一种提高烟草叶片中芦丁含量基因NtFLS2的克隆方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种提高烟草叶片中芦丁含量基因NtFLS2的克隆方法，包括以下步骤：A、用TRIzol提取烟草叶片和花的总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；B、以cDNA第一链作为模板，利用引物进行PCR扩增；C、目的基因片段连接到pTOPO载体进行测序。本发明还公开了提高烟草叶片中芦丁含量基因NtFLS2的应用。本发明NtFLS2基因的克隆，该基因资源的开发利用为烟草叶片工业化提取芦丁奠定了基础；本发明的转基因烟草植株，经功能验证，表明本发明克隆的NtFLS2基因具有提高烟草叶片中芦丁含量的功能。
【专利说明】
一种提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法及应用。
【背景技术】
[0002] 芦丁，类黄酮途径的代谢产物之一，在医药和生物农药中有着极其重要的应用。由 于其强大的抗氧化能力，芦丁具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗哮喘属性。芦丁还作为稳定剂、防 腐剂、天然着色剂在制药、营养食品和药用化妆品行业有广泛的应用。但芦丁在植物中的积 累较少，难以满足工业生产的要求。利用基因工程手段在植物中增加芦丁积累，是解决芦丁 含量较少的有效策略。
[0003] 芦丁合成是类黄酮代谢的分支途径，其合成以香豆酰CoA和丙二酰CoA为前体， 在查尔酮合酶(Chalcone synthase, CHS)的作用下形成黄色的查尔酮，这一步是类黄酮合 成途径的第一个限速步骤。然后由查尔酮异构酶(〇^1(301161801116^86，〇11)催化查尔酮生 成无色的柚皮素，柚皮素经黄酮醇-3-轻化酶(Flavanone 3- hydroxylase, F3H)催化，生 成二氢山奈酚类(DHK)，DHK随后分别形成二氢槲皮素(DHQ)和二氢杨梅素(DHM)。上述三个 二氢黄酮醇类化合物可在二氢黄酮醇还原酶(DFR)催化进入花青素合成途径，最终产生花 翠素(Delphindin)、矢车菊素(Cyanidin)和花葵素(Pelargonidin);也可通过黄酮醇合 成酶(Flavonol synthase，FLS)作用进入黄酮醇合成途径，产生山奈酸、槲皮素和杨梅素， 槲皮素通过两步糖基化反应即可生成芦丁。
[0004] 因此，研发一种提高烟草叶片中芦丁含量的候选基因，增强其黄酮醇分支途径代 谢流，进而提高烟草叶片中芦丁含量是非常必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆 方法;本发明的第二目的在于提供所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的应用。
[0006] 本发明的第一目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的 克隆方法，包括以下步骤： A、 用TRIzol提取烟草叶片和花的总RNA，然后反转录获得cDNA第一链； B、 以cDNA第一链作为模板，利用引物进行PCR扩增； C、 目的基因片段连接到pTOPO载体进行测序； 本发明的第二目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的应 用，包括如下步骤： (1)制备植物表达载体 用BamHI和Xhol双酶切pTOPO- NtFLS2和pENTR?2B，分别回收得到目的片段NtFLS2和 载体片段pENTR?2B;用T4 DNA Ligase连接后得到入门载体pENTR?2B- NtFLS2,与目的载 体PK2GW7通过LR反应得到植物表达载体pK2-NtFLS2。
[0007] (2)制备含有植物表达载体的根癌农杆菌菌株： 取0.5~2 μL重组质粒pK2-NtFLS2,加入到50 μL冰上解冻的农杆菌C58C1菌株感受态细 胞，轻柔混匀，冰浴5 min，并在液氮中迅速冷冻5 min，然后37°C水浴5 min，加入1 ml LB液 体培养基，28°C 210 rpm培养3.5 h，7500 rpm离心弃部分上清，留100 ul重悬浮菌体，将菌 液涂布到含有50 μg/ml的利福霉素和100 μg/ml的壮观霉素的LB固体平板，28°C培养2~3 d，至平板长出单菌落； (3)制备转基因烟草植株： 挑取农杆菌菌株接种于50ml的含Spe 100 ug/mL的LB培养基中，180 rpm，28°C培养24 h，菌液0D600至1.0，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，再用10ml的MS液体培养基悬浮，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，重复以上操作2~3次，最后用加入一定体积的MS液体培养基重 悬浮，使菌体的0D600值为0.5,选取无菌苗或消毒苗的烟草叶片，在制备好的农杆菌菌液中 浸染15~20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于MS培养基上黑暗共培养2天，将外植体转移至 含抗生素的芽诱导培养基上进行筛选，约15天继代一次，待有芽生成后，转入含抗生素的生 根培养基MS上，进行根诱导生长，得到转基因烟草植株。
[0008] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果： 1、 NtFLS2基因的克隆，该基因资源的开发利用为烟草叶片工业化提取芦丁奠定了基 础； 2、 本发明的转基因烟草植株，经功能验证，表明本发明克隆的NtFLS2基因具有提高烟 草叶片中芦丁含量的功能。
【附图说明】
[0009] 图1为NtFLS2基因扩增及中间载体pTOPO- NtFLS2酶切电泳图； 图2为入门克隆pENTR?2B-NtFLS2的酶切电泳图； 图3为植物表达载体pK2-NtFLS2的PCR检测电泳图； 图4为转基因烟草表型； 图5为T0代转基因烟草中NtFLS2基因表达水平分析； 图6为T1代转基因烟草中NtFLS2基因表达水平分析； 图7为转基因烟草叶片芦丁含量检测结果。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基 于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0011] 如附图1~图7所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，包括以下 步骤： A、 用TRIzol提取烟草叶片和花的总RNA，然后反转录获得cDNA第一链； B、 以cDNA第一链作为模板，利用引物进行PCR扩增； C、 目的基因片段连接到pTOPO载体进行测序。
[0012] 所述的基因核苷酸序列如SEQ ID:No.l所示。
[0013] 所述的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。
[0014] 所述的步骤B中引物的序列为： NtFLS2_BamHI：GGATCCATGAAAACAGCTGAAGCTCA； NtFLS2_XhoI：CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAA〇
[0015] 所述的步骤B中PCR扩增的反应条件为98°C预变性30s;98°C变性10s，56°C退火 30s，72°C延伸2min，共30个循环；最后72°C延伸7min。
[0016] 所述的步骤B中PCR扩增采用高保真DNA聚合酶。
[0017] 所述的步骤A中cDNA第一链是使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect real Time)试剂盒进行合成。
[0018] 所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的应用，其特征在于包括以下步骤： (1)制备植物表达载体 用BamHI和Xhol双酶切pTOPO- NtFLS2和pENTR?2B，分别回收得到目的片段NtFLS2和 载体片段pENTR?2B;用T4 DNA Ligase连接后得到入门载体pENTR?2B- NtFLS2,与目的载 体PK2GW7通过LR反应得到植物表达载体pK2-NtFLS2。
[0019] (2)制备含有植物表达载体的根癌农杆菌菌株： 取0.5~2 μL重组质粒pK2-NtFLS2,加入到50 μL冰上解冻的农杆菌C58C1菌株感受态细 胞，轻柔混匀，冰浴5 min，并在液氮中迅速冷冻5 min，然后37°C水浴5 min，加入1 ml LB液 体培养基，28°C 210 rpm培养3.5 h，7500 rpm离心弃部分上清，留100 ul重悬浮菌体，将菌 液涂布到含有50 μg/ml的利福霉素和100 μg/ml的壮观霉素的LB固体平板，28°C培养2~3 d，至平板长出单菌落； (3)制备转基因烟草植株： 挑取农杆菌菌株接种于50ml的含Spe 100 ug/mL的LB培养基中，180 rpm，28°C培养24 h，菌液0D600至1.0，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，再用10ml的MS液体培养基悬浮，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，重复以上操作2~3次，最后用加入一定体积的MS液体培养基重 悬浮，使菌体的0D600值为0.5。选取无菌苗或消毒苗的烟草叶片，在制备好的农杆菌菌液中 浸染15~20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于MS培养基上黑暗共培养2天，将外植体转移至 含抗生素的芽诱导培养基上进行筛选，约15天继代一次，待有芽生成后，转入含抗生素的生 根培养基MS上，进行根诱导生长，得到转基因烟草植株。
[0020] 所述的步骤（1)中感受态细胞是先挑起农杆菌单菌落接种于5 ml液体LB培养基， 28°C、200~250 rpm震荡培养至0D600为0.5,再按1:10的比例转接到50 ml新鲜液体培养基 中扩大培养，28°C、200~250 rpm震荡培养至0D600为0.5,冰浴30 min，5000 rpm离心5 min 弃上清，20 mM的10 ml CaCl2重悬浮菌体，5000 rpm离心5 min，加20 mM的350 μL CaCl2悬 浮菌体，再加150 μL 50%的灭菌甘油，混匀，分装100 μL/管得到，所述的感受态细胞于-80 °C保存。
[0021] 实施例1:基因 NtFLS2的克隆 (1)烟草总RNA提取 取约lg烟草叶片，在液氮中研磨成粉末;挑取少许粉末转移到1.5mL EP管中，并加入 lmL Trizol，剧烈震荡使细胞裂解完全，与Trizol充分混匀后静置lOmin;在EP管中加入氯 仿0.25mL，用力振荡15s，室温静置10min;静置后，于4 °C 12000rpm/min离心20min;吸取上层 无色液体400yL，加入等体积异丙醇500yL混勾；于4°C 12000rpm/min离心10min;吸弃上清， 沉淀加入75%乙醇（无水乙醇+ RNase free water)lmL，吹起沉淀；于4°C 7500rpm/min离心 lOmin;小心吸弃上清，注意不要把沉淀的RNA弃除，将EP管置于超净工作台中静置鼓风干燥 lOmin;加入35yL RNase free water于EP管中溶解沉淀，于_80°C冰箱中保存； (2) cDNA第一链合成 使用TaKaRa公司的 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect real Time)试剂盒进行模板cDNA的合成。
[0022] 表1去除基因组DNA
表2反转录反应
(3) NtFLS2基因扩增及载体构建 反转录获得cDNA第一链作为模板扩增目的基因 NtFLS2(图1A)，引物序列为： NtFLS2_BamHI：GGATCCATGAAAACAGCTGAAGCTCA； NtFLS2_XhoI：CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAA〇
[0023] PCR米用高保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，NEB)，PCR 反应条件为98°C预变性30s; 98°C变性10s，56°C退火30s，72°C延伸2min，共30个循环；最后 72°C 延伸 7min。
[0024] 目的基因片段连接到pTOPO载体进行测序（图IB)。
[0025] 实施例2:制备植物表达载体pK2-NtFLS2 用BamHI和Xhol双酶切pTOPO- NtFLS2和pENTR?2B，分别回收得到目的片段NtFLS2和 载体片段pENTR?2B，利用T4 DNA Ligase连接后得到入门载体pENTR?2B- NtFLS2(图2)，与 目的载体PK2GW7通过LR反应得到植物表达载体pK2-NtFLS2(图3)。
[0026]实施例3:制备含有植物表达载体pK2-NtFLS2的根癌农杆菌菌株 挑起农杆菌单菌落接种于5 ml液体LB培养基，28°C，250 rpm震荡培养至0D600为0.5， 按1:10的比例转接到50 ml新鲜液体培养基中扩大培养，28°C，250 rpm震荡培养至0D600为 0.5。冰浴30 min，5000 rpm离心5 min弃上清，10 ml CaCl2(20 mM)重悬浮菌体，再次离心， 加350 μL CaCl2(20 mM)悬浮菌体，再加150 μL 50%的灭菌甘油，混勾，分装100 μL/管，感 受态细胞于_80°C保存。
[0027] 取0.5-2 μL重组质粒pK2-NtFLS2,加入到50 μL冰上解冻的农杆菌C58C1菌株感受 态细胞，轻柔混勾，冰浴5 min，并在液氮中迅速冷冻5 min，随之37 °C水浴5 min，加入1 ml LB液体培养基，28°C 210 rpm培养3.5 h，7500 rpm离心弃部分上清，留100 ul重悬浮菌体， 将菌液涂布到含有501^/1111的利福霉素(1^〇+1001^/1111的壮观霉素(5? 6)的1^固体平板， 28 °C培养3d，至平板长出单菌落。
[0028]实施例4:制备转基因烟草植株 挑取农杆菌菌株接种于50 ml的LB培养基中（含Spe 100此/1^)，180 rpm，28°C培养24 h，菌液0D600至1.0，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体。再用10ml的MS液体培养基悬浮，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体。重复以上操作2~3次。最后用加入一定体积的MS液体培养基重 悬浮，使菌体的0D600值为0.5。选取烟草叶片，在制备好的农杆菌菌液中浸染15 - 20 min， 用无菌吸水纸吸干后，平铺于MS培养基上黑暗共培养2天，将外植体转移至含抗生素的芽诱 导培养基上进行筛选，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含抗生素的生根培养基MS上， 进行根诱导生长。无菌苗移栽至温室，采用正常农艺栽培措施管理，观察表型，结果如图4。 [0029]实施例5:转基因烟草筛选 提取转基因烟草叶片总RNA，反转录获得cDNA第一链。采用SYBR Green法对NtFLS2基因 进行荧光实时定量PCR(qRT-PCR)分析，定量引物为： NtFLS2_q_F：AAAACTCCAGGGTCTCAG； NtFLS2_q_R：CTGTAGGAGGGAGGATTT 〇
[0030] 植物表达载体中目标基因的表达受到CaMV 35S启动子组成型驱动。由图5可知，TO 代转基因植株的qRT-PCR分析结果表明大部分植株的NtFLS2基因表达水平与对照相比显著 提高，最高可达43.6倍，选择0E4和0E28两个株系进行后续试验。收集T1代种子并在抗性培 养基中进行筛选获得抗性幼苗，移栽至温室中种植，成熟期采集叶片进行基因表达水平分 析，由图6可知，结果表明0E4和0E28分别是对照表达水平的6.9和56.7倍。
[0031] 实施例6:转基因烟草芦丁含量检测 转基因及对照烟草成熟期采集固定叶位的叶片液氮中研磨成粉末，冷冻干燥后，称量 20 mg干样加入3 ml 75%的甲醇研磨，超声波处理30 min，10000 rpm离心10 min，取lml上 清转移到10 ml管，然后，加1 ml水和2 ml氯仿去除叶绿素。旋转震荡混合物1 min，10 000 rpm离心10 min，收集上层溶液用于分析。
[0032] 米用Waters ACQUITY UPLC system(Waters)结合AB Sciex Triple Quad 5500质 谱仪分析烟草叶和花中的类黄酮含量，色谱柱使用Waters BEH C18 column(150 X 2.1 mm i .d.，1.7 um particle sizes, Waters Corporation)，柱子温度设为3CTC，进样量为 ΙμL，溶剂A和B分别是水和乙腈，甲酸(0.1%，v/v)和0.2 mmol/L的乙酸铵分别加入溶剂A 和B以促进色谱分离，洗脱液梯度设为10%溶剂B lmin，10-90%溶剂B 8min，90-100%溶剂B 2min。总运行时间为13min，其中包括2min平衡时间。液相色谱洗脱液直接以流速0.2 ml/ min引进ESI接口，结合正负电离模式分析类黄酮。20,30, 40, and 50 V的碰撞能用于MS2 破碎。气帘40 psi;碰撞气6 psi;离子喷雾电压±4000 V;温度700°C;离子源气体1，60 psi ;离子源气体2,50 psi。在破碎实验中氦气作为碰撞气。
[0033]由图7可知，转基因株系（0E4和0E28)中芦丁含量分别是对照4.4倍和3.5倍，表明 过表达NtFLS2基因可显著提高烟草叶片中芦丁积累。
【主权项】
1. 一种提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤： A、 用TRIzol提取烟草叶片和花的总RNA，然后反转录获得cDNA第一链； B、 以cDNA第一链作为模板，利用引物进行PCR扩增； C、 目的基因片段连接到pTOPO载体进行测序。2. 根据权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在 于所述的基因核苷酸序列如SEQ ID:No.l所示。3. 根据权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在 于所述的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。4. 根据权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在 于步骤B中所述的引物的序列为： NtFLS2_BamHI：GGATCCATGAAAACAGCTGAAGCTCA； NtFLS2_XhoI：CTCGAGTCACTGAGGAAGCTTGTTAA〇5. 根据权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在 于步骤B中所述的PCR扩增的反应条件为98°C预变性30s;98°C变性10s，56°C退火30s，72°C 延伸2min，共30个循环;最后72°C延伸7min。6. 根据权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在 于步骤B中所述的PCR扩增采用高保真DNA聚合酶。7. 根据权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的克隆方法，其特征在 于步骤A中所述的cDNA第一链是使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect real Time)试剂盒进行合成。8. -种权利要求1所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的应用，其特征在于包 括以下步骤： (1) 制备植物表达载体 用BamHI和Xhol双酶切pTOPO- NtFLS2和pENTR?2B，分别回收得到目的片段NtFLS2和 载体片段pENTR?2B;用T4 DNA Ligase连接后得到入门载体pENTR?2B- NtFLS2,与目的载 体PK2GW7通过LR反应得到植物表达载体pK2-NtFLS2; (2) 制备含有植物表达载体的根癌农杆菌菌株： 取0.5~2 μL重组质粒pK2-NtFLS2,加入到50 μL冰上解冻的农杆菌C58C1菌株感受态细 胞，轻柔混匀，冰浴5 min，并在液氮中迅速冷冻5 min，然后37°C水浴5 min，加入1 ml LB液 体培养基，28°C 210 rpm培养3.5 h，7500 rpm离心弃部分上清，留100 ul重悬浮菌体，将菌 液涂布到含有50 μg/ml的利福霉素和100 μg/ml的壮观霉素的LB固体平板，28°C培养2~3 d，至平板长出单菌落； (3) 制备转基因烟草植株： 挑取农杆菌菌株接种于50ml的含Spe 100 ug/mL的LB培养基中，180 rpm，28°C培养24 h，菌液0D600至1.0，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，再用10ml的MS液体培养基悬浮，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体，重复以上操作2~3次，最后用加入一定体积的MS液体培养基重 悬浮，使菌体的0D600值为0.5,选取无菌苗或消毒苗的烟草叶片，在制备好的农杆菌菌液中 浸染15~20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于MS培养基上黑暗共培养2天，将外植体转移至 含抗生素的芽诱导培养基上进行筛选，约15天继代一次，待有芽生成后，转入含抗生素的生 根培养基MS上，进行根诱导生长，得到转基因烟草植株。9.根据权利要求8所述的提高烟草叶片中芦丁含量基因 NtFLS2的应用，其特征在于步 骤（1)中所述的感受态细胞是先挑起农杆菌单菌落接种于5 ml液体LB培养基，28°C、200~ 250 rpm震荡培养至0D600为0.5,再按1:10的比例转接到50 ml新鲜液体培养基中扩大培 养，28°C、200~250 rpm震荡培养至0D600为0.5,冰浴30 min，5000 rpm离心5 min弃上清，20 mM的10 ml CaCl2重悬浮菌体，5000 rpm离心5 min，加 20 mM的350 μL CaCl2悬浮菌体，再加 150 μL 50%的灭菌甘油，混匀，分装100 μL/管得到，所述的感受态细胞于-80°C保存。
【文档编号】C12N9/02GK106086006SQ201610758645
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月30日
【发明人】宋中邦, 李文正, 王丙武, 高玉龙, 师君丽
【申请人】云南省烟草农业科学研究院