本发明涉及一种生物制备方法，尤其涉及一种家畜腔前卵泡体外培养液及其制备方法。
背景技术：
细胞培养技术是生物学研究的最基本技术，它的成功，为研究细胞体外增殖与分化、细胞存活与凋亡、基因表达与调控等提供了绝好的研究模型，然而，目前的细胞体外培养与研究，多集中于单一细胞种类，对研究单一细胞功能与作用机制有不可替代的好处。但在体外培养由多种类型细胞组成的有机体组织，以及体外培养时，不同细胞之间的相互作用机制研究，还没有取得理想的进展。卵巢卵泡是由卵泡膜细胞、颗粒细胞和卵母细胞共同组成，卵泡的生长发育是三种细胞相互作用与协调的结果，卵泡的体外培养对研究雄激素、雌激素与孕酮等类固醇激素的合成与分泌、卵泡生长机制与卵泡腔的形成原理，卵母细胞成熟与黄体化等方面都是一个很好的模型。
卵巢卵泡的发育与成熟是一个高度复杂的过程，涉及到动物下丘脑、垂体与卵巢的相互协调和卵泡各细胞间的多向交流，尽管研究已经表明许多因素都可以调节卵泡的发育，但是，这些因子调控卵泡成熟的具体作用机制还不清楚。另外，在体外受精过程中，由于科学家直接从卵巢上获取的健康优质卵子的数量有限，因此，如何培养卵泡从而获取高质量的卵母细胞是摆在科学家面前的首要问题。卵泡体外培养技术的成功，无论是在基础研究还是在兽医临床方面都有广阔的应用前景。通过体外培养家畜的卵泡，可以为高产动物提供繁殖保障、对建立母源基因的“卵子库”、研究卵泡发生与凋亡的生理病理过程和保种与商业化生产有重要意义。
α-亚麻酸是多不饱和脂肪酸(n-3)的一种，也是动物必须的营养元素之一。多不饱和脂肪酸作为一种调节剂，可能是作为类固醇激素和前列腺素的前体，在动物繁殖活动的多个环节发挥重要作用。通过在日粮中添加α-亚麻酸可以促进牛、羊卵巢上小型和中型卵泡的数量增加，同时，饲喂不同的不饱和脂肪酸对增加体外培养的牛卵母细胞质量，提高其受精率，早期胚胎的卵裂率和胚胎质量有明显的促进作用。然而，α-亚麻酸对体外培养的卵泡存活与发育情况还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种家畜腔前卵泡体外培养液及其制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明一种家畜腔前卵泡体外培养液，所述培养液为α-亚麻酸，α-亚麻酸在每1mL常规培养液中的添加量为100～200μg，所述常规培养液由100mLα-MEM溶液、1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，500μg牛血清白蛋白，100ng海藻酸钠，500IU FSH，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素组成。
一种家畜腔前卵泡体外培养液的制备方法，包括以下步骤：
1)取1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基础培养液；
2)取500μg牛血清白蛋白溶于基础培养液中，缓慢混匀，避免泡沫产生，配制成Ⅰ液；
3)取10mg海藻酸钠溶于10ml DMSO中，缓慢混匀，吸取100μL混匀后的溶液，加入Ⅰ液中，缓慢混匀，配制成Ⅱ液；
4)取10～20mgα-亚麻酸缓慢溶于10ml DMSO中，缓慢混匀，吸取100μL混匀后的溶液，加入Ⅱ液中，缓慢混匀，配制成工作液；
5)调节工作液pH值＝7.0～7.1，过滤灭菌，放入4℃冰箱中保存备用；
6)取500IU FSH加入100mL备用的工作液中，进行卵泡体外培养。
一种家畜腔前卵泡体外培方法，包括以下步骤：
(A)从屠宰场获取牛卵巢，在灭菌的生理盐水(温度30～35℃)中，尽快送到实验室，70％的酒精消毒灭菌后用30～35℃的生理盐水将卵巢上残留的酒精冲洗干净；
(B)取出4℃冰箱中保存的卵泡培养工作液，在37℃水浴锅中预热，备用；
(C)将步骤(A)中的卵巢用手术刀片切成1cm×0.5cm×0.2cm的薄片，然后用灭菌的生理盐水冲洗1～2次，放入表面皿中；
(D)在立体显微镜下，用25G针头挑出家畜腔前卵泡，选择直径在160～220μm的腔前卵泡备用；
(E)将选择的腔前卵泡放入24孔培养盘中，按照1ml/孔加入预热的培养液进行单卵泡培养；
(F)间隔24小时更换70％培养液；
(G)利用带刻度的显微镜每天检测卵泡直径，观察卵泡腔的变化。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种家畜腔前卵泡体外培养液及其制备方法，与现有技术相比，本发明首次将α-亚麻酸家畜卵巢腔前卵泡的体外培养，效果可靠，易于推广，适用于家畜腔前卵泡的体外培养，可显著提高体外培养家畜腔前卵泡的体外存活率。
附图说明
图1是本发明的体外培养的牛腔前卵泡。
图中：A：培养第1天；B：培养第5天；C：培养第12天；D培养第18天。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
本发明一种家畜腔前卵泡体外培养液，所述培养液为α-亚麻酸，α-亚麻酸在每1mL常规培养液中的添加量为100～200μg，所述常规培养液由100mLα-MEM溶液、1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，500μg牛血清白蛋白，100ng海藻酸钠，500IU FSH，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素组成。
一种家畜腔前卵泡体外培养液的制备方法，包括以下步骤：
1)取1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基础培养液；
2)取500μg牛血清白蛋白溶于基础培养液中，缓慢混匀，避免泡沫产生，配制成Ⅰ液；
3)取10mg海藻酸钠溶于10ml DMSO中，缓慢混匀，吸取100μL混匀后的溶液，加入Ⅰ液中，缓慢混匀，配制成Ⅱ液；
4)取10～20mgα-亚麻酸缓慢溶于10ml DMSO中，缓慢混匀，吸取100μL混匀后的溶液，加入Ⅱ液中，缓慢混匀，配制成工作液；
5)调节工作液pH值＝7.0～7.1，过滤灭菌，放入4℃冰箱中保存备用；
6)取500IU FSH加入100mL备用的工作液中，进行卵泡体外培养。
一种家畜腔前卵泡体外培方法，包括以下步骤：
(A)从屠宰场获取牛卵巢，在灭菌的生理盐水(温度30～35℃)中，尽快送到实验室，70％的酒精消毒灭菌后用30～35℃的生理盐水将卵巢上残留的酒精冲洗干净；
(B)取出4℃冰箱中保存的卵泡培养工作液，在37℃水浴锅中预热，备用；
(C)将步骤(A)中的卵巢用手术刀片切成1cm×0.5cm×0.2cm的薄片，然后用灭菌的生理盐水冲洗1～2次，放入表面皿中；
(D)在立体显微镜下，用25G针头挑出家畜腔前卵泡，选择直径在160～220μm的腔前卵泡备用；
(E)将选择的腔前卵泡放入24孔培养盘中，按照1ml/孔加入预热的培养液进行单卵泡培养；
(F)间隔24小时更换70％培养液；
(G)利用带刻度的显微镜每天检测卵泡直径，观察卵泡腔的变化。
实施例1
准确称量取1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基础培养液；取500μg牛血清白蛋白溶于基础培养液中，缓慢混匀，避免泡沫产生，配制成Ⅰ液；量取1mg/ml的海藻酸钠溶液100μL，加入Ⅰ液中，缓慢混匀，配制成Ⅱ液；取1mg/mlα-亚麻酸120μL，加入Ⅱ液中，缓慢混匀，配制成工作液；调节工作液pH值＝7.0～7.1，过滤灭菌，放入4℃冰箱中保存备用；取500IU FSH加入100mL备用的工作液中，用于羊卵泡体外培养。
实施例2
准确称量取1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基础培养液；取500μg牛血清白蛋白溶于基础培养液中，缓慢混匀，避免泡沫产生，配制成Ⅰ液；量取1mg/ml的海藻酸钠溶液100μL，加入Ⅰ液中，缓慢混匀，配制成Ⅱ液；取1mg/mlα-亚麻酸180μL，加入Ⅱ液中，缓慢混匀，配制成工作液；调节工作液pH值＝7.0～7.1，过滤灭菌，放入4℃冰箱中保存备用；取500IU FSH加入100mL备用的工作液中，用于牛卵泡体外培养。
对照例
准确称量取1.5mL转铁蛋白，150μL胰岛素，100μL维生素C，0.5mL亚硒酸钠，0.06g青霉素钠、0.1g硫酸链霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基础培养液；取500μg牛血清白蛋白溶于基础培养液中，缓慢混匀，避免泡沫产生，配制成Ⅰ液；量取1mg/ml的海藻酸钠溶液100μL，加入Ⅰ液中，缓慢混匀，配制成Ⅱ液；调节Ⅱ液pH值＝7.0～7.1，过滤灭菌，放入4℃冰箱中保存备用；取500IU FSH加入100mL备用的工作液中，用于牛卵泡体外培养。
试验例结果如图1，表1所示：
表1不同浓度α-亚麻酸对卵巢腔前卵泡体外培养12天后的存活率影响
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。