蔗渣固定化细菌及其在农田土壤磺胺甲恶唑污染修复中的应用的制作方法

本发明涉及蔗渣固定化细菌及其在农田土壤磺胺甲恶唑污染修复中的应用。

背景技术：

磺胺类抗生素是畜牧养殖业中应用最广泛的抗感染药物之一,其抗菌谱广,性质稳定,价格便宜,对控制感染性疫病有很好的作用，在国内外都有广泛的使用。近几十年来,国际市场对磺胺类药物的需求一直较为稳定。其在广大发展中国家特别是较为贫穷的国家一直是抗菌消炎的主力军,用量较大。在发达国家,磺胺类药物则大多作为畜禽治疗及预防用药添加到饲料中,用量较大且需求较为稳定。我国随着养殖业飞速发展，磺胺类抗生素使用量亦与日俱增，同时养殖业滥用抗生素现象普遍。磺胺类抗生素通过两个渠道进入农田，一是畜禽粪便和鱼塘污泥作为有机肥施用到农田，二是粪便中抗生素经雨水径流和养殖场废水排放等进入水体，并用于农田灌溉。土壤中长期大量累积的磺胺类抗生素，导致土壤磺胺类抗生素污染严重。

我国一些规模化猪牛养殖场猪粪便中磺胺类抗生素高达13399.5μg/kg，牛粪中高达15930.3μg/kg。一些蔬菜基地土壤磺胺类抗生素检出率达100.0％。据文献报道2010年我国畜禽粪便的排放量将达4.50×10⁹吨，如果根据现阶段的处理水平，约80％以上畜禽粪便未经过综合处理，一部分直接施于农田。上世纪90年代，在对肉、蛋、奶需求的推动下，我国畜禽养殖业飞速发展，大量的饲用抗生素类药物，被广泛应用于畜禽养殖业，并呈快速发展的态势。近年，饲用抗生素年平均消费已达6.00×10³吨，并集中应用于经济发达地区。

由于磺胺类抗生素具有难降解和高残留等特点，因此，农田土壤中长期大量累积的磺胺类抗生素不仅会影响植物生长、微生物群落组成和降低土壤微生物对其他污染物的降解能力，同时农作物大量吸收累积的抗生素可通过食物链进入人体，导致人体肾脏损伤、过敏反应、抑制造血系统和细菌抗药性等，对人类健康构成极大的威胁。

鉴于环境中抗生素污染的严重性和危害性，抗生素污染修复技术受到了广泛关注。近年来水体以及畜禽粪便中中磺胺类抗生素污染去除技术研究较多。例如：

哈尔滨工业大学蒋本超从污泥中筛选出一株能以磺胺甲恶唑为唯一碳源生长的嗜冷菌HA-4。经鉴定菌株HA-4属于Pseudomonas菌属。菌株HA-4的最佳生长降解条件为：pH＝6.0左右，温度范围为10℃-15℃，摇床转速为150r/min，接种量为15％(V/V)，且在此条件下，培养192h，100mg/l磺胺甲恶唑的降解率为34.3％。

采用简单物化法主要针对磺胺生产过程中排出的大量含酸废水，采用适当过量的电石渣加入到含酸废水中，持续搅拌30min即可达到完全反应，使酸性废水呈中性处理后的废水达到工业废水排放标准；采用超声降解方法降解废水中磺胺嘧啶，在超声功率为400W条件下，超声180min后，磺胺嘧啶降解率达到30.90％；采用活性污泥法厌氧生物处理处理磺胺废水的研究，磺胺废水稀释20倍后，再进行26h以上的曝气处理等。

已公开的专利CN201310734659.5描述了通过将畜禽粪便与秸秆、锯末等调理剂混合的好氧堆肥方法，降解残留在畜禽粪便和尿液中的磺胺类抗生素。

CN201510989751.5描述了一种利用常温发酵去除畜禽粪便中残留抗生素的方法，先在在畜禽粪便中加入浓硫酸调节pH，然后将粪便平铺于封闭或半封闭容器中，控制温度在28-35℃之间，固态发酵4-6天，去除磺胺类抗生素等。

现有技术方法对猪粪中的磺胺类抗生素的降解速率相对较快，而抗生素一旦进入土壤，首先与土壤发生吸附作用并在一定条件下部分抗生素会与土壤有机质形成稳态、失活性结合残留物，使得土壤中磺胺类抗生素具有难降解和高残留等特点，有关土壤磺胺类抗生素污染修复的报道很少。

技术实现要素：

本发明目的是为了克服现有技术的不足，提供一种细菌密度大、反应速度快、耐环境冲击同时能够清除土壤中高残留难降解磺胺类抗生素磺胺甲恶唑污染的蔗渣固定化细菌。

本发明的另一目的是提供一种上述蔗渣固定化细菌在土壤磺胺甲恶唑污染修复中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

蔗渣固定化细菌，其特征在于采用蔗渣为载体固定化阴沟肠杆菌菌属。

本发明中以蔗渣为载体，构建高效稳定的农业废料固定化细菌体系。农业废料固定化细菌不仅具有细菌密度大、反应速度快和耐环境冲击等特点，且农业废料载体廉价且环保，因此，在农田土壤磺胺类抗生素污染修复中具有更大应用潜力。同时清除土壤中高残留难降解磺胺类抗生素污染，对保护农业生产、生态环境和人体健康具有重要意义。

微生物修复是一种公认的有效、安全、廉价和无二次污染的方法。而固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将分散游离的微生物固定在限定的空间区域，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。固定化微生物由于具有微生物密度大、反应速度快和耐环境冲击特点，因此，该技术有望克服投加到修复现场中的游离高效降解微生物与土著菌的恶性竞争或难以适应环境的问题，

然而微生物修复固定化微生物技术利用载体材料提供的有利微环境作为缓冲体系，屏蔽土著微生物的竞争作用和不利土壤条件的侵害作用，从而保证接种的高效降解微生物的良好生长；同时固定化载体作为吸附剂还可以有效地富集土壤中的磺胺类抗生素，提高其在载体上的生物有效浓度；此外微生物及其分泌的胞外酶也被富集固定在载体上，增加了与高效降解微生物的接触效率。实现高效降解菌有效修复污染土壤。为此固定化微生物修复有机污染土壤正受到越来越多的关注。

目前用作微生物固定化的载体多为成本较高的有机载体，如戊二醛、海藻酸钙、海藻酸钠、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺凝胶等，难以适应工业化生产的要求。农业废弃物(蔗渣、花生壳和秸秆等)作为微生物固定化的载体，不仅可以屏蔽土著微生物的竞争和不利土壤条件的侵害进而保证其负载的微生生长，还可吸附富集土壤中的磺胺类抗生素污染物，从而增加磺胺类抗生素的生物可利用性，提高固定在其表面上的微生物降解磺胺类抗生素的效率。农业废弃物含有丰富的C、N等营养元素；可向土壤释放天然有机质，改善土壤理化性质，促进土壤微生物活性和数量，增强磺胺类抗生素去除；对微生物有很强的亲和性；在土壤中可自然降解，用后的处理简单环保，不会造成二次污染；且价格低廉。

本发明中的蔗渣经过无机盐液体培养液处理，处理时，无机盐液体培养液与蔗渣的用量比为10mL：3g。

本发明中的阴沟肠杆菌在接种于蔗渣载体时预先分别经过培养制备成菌悬液。本发明中的阴沟肠杆菌由采集于广州良种猪场的猪粪经选择性富集培养、分离纯化得到。

本发明中的菌悬液与处理过的蔗渣的用量比为1mL：1～6g，优选为1mL：3g。

蔗渣为生物质材料，生物质材料蔗渣固定化细菌体系的蔗渣载体不仅可以屏蔽土著微生物的竞争和不利土壤条件的侵害进而保证其负载的微生生长，还可吸附富集土壤中的磺胺类抗生素污染物，从而增加磺胺类抗生素的生物可利用性，提高固定在其表面上的微生物降解磺胺类抗生素的效率。生物质材料蔗渣是农业废弃物，含有丰富的C、N等营养元素；可向土壤释放天然有机质，改善土壤理化性质，促进土壤微生物活性和数量，增强磺胺类抗生素去除；对微生物有很强的亲和性；在土壤中可自然降解，用后的处理简单环保，不会造成二次污染；且价格低廉。

本发明中的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae strain)细菌菌株(以下简称HM1)由采集于广州良种猪场的猪粪经选择性富集培养、分离纯化得到。HM1是能以磺胺甲恶唑为唯一碳源进行生长的磺胺甲恶唑降解菌。其他被喂养过磺胺甲恶唑的畜禽粪便也可以采集阴沟肠杆菌。

本发明将阴沟肠杆菌固定在蔗渣上的步骤为：

称取蔗渣，洗净烘干剪碎后加入锥形瓶中，灭菌处理后分别加入无菌的无机盐液体培养液和阴沟肠杆菌菌悬液于同一锥形瓶中，混匀密封后于28-30℃，转速为150rpm的摇床内振荡培养至微生物生物量最大即得蔗渣固定化细菌(HM1)。

一般培养2天即可达到微生物生物量最大。

所述的细菌菌悬液接种于浸泡有蔗渣载体的无机盐液体培养液，于28℃，转速150rpm的摇床内振荡培养至生物量最大而制得固定化细菌(HM1)。

其中细菌菌悬液通过以下步骤培养制备而得：

将纯化后的细菌接种于50mL液体培养基中，并将pH调至7.0，于28℃，150r/min的摇床上振荡培养至微生物的生物量达到最大，取4mL的菌液于离心管内，于4000r/min下离心分层，然后将离心管内上清液倒出，补充磷酸缓冲液继续离心分层，重复离心3次，制成细菌菌悬液置于4℃冰箱备用。

制备菌悬液时，一般培养36h可至微生物生物量最大，离心时，离心10min即可。

一种上述蔗渣固定化细菌(HM1)在土壤磺胺类抗生素磺胺甲恶唑污染修复中的应用。

本发明蔗渣固定化细菌(HM1)在土壤磺胺类抗生素磺胺甲恶唑污染修复中应用时，蔗渣固定化细菌的用量为以蔗渣载体1重量份处理其10倍重量内的污染土壤。

本发明相对于现有技术而言，具有以下优点：

本发明蔗渣固定化细菌(HM1)所用载体生物质材料蔗渣成本低，蔗渣固定化细菌(HM1)修复土壤磺胺类抗生素磺胺甲恶唑污染时简单环保，不会造成二次污染，同时可提高磺胺类抗生素的生物可利用性，提高微生物降解磺胺类抗生素的效率。

本发明生物质材料蔗渣固定化细菌修复土壤磺胺类抗生素磺胺甲恶唑污染的技术，对消除土壤中磺胺类抗生素污染，避免磺胺类抗生素污染通过食物链的传递对人类健康构成的威胁有着十分重要的意义。

【附图说明】

图1为游离细菌(HM1)和蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的效果；

图2为灭菌和非灭菌土壤对蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的影响；

图3为重金属离子Cd²⁺和Pb²对蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的影响；

其中，图1-图3中的横轴都为时间(天)轴，纵轴都为降解率(％)轴；

图1中各条曲线代表的意义为：

—■—对照处理(不加菌)

—●—游离细菌(HM1)处理(加菌悬液1mL)

—▲—固定化细菌(HM1)处理(蔗渣1g+1mL HM1菌悬液)

—▼—固定化细菌(HM1)处理(蔗渣3g+1mL HM1菌悬液)

—◆—固定化细菌(HM1)处理(蔗渣6g+1mL HM1菌悬液)

图2中各条曲线代表的意义为：

—■—非灭菌土壤对照处理，

—●—非灭菌土壤中磺胺甲恶唑的降解率，

—▲—灭菌土壤对照处理，

—▼—灭菌土壤中磺胺甲恶唑的降解率。

图3中各条曲线代表的意义为：

—■—对照处理，

—●—加菌处理土壤中磺胺甲恶唑的降解率，

—▲—Cd²⁺存在时加菌处理土壤中磺胺甲恶唑的降解率，

—▼—Pb²⁺存在时加菌处理土壤中磺胺甲恶唑的降解率。

【具体实施方式】

本发明一种蔗渣固定化细菌(HM1)，采用蔗渣为载体固定化阴沟肠杆菌属细菌(HM1)，具体制备方法为：

采集广州良种猪场的猪粪，选择性富集培养、分离纯化出细菌(HM1)，进行驯化培养成细菌菌悬液，再将菌悬液接种于无机盐液体培养液处理的蔗渣载体上培养至微生物的生物量最大即可；

其中驯化培养制备菌悬液的条件为：pH调至7.0，于28℃，150r/min的摇床上振荡培养36h至微生物生物量最大，以4000r/min的速度离心分离出菌悬液置于4℃冰箱备用；

其中制备蔗渣固定化细菌(HM1)的条件为：按细菌菌悬液与处理过的蔗渣的用量比1：1～6(ml/g)接种细菌(HM1)菌悬液于蔗渣载体后，于28℃，摇床转速为150rpm摇床内振荡培养2d，至微生物的生物量达到最大，表象为蔗渣载体长满菌即可。

本发明所用各种培养基如下：

液体培养基：K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO₄ 0.2g，NH₄NO₃ 1.0g，磺胺甲恶唑SMX 0.1g，微量元素溶液10mL，蒸馏水l000mL，pH 7.5。固体培养基需加20-25g琼脂。

无机盐培养基(无机盐液体培养液)：K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO₄0.2g，NH₄NO₃ 1.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水l000mL，pH 7.2-7.5。

微量元素溶液：FeSO₄ 0.1g/L，MnSO₄ 0.1g/L，ZnSO₄ 0.1g/L，Na₂MoO₄ 0.01g/L，CaCl₂ 0.1g/L，MgSO₄ 3g/L，CuSO₄ 0.1g/L。

本发明采集的阴沟肠杆菌属细菌(HM1)是以磺胺甲恶唑为唯一生长碳源选择性驯化培养而得。这样筛选出来的HM1通过甘蔗渣固定化增多菌株数量，给细菌提供一个良好的生长微环境，从而能够高效降解磺胺甲恶唑。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1：游离细菌(HM1)和蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的效果比较

将经纯化后的菌株HM1接种于50mL液体培养基中，并将pH调至7.0，于28℃，150r/min的摇床上振荡培养36h，至微生物的生物量达到最大，分别取4mL的菌液于离心管内，于4000r/min下离心10min，然后将离心管内上清液倒出，补适量的磷酸缓冲液继续离心10min，如此重复3次，制成菌悬液置于4℃冰箱备用。

供试赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质土壤，pH值(水/土＝2.5/1)为5.35，有机质为7.89g/kg，氮、磷、钾为别0.71、0.72、2.61g/kg，磺胺甲恶唑未检出，过2mm筛。

在500g过2mm筛的土壤中加入50mL磺胺甲恶唑含量为2000mg/L的磺胺甲恶唑丙酮溶液，搅拌均匀，室内风干后再与500g过2mm筛的土壤混合均匀，即制得人工模拟磺胺甲恶唑污染土壤。暗箱培养污染土壤4周，实验前测定污染土壤中磺胺甲恶唑的初始浓度为92.35mg/kg。

蔗渣固定化细菌(HM1)制备：分别称取已选取出的最佳载体蔗渣1g，3g，6g洗净烘干剪碎后分别加入250mL锥形瓶中，每组平行三个，同时准备空的250mL锥形瓶以用作游离微生物的培养，一起置于1.5Mpa的高压灭菌锅中灭菌25min，待灭菌锅气压下降后迅速转移至无菌操作台上，在紫外灯下灭菌冷却到室温，然后向每个锥形瓶中各加入5mL无菌的无机盐液体培养液，再用移液枪分别加入1mL细菌(HM1)菌悬液于各个锥形瓶中，混匀，密封瓶口，贴上标签，置于28℃，摇床转速为150rpm摇床内振荡培养，2d后加入10g磺胺甲恶唑污染土壤进行修复实验。

试验设置以下3种处理：处理1：对照处理(不加菌)；处理2：游离细菌(HM1)处理(加菌悬液1mL)；处理3-1：固定化细菌(HM1)处理(蔗渣1g+1mL HM1菌悬液)；处理3-2：固定化细菌(HM1)处理(蔗渣3g+1mL HM1菌悬液)；处理3-3：固定化细菌(HM1)处理(蔗渣6g+1mL HM1菌悬液)；

每种处理下有18个烧杯，分别于第5、10、15、20、25和30d取样测定磺胺甲恶唑的残留量，每种处理3个平行。试验中保持各处理中受试土壤的含水率为15％左右。处理结束后，测定各处理污染土壤中磺胺甲恶唑的残留量并计算磺胺甲恶唑的降解率，对于同等磺胺甲恶唑污染水平的土壤，蔗渣固定化菌(HM1)处理3-1、3-2、3-3和游离菌(HM1)处理2修复效果如图1所示。

由图1可见磺胺甲恶唑的降解率在对照处理、游离细菌处理、固定化细菌处理中分别为：6.09％，58.16％，69.56％，84.14％，83.76％。固定化细菌处理使得磺胺甲恶唑的降解率比游离细菌处理高出了近26个百分点。这说明固定化细菌对磺胺甲恶唑的降解效果大大优于游离细菌。同时也可看出，当蔗渣用量增大时，土壤中磺胺甲恶唑的降解率也有增加，当蔗渣用量增加到6g时，降解率增加已不太明显，这是由于当蔗渣用量增加到3g时，微生物生长所需的碳源已相对充足，因此在实际应用过程中，为节约成本，处理3-2的菌渣比为最佳比例。

实施例2：灭菌和非灭菌土壤对蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的影响

菌悬液同实施例1，各处理所加菌均为蔗渣固定化细菌(HM1)，供试土壤和蔗渣固定化细菌(HM1)制备同实施例1，实验前测定污染土壤中的磺胺甲恶唑初始浓度为92.35mg/kg。

本实施例设置以下4个处理：

处理1：非灭菌土加菌处理(加蔗渣固定化HM1(1ml：3g))

处理2：非灭菌土对照处理(不加菌)

处理3：灭菌土加菌处理(加蔗渣固定化HM1(1ml：3g))

处理4：灭菌土对照处理(不加菌)

每种处理下有18个烧杯，分别于第5、10、15、20、25和30d取样测定磺胺甲恶唑的残留量，每种处理3个平行。试验中保持各处理中受试土壤的含水率为15％左右。

处理结束后，测定各处理污染土壤中磺胺甲恶唑的残留量并计算磺胺甲恶唑的降解率，对于同等磺胺甲恶唑污染水平的土壤，灭菌和非灭菌土壤中磺胺甲恶唑的降解率如图2所示，无论土壤灭菌与否加菌处理前10d，磺胺甲恶唑的降解率迅速增加，10d后磺胺甲恶唑的降解率缓慢增大，20d后降解率变化趋于平缓。加入蔗渣固定化细菌(HM1)处理30d后，非灭菌土中磺胺甲恶唑的降解率达到84.14％，高于灭菌土中磺胺甲恶唑的降解率79.09％，不管土壤是否灭菌，土壤中磺胺甲恶唑的降解率相差很小，因此，灭菌和非灭菌对土壤中磺胺甲恶唑的降解率影响较小。

实施例3：土壤中重金属离子Cd²⁺和Pb²对蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的影响

菌悬液同实施例1，各处理所加菌均为蔗渣固定化细菌(HM1)，供试土壤和蔗渣固定化细菌(HM1)制备同实施例1，但其中的灭菌无机盐液体培养基中分别含0.01％的PbC1₂和CdC1₂，实验前测定污染土壤中磺胺甲恶唑的初始浓度为92.35mg/kg。

本实施例设置以下4个处理：

处理1：对照处理(不加菌)

处理2：加菌处理(加蔗渣固定化HM1(1ml：3g))

处理3：Cd²⁺+加菌处理(Cd²⁺+蔗渣固定化HM1(1ml：3g))

处理4：Pb²⁺+加菌处理(Pb²⁺+蔗渣固定化HM1(1ml：3g))

每种处理下有18个烧杯，分别于第5、10、15、20、25和30d取样测定磺胺甲恶唑的残留量，每种处理3个平行，试验中保持各处理中受试土壤的含水率为15％左右。

处理结束后，测定各处理污染土壤中磺胺甲恶唑的残留量并计算磺胺甲恶唑的降解率。对于同等磺胺甲恶唑污染水平的土壤，不同重金属离子存在下，土壤中磺胺甲恶唑的降解率变化如图3所示，土壤中重金属离子Cd²⁺和Pb²的存在对蔗渣固定化细菌(HM1)修复磺胺甲恶唑污染土壤均有一定的影响，在处理30d后，无重金属离子加菌处理、Cd²⁺+加菌处理和Pb²⁺+加菌处理降解率分别为84.14％、80.93％和80.61％，Cd²⁺存在时土壤中磺胺甲恶唑的降解率较无Cd²⁺存在时的降解率降低仅仅4％，即便土壤中存在重金属离子Cd²⁺和Pb²⁺，蔗渣固定化细菌(HM1)对土壤中磺胺甲恶唑的降解率仍可达到80％以上。

上述三个实施例的结论总结为:

1、对于磺胺甲恶唑初始浓度为92.35mg/kg的土壤，蔗渣固定化细菌(HM1)和游离细菌(HM1)处理30d后，磺胺甲恶唑的降解率分别为84.14％和58.16％，表明蔗渣固定化细菌(HM1)对磺胺甲恶唑的降解效果大大优于游离菌。

2、蔗渣固定化细菌(HM1)处理30d后，非灭菌土中磺胺甲恶唑的降解率达到84.14％，而灭菌土中磺胺甲恶唑的降解率为79.09％，不管土壤是否灭菌，土壤中磺胺甲恶唑的降解率差距较小，因此，土壤微生物对蔗渣固定化细菌(HM1)降解土壤中磺胺甲恶唑的影响较小。

3、土壤中的重金属离子Cd²⁺和Pb²⁺对蔗渣固定化细菌(HM1)处理土壤中磺胺甲恶唑均有一定影响，但即便土壤中存在重金属离子Cd²⁺和Pb²⁺，蔗渣固定化细菌对土壤中磺胺甲恶唑的降解率仍可达到80％以上。这些说明蔗渣固定化不仅有较强的降解土壤中磺胺甲恶唑的能力，而且也有较好的环境适应能力。

可见,本发明蔗渣固定化细菌(HM1)具有较好的环境适应能力，为其在复杂土壤环境中的应用提供了保证。