本发明涉及一种PCR模板的制备方法，具体涉及一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，尤其是应用于转基因烟草叶片组织。
背景技术：
：：烟草(Nicotianatabacum)目前是国内一种重要的经济作物。培育优质、低害、抗病抗逆、适产的烟草品种是目前烟草育种的主要目标。随着分子生物学的快速发展和转基因技术的逐渐成熟，转基因技术已成为烟草育种的重要方法。近年来，随着Crispr-Cas9技术的发展，在烟草基因组中定点突变一个或多个基因甚至是整个基因家族成为可能。该技术能够对目标性状进行精确改良，通过筛选得到稳定表达转基因株系，不仅能够缩短作物的育种周期，还能够解决传统育种方法不易解决的问题，如有害性状与优良性状的紧密连锁不易打破分离。这给烟草的转基因育种带来了新的机遇。随着分子生物学的迅速发展，生物技术的研究领域逐渐拓展到生物科学的各个方面，核酸水平的研究是分子生物学研究的重要内容，PCR技术作为研究核酸的主要工具，在分子生物学领域扮演着越来越重要的角色。在植物研究领域诸如突变体的鉴定，转基因植株的鉴定，基因扩增等均需要利用到PCR技术，PCR扩增技术需要DNA作为模板。针对于烟草等作物的检验，为了降低假阳性的存在，在抗性培养基上长出的转基因苗还需进行进一步的检验。目前，多采用简便快捷，灵敏度高的PCR方法进行这一检测。而要进行PCR检测则首先需对被检测样品进行DNA提取。目前，在众多植物种类中应用最广泛的提取DNA的方法是采用商业化的试剂盒或是基于CTAB/SDS裂解后的酚即氯仿抽提法或者是由此为基础衍生而来的改良法。然而，这些方法都需要在液氮或是冷冻干燥条件下将样品粉碎，紧接而来的是很多繁琐的步骤进行DNA的纯化。这些方法不仅用到很多有害试剂和昂贵的试剂仪器，并且用到的植物组织多，步骤繁琐费时，因此当需要检测的转基因植株较多时，这些方法显得不太适用。在植物领域也有一些快速提取DNA的方法报道。然而，所有这些建立在碱液裂解基础上的快速提取方法模板在进行PCR之前都需要进行加热/煮沸或者加入中和液(TE或者Tris-HCl)进行中和。这一些额外的步骤显然会增加样品之间的交叉污染，样品多时也会耗费大量时间。技术实现要素：根据以上现有技术的不足，本发明提供一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，该方法使用仪器少，样品消耗少，快速、简便、成本低，没有交叉污染，能够在短时间内处理大量样品。本发明所述的一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征在于：以NaOH溶液为提取液，将提取液与植物叶片组织放入到离心管中，直接在磨样机上磨样，得到的上清液直接作为模板进行PCR反应。其中优选方案如下：所述的NaOH溶液的摩尔浓度为0.01mol/L～0.1mol/L，更优选为0.01mol/L。所述的磨样机的工作转速频率为20～25Hz，磨样时间为1.5～3min，更优选为工作转速频率23Hz，磨样时间2min。综上所述，本发明可以按照以下步骤进行：将直径0.25mm的钢珠和250μL摩尔浓度为0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的离心管中，再取8～12mm2植物叶片组织放入，然后在磨样机上以23Hz频率磨样2分钟，取1μL上清液即可直接作为模板进行PCR反应。应用本发明制备方法得到的模板进行PCR扩增程序：PCR扩增体系采用20μL反应体系，包括2×PCRMix10μL，前引物和后引物各6pmol，DNA模板1μL，用ddH2O补齐体积。PCR扩增程序如下：94℃条件下预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；最后72℃延伸10min。取6μLPCR产物在150V电压，1.5％琼脂糖凝胶中电泳15min检测扩增情况。凝胶用EB进行染色，凝胶成像系统拍照分析。本发明所具有的优点在于：(1)建立了一种快速高效的制备转基因烟草样品DNA的方法，此方法采用0.01mol/L的NaOH溶液为提取液，破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤，上清液可直接用作PCR反应的模板；(2)用此方法制备的DNA模板PCR扩增结果稳定、准确、重复性好，与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比，PCR结果没有明显差异；(3)该方法还可以应用于小麦、高粱、水稻、玉米等作物上，同样取得了很好的实验效果；(4)该方法使用仪器少，样品消耗少，快速、简便、成本低，没有交叉污染，能够在短时间内处理大量样品，因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。附图说明图1为实施例1中采用不同浓度NaOH溶液制备DNA模板进行PCR扩增的电泳分析图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：1mol/LNaOH溶液；2：0.5mol/LNaOH溶液；3：0.25mol/LNaOH溶液；4：0.1mol/LNaOH溶液；5：0.05mol/LNaOH溶液；6：0.01mol/LNaOH溶液；7：0.001mol/LNaOH溶液)；图2为实施例3中采用不同品牌PCRMix进行PCR扩增的电泳分析图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：全式金AS111PCRMix；2：ThermoScientificK1081PCRMix；3：擎科梓熙TSE004PCRMix；4：MDBioP002PCRMix；A：引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S扩增结果；B：引物Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR扩增结果)；图3为实施例4中采用不同DNA提取方法进行PCR扩增的电泳分析比较图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR扩增结果；2：Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR扩增结果；3：Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR扩增结果；4：Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR扩增结果；A：SDS方法提取DNA模板；B：实施例2方法提取DNA模板)；图4为实施例5中通过Crispr-Cas9技术编辑的烟草木糖基转移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的阳性植株进行PCR扩增的电泳分析图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1-2：非转基因K326对照；3-6：Crispr-Cas9载体阳性但gDNA未编辑植株；7-8：Crispr-Cas9载体阳性且gDNA编辑植株，A：Crispr-Cas9技术编辑Ntab0067020基因植株；B：Crispr-Cas9技术编辑Ntab0104030基因植株)；图5为实施例5中A1，A3，A7，A8植株的测序结果(图中黑色阴影显示的为Crispr-Cas9技术编辑的基因靶点序列)；图6为实施例5中B1，B3，B7，B8植株的测序结果(图中黑色阴影显示的为Crispr-Cas9技术编辑的基因靶点序列)；图7为实施例6中不同作物应用不同DNA提取方法进行PCR扩增的电泳分析比较图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：小麦；2：高粱；3：烟草；4：棉花；5：水稻；6：玉米，A：试剂盒法提取DNA；B：实施例2所述的方法提取DNA)。具体实施方式以下结合实施例和附图对本发明做进一步说明。以下实施例中所用到的引物说明：实施例1：针对NaOH提取液适宜浓度筛选试验：如图1所示，0.01mol/L到0.1mol/L之间的NaOH溶液制备的DNA模板均能扩增出条带，说明NaOH溶液粗提物可以直接作为PCR反应的模板。0.001mol/L的NaOH溶液提取的模板虽然也能扩增出条带，但条带亮度较弱，而高于0.25mol/L(包含0.25mol/L)的NaOH溶液制备的DNA模板则不能扩增出条带。从扩增效果和节约试剂的角度最终选择0.01mol/L的NaOH溶液作为提取液进行实验。实施例2：一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，将直径0.25mm的钢珠和250μL摩尔浓度为0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的离心管中，再取10mm2左右的植物叶片组织放入，然后在磨样机上以23Hz频率磨样2分钟，取1μL上清液即可直接作为模板进行PCR反应。根据此方法，应用于实施例3～6中。实施例3：采用不同品牌PCRMix扩增结果：如图2所示，常用的4种不同品牌PCRMix对0.01MNaOH浓度制备的模板用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR进行扩增，4种PCRMix均能扩增出明亮单一的条带，扩增结果之间没有明显的差异。实施例4：不同DNA提取方法扩增结果比较：对用传统SDS方法提取的DNA作为模板和实施例2所述方法提取的DNA模板进行PCR扩增的结果进行比较。如图3所示，4个糖基转移酶基因特异引物Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR，Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR，Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在SDS法和实施例2所述方法提取的DNA模板上进行扩增均能扩增出条带清晰，明亮的条带。两种方法制备的模板PCR扩增结果没有显著差异。实施例5：在鉴定烟草转基因植株上的应用：对实验室已经确认的两个通过Crispr-Cas9技术编辑的烟草木糖基转移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的阳性植株在编辑位点附近设计了两个基因的特异引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用实施例2所述的方法获得模板进行PCR扩增、测序验证。如图4所示，引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在对照和转基因植株上均能扩增出明亮单一的条带。对PCR产物直接进行测序，测序结果如图5、图6所示，以A1，A3，A7，A8和B1，B3，B7，B8植株的测序结果为例：A3和B3植株为已知转入Crispr-Cas9载体但未能在基因组上成功编辑的植株，基因特异引物扩增测序结果分别与对照A1和B1一致；而A7，A8和B7，B8是在基因组上成功编辑的植株，可以看到在这4株植株上扩增的片段在各自的靶位点上都进行了编辑，存在碱基的插入/缺失，与之前的鉴定结果一致。说明本方法提取的DNA模板可以用来对通过Crispr-Cas技术编辑的转基因植株进行阳性苗的鉴定。实施例6：在其他作物上的应用：如图7所示，对小麦、高粱、烟草、棉花、水稻及玉米等作物的幼叶用试剂盒及实施例2所述方法制备的模板进行ACTIN基因的扩增。结果表明，通过试剂盒方法制备的模板能在5种作物上扩出条带，而通过实施例2所述方法制备的模板在棉花中的扩增失败，但在其他4种作物上均能够扩增出条带，且与试剂盒扩增的效果基本一致，在烟草和水稻中甚至能扩增出长达1.5kb的片段。综和上述所有实施例所述，本方法可以适用于大量转基因烟草阳性株的鉴定工作，节约时间成本。建立的DNA提取方法简单快速，粗提上清液可以直接用来作为PCR反应的模板，能够有效的对烟草转基因植株进行鉴定。利用此方法进行DNA模板制备，一个工作人员在一个小时之内就可以提取至少600个样品，提高了工作效率。此方法与之前建立的很多一步法碱裂解DNA提取方法相比，最大的改进是上清液不经加热或中和就可以直接用来作为模板，这样尽最大的可能节省了时间、降低了费用并且还能有效的避免不同样品之间的交叉污染。另外，此方法只利用大约10mm2的植物材料就可以提取足够200次PCR反应的模板溶液，大大减少了对植物材料的浪费。因此，筛选可以在植株生长的早期进行，加速实验进程。虽然传统的SDS提取法和试剂盒提取的DNA量多质优，但是PCR技术对DNA质量的要求并不高，只需要一点模板的存在就可以成功扩增。本方法的实验结果证明了此方法提取的DNA在烟草及其他作物如小麦、高粱、玉米中能够稳定的扩增，实验结果可靠、稳定，在烟草和水稻中甚至能扩增出长达1.5kb长的片段。因此，此方法可以在这些作物中得到广泛的应用。但是用此方法制备的模板却不能在棉花中成功扩增。文献(XinZ，VeltenJP，OliverMJ，etal.High-throughputDNAextractionmethodsuitableforPCR[J].Biotechniques，2003，34(4)：820-827.)在快速法(有碱提取液煮沸中和的步骤)提取扩增实验中也得到了类似的结果，烟草和高粱组织制备模板后在PCR混合体系中加与不加杂质抑制剂BSA和PVP都能扩增出条带，但是棉花组织却必须加入BSA和PVP才能够成功扩增。文献(BurrK，HarperR，LinacreA.One-stepisolationofplantDNAsuitableforPCRamplification[J].Plantmolecularbiologyreporter，2001，19(4)：367-371.)报道超过1mm2的植物材料进行粗提时，其中的叶绿素等杂质会抑制PCR反应，或许棉花叶片组织中的一些物质能够抑制TaqDNA聚合酶的活性，从而影响扩增效果。本方法采用的NaOH法制备PCR扩增模板不需要液氮、不需要昂贵的仪器、无需离心、无需更换离心管、没有加热煮沸中和等步骤，粗提物可直接用作PCR反应的模板。进行大量样品DNA模板制备时能够在最大程度上节省时间和实验花费并减少样品之间的交叉污染。此方法用来检测转基因烟草阳性株，实验结果准确，稳定，重复性好。此外，此方法的所有步骤都在室温操作并且10mm2左右的叶子制备的DNA模板就足够200余次PCR反应使用，可减少对样品的浪费并在植株生长早期即可进行检测，加速实验进程。当前第1页1 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