时后，其神经酰胺含量皆可明显下降。(4)在缓冲溶液存在或不存在下以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析在缓冲溶液(200mMTris-HClpH8.4,1.5MNaCl,25mMCaCl2)存在或不存在下将L5以ASAH2处理24小时，并将未经处理的L5与经前述处理的L5进行LC/MSE分析以测定其神经酰胺含量(除有无缓冲溶液混合外，详细实验方式参见实施例1的“A.方法”中的“5.ASAH2功效测试”)。LC/MSE分析结果如表4所示(每组中所示的四个数值来自将相同的样本测定4次)。将表4中各样本讯号进行换算而获得各样本神经酰胺含量百分比(以未经处理的L5的最高讯号最为100％)，结果如图15所示。表4、未处理的L5与在缓冲溶液存在或不存在下以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析结果24小时基线以ASAH2#1处理以ASAH2#2处理讯号217.36122.40121.87220.16122.08121.65214.80117.11123.68215.96121.81136.51平均值217.07120.85125.93标准差2.312.517.11减少44.3341.9924小时基线代表未经处理的L5所含有的神经酰胺含量根据表4与图15可知，在缓冲溶液存在或不存在下，L5经ASAH2处理24小时后，其神经酰胺含量皆可明显下降。(5)以ASAH2处理24小时的L5的LC/MSE分析L5与经ASAH2处理24小时的L5，利用质谱仪定量分析所含有的脂质成分，并比较神经酰胺(ceramide)含量的差异。结果如图16A所示。(6)在缓冲溶液存在下以ASAH2处理2小时的L5的LC/MSE分析在缓冲溶液(200mMTris-HClpH8.4,1.5MNaCl,25mMCaCl2)存在下将L5以ASAH2处理2小时，并将未经处理的L5与经前述处理的L5进行LC/MSE分析以测定其神经酰胺含量(详细实验方式参见实施例1的“A.方法”中的“5.ASAH2功效测试”)LC/MSE分析结果如表5所示(每组中所示的四个数值来自将相同的样本测定4次)。将表5中各样本讯号进行换算而获得各样本神经酰胺含量百分比(以未经处理的L5的最高讯号最为100％)，结果如图16B所示。表5、未处理的L5与在缓冲溶液存在或不存在下以ASAH2处理2小时的L5的LC/MSE分析结果样本名称讯号L50小时529.0532L50小时498.5066L50小时478.2745L50小时432.8346L5+ASAH2小时266.8874L5+ASAH2小时276.2790L5+ASAH2小时282.9767L5+ASAH2小时283.6284根据表5与图16B可知，在缓冲溶液存在下，L5经ASAH2处理2小时后，其神经酰胺含即可明显下降。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。当前第1页1 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