一种热稳定性和比酶活提高的角蛋白酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种热稳定性和比酶活提高的角蛋白酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术：

角蛋白酶(keratinase)，是一种由微生物产生，可以降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，牛羊角等)的特异性蛋白酶。角蛋白酶作为一种底物专一性宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，在工业化应用中具有很大的潜力，可以替代传统蛋白酶，用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等方面。此外，角蛋白酶还可效降解引起绵羊瘙痒症和疯牛病的阮病毒。随着工业化的发展，野生菌所产角蛋白酶性能和产量远远不能满足市场需求。目前筛选得到的产角蛋白酶野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶生产强度。重组角蛋白酶一般经过性能改造，胞外酶活单一，简化了发酵下游的纯化工作。另外，工业化应用上对酶的要求苛刻，如高温环境会很大程度影响角蛋白酶活性。为减省生产成本，必须实现角蛋白酶重复利用，另外还需要催化活力高，底物专一性强的角蛋白酶进行精细化学的催化。人们从自然界筛选分离地角蛋白酶已经远远不能满足工业化需求，所以通过分子改造技术寻求新型角蛋白酶将是一个新的研究手段。

发明人前期对来源于嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1)的角蛋白酶KerSMD进行了异源表达和结构域互换改造，获得了一个热稳定性提高的角蛋白酶突变体P2C2T1(一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法；申请号：CN201410276309.3)。但在大肠杆菌的胞外表达中，胞外催化活力低。为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步提高角蛋白酶的热稳定性和催化效率。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种角蛋白酶突变体，突变体与野生型角蛋白酶相比有更好的热稳定性和/或催化活力。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的角蛋白酶P2C2T1的氨基酸序列的基础上，在C端融合一段SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列而得到的。得到的角蛋白酶突变体命名为DDFD。

在本发明的一种实施方式中，编码角蛋白酶突变体DDFD的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述角蛋白酶突变体的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体是在pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、pAN系列或pUB中的任意一种质粒的基础上构建得到的。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌，是细菌、酵母或者其他真菌。

本发明还要求保护所述角蛋白酶突变体在羽毛降解、饲料添加剂、皮革处理以及纺织工艺等方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明的角蛋白酶突变体DDFD，在50到70℃温度范围内，比酶活大于出发型突变体P2C2T1，最大提升值接近20％。突变体DDFD为最高角蛋白酶比酶活，达到6050U/mg，比出发型突变体P2C2T1增加了2000多个酶活单位。突变体DDFD的半衰期达到146min，是野生型角蛋白酶KerSMD半衰期41min的3.56倍，比出发型突变体P2C2T1的105min增加了41min。本发明的角蛋白酶突变体DDFD比野生型角蛋白酶更具有应用的价值和潜力。

附图说明

图1：突变体的构建示意图；

图2：角蛋白酶P2C2T1及突变体DDFD的大肠杆菌发酵液上清SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，不同泳道名称代表不同的突变蛋白，箭头指示目的蛋白条带位置；

图3：角蛋白酶酶活测定标准曲线；

图4：不同角蛋白酶突变体的大肠杆菌发酵液酶催化活力；

图5：不同角蛋白酶突变体的最适反应温度；

图6：不同角蛋白酶突变体的半衰期和比酶活。

具体实施方式

实施例1：角蛋白酶C端片段融合突变体的构建

以本实验以往专利(CN201410276309.3)中的角蛋白酶突变体P2C2T1为基础，构建片段融合突变体DDFD。角蛋白酶P2C2T1来自于野生型角蛋白酶KerSMD和KerSMF的组合，一级序列示意图如图1所示。角蛋白酶KerSMD中存在独立的C端结构。本发明采用来自角蛋白酶KerSMD的C端结构，将其融合到角蛋白酶突变体P2C2T1的末端，得到片段融合突变体DDFD(图1)。

角蛋白酶C端片段融合突变体DDFD的构建：设计重叠PCR引物(表1)，分别以携带角蛋白酶P2C2T1基因的质粒P2C2T1/pET-22b(+)和携带角蛋白酶KerSMD基因的质粒kerSMD/pET-22b(+)为模板，采用重叠PCR引物进行扩增获得DNA片段，进行核酸电泳和胶回收，将两个片段进行特殊的融合PCR后获得整条基因序列。融合PCR条件步骤：首先，95℃预变性5min；然后进入15个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保温。整个融合PCR溶液体系与一般PCR类似，但是融合PCR不添加引物。得到的融合片段再次进行普通PCR扩增后收集，再进行限制性内切酶NcoI和XhoI的双酶切来获得粘性末端基因，回收该基因并将其和同样粘性末端的质粒pET-22b(+)混合，采用T4DNA连接酶进行室温连接1小时，最后将该混合液转导感受态大肠杆菌E.coli中进行表达，得到蛋白酶突变体DDFD。

表1角蛋白酶片段融合突变体的引物序列

实施例2：角蛋白酶突变体的表达和纯化

挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含80μg/ml氨苄卡那抗生素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含含80μg/ml氨苄卡那抗生素)；大肠杆菌在37℃摇床培养2h，至OD₆₀₀＝1.2左右，加入0.2mM终浓度的IPTG诱导细胞进行胞外表达角蛋白酶，并在20℃摇床继续培养发酵48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心15min除菌体，收集离心发酵上清液，进行SDS-PAGE分析。发现胞外蛋白条带单一，而片段融合体DDFD分子量较大，为48kDa(图2)。

采用AKTAavant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程温度控制为4℃。由于不同角蛋白酶突变体都含有组氨酸标签，所以可以镍离子亲和层析纯化柱进行分离纯化，具体步骤如下：(1)平衡：用5倍体积的50mmol/LpH 7.2Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱；(2)上样：预先处理好的样品以0.5ml/min的流速上样，上样体积一般不超过柱体积的5倍；(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速1.0ml/min，洗脱液为含有300mM咪唑的50mmol/L pH 7.2Tris-HCl缓冲液，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分批收集含角蛋白酶酶活的洗脱液；洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰，后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现，无论是野生型，还是突变体，峰顶收集的酶液为最纯的部分。

实施例3：酶活分析方法

1)酶活测定方法

角蛋白酶酶活力的测定采用福林-酚试剂显色方法测定。角蛋白酶在一定条件下，水解角蛋白底物释放出酪氨酸。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，而角蛋白底物经过水解，释放游离的酪氨酸为酚类物质，发生显色反应，可以在一定范围内其颜色的深浅与酪氨酸的释放量成正比，故可以在660nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义：在上述条件下，以未反应的样品作为空白对照，将每分钟催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸的每毫升酶量定义为一个酶活单位。

酶活力测定步骤：

A.酶解反应：取适当稀释的发酵液上清200μl和含有2％(w/v)角蛋白的Gly-NaOH缓冲液(50mM，pH 9.0)300μl混合均匀，在50℃下反应10分钟后迅速加入500μl 5％(w/v)三氯乙酸溶液终止反应。使用高速离心机离心10分钟去除沉淀，获得酶解反应液上清。

B.显色反应：取200μl酶解上清液到浓度为5％(w/v)的1ml碳酸钠溶液中，混合均匀后再加入200μl福林-酚试剂(上海生工公司)，50℃下反应显色10分钟后以0μg/ml的酪氨酸标准液作为空白对照测定660nm处的吸光度，根据吸光度值对应的酪氨酸浓度标准曲线计算酪氨酸释放量(图3)。

测定角蛋白酶P2C2T1和片段重组突变体DDFD在大肠杆菌异源表达中，发酵液的角蛋白酶催化活力(图4)。

实施例4：角蛋白酶突变体的最适温度和热稳定性

以pH 7.0的Tris-HCl(50mM)为缓冲液，在40到70℃温度范围测定不同角蛋白酶及突变体的最适反应催化温度。如图5所示，最适反应温度都为60℃，片段融合突变体DDFD也有明显的最适催化温度的提升，其在50到70℃温度范围内，酶活百分比大于出发型突变体P2C2T1，其中DDFD在60℃的酶活百分比为110.7％，比出发型突变体P2C2T1增加了10.7％。

将纯化的角蛋白酶和突变体用50mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，且pH为7.0，置于60℃恒温水浴中，每隔20min取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性，如图6所示。以野生型角蛋白酶KerSMD和出发型P2C2T1为比较对象，观察不同突变体的半衰期和比酶活。本发明中的DDFD比酶活提升明显，达到6050U/mg，比出发型P2C2T1增加了2000多个酶活单位；此外，DDFD的半衰期为150min左右，较P2C2T1提高了45min左右。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。