一种可用于人体的低温热降解水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及智能生物材料技术领域，具体涉及一种智能水凝胶载体，更具体地涉及一种可用于人体的低温热降解水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，水凝胶已经在生物材料领域得到了广泛的应用，包括作为药物及基因运输的载体，组织再生支架，以及伤口缝合的生物胶水等。基于水凝胶的药物运输体系在局部治疗中具有显著的优势，这类材料可以保持数日乃至数星期连续的药物释放，提高了药物的生物利用度并且降低了毒副作用。然而，通常情况下，大多数凝胶都是通过被动扩散或者凝胶的降解释放出药物，这无法满足实际治疗过程中所需要的具有可调节释放动力学的按需药物输送。为此，研究工作者们开发了智能响应性水凝胶，可以对ph、氧化还原电势、酶、热、光、磁场以及超声等多种刺激做出响应。其中，热响应水凝胶是控制释放领域研究最为广泛的智能水凝胶，也受到更多的青睐。

传统的温度敏感水凝胶多是由具有温度响应性相转化的聚合物组成，例如聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)，以及亲水性聚环氧乙烷(peo)。这类聚合物会在温度高于一个特定值时出现相转变，这个温度值通常称为最低临界溶液温度(lowercriticalsolutiontemperature，lcst)。凝胶会在lcst周围出现一个可逆的溶胀/收缩转换，可以利用该特性来对药物的释放行为进行控制。然而，基于lcst的温度敏感水凝胶通常由于缺乏生物降解性等缺陷限制了其在药物控制释放领域的应用。虽然可以通过制备由氢键介导的超分子水凝胶来提高温度敏感水凝胶的一些物理化学特性，但是该类非共价键水凝胶的体内稳定性和粘弹性欠佳。所以，当下亟需开发一类具有良好的体内稳定性，可自发降解，以及拥有可重复并可调节的药物释放动力学的温度敏感水凝胶。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种偶氮水凝胶及其制备方法，所述偶氮水凝胶是基于偶氮交联剂的温度敏感水凝胶。所述偶氮交联剂(偶氮小分子交联剂)具有温度敏感性，可与其他多种具有高反应活性功能基团的高分子或小分子物质交联成胶，得到所述偶氮水凝胶，所述偶氮水凝胶的分子结构中的偶氮键在稍高于人体温度条件下会断裂，从而导致凝胶的降解。

所述偶氮交联剂分子中含有偶氮键，其分子结构如式(i)所示：

其中，r1，r2为推电子基团，可选自甲基、乙基、异丙基、叔丁基等；优选地，r1，r2均为甲基。

r3为含有羰基、醛基、巯基、羧基、氨基、烯烃或者炔基等具有高反应活性功能基团的咪唑衍生物，如等；优选地，r3为

本发明中，所述偶氮水凝胶为可用于人体的低温热降解水凝胶，由偶氮交联剂与含有功能基团的高分子或者小分子物质混合交联而成，所述偶氮水凝胶具有热刺激响应性，且在稍高于人体温度的条件下即可降解，可用于温度刺激响应的水凝胶药物载体；其中，高分子或者小分子物质所含的功能基团(如醛基，巯基，烯烃，氨基等)与偶氮交联剂分子的端基官能团具有非常高的反应活性，所述高分子或者小分子物质选自聚乙二醇、壳聚糖、氨基糖苷类药物等，但不局限于这些化合物。

本发明中，通过引入一种分子结构中含有偶氮键的偶氮交联剂分子，对其两端进行改性，引入功能反应基团，可交联高分子或小分子成胶。该分子结构中的偶氮键具有热不稳定性，稍高于人体温度，在温度高于44℃时偶氮键断裂。所述偶氮交联剂所制备得到的水凝胶在人体正常温度，或者即使是在发烧或者炎症的情况下都能保持稳定，只有当升温至高于其临界降解温度(也就是偶氮交联剂的分解温度)才会发生降解。相比基于亲疏水平衡的传统温度响应体系，本发明的偶氮水凝胶为热刺激响应水凝胶，由化学键的断裂导致降解，稳定性更高，响应性也更加精确。此外，所述偶氮交联剂的临界分解温度为44℃左右，十分温和，适用于人体生物材料用途。

本发明中，所述偶氮交联剂分子的临界分解温度在44℃左右，较温和，适合作为人体生物材料。

本发明中，所述偶氮水凝胶为可用于人体的低温热降解水凝胶，具有热降解性，其临界降解温度与偶氮交联剂的分解温度相似，室温下处于稳定凝胶状态，当温度高于偶氮键的断裂温度44℃，交联剂分子分解，凝胶即会降解。

本发明中，可通过温度来控制所述偶氮水凝胶的机械强度。

本发明中，所述偶氮水凝胶安全无毒，具有良好的生物相容性，可用作药物及生物治疗因子的输送载体。

本发明还提出了一种偶氮交联剂，所述偶氮交联剂的分子结构如式(i)所示：

其中，r1，r2为推电子基团，可选自甲基、乙基、异丙基、叔丁基等；优选地，r1，r2均为甲基。

r3为含有羰基、醛基、巯基、羧基、氨基、烯烃或者炔基等具有高反应活性功能基团的咪唑衍生物，如等；优选地，r3为

本发明中，所述偶氮水凝胶可通过温度来调控其所装载的生物活性物质，如蛋白、药物及生物活性因子的释放，并可通过温度来精确控制所装载的活性物质的释放。

本发明还提出了所述偶氮水凝胶在体内或体外作为蛋白、药物及生物活性因子载体中的应用。

本发明还提出了所述偶氮水凝胶在智能运输载体、智能医用材料等领域中的应用。

本发明的有益效果在于，所述偶氮水凝胶具备以下特点：(1)本发明中偶氮水凝胶为热降解水凝胶，由化学键交联而成，且降解是由于化学键的断裂所导致，水凝胶整体具有良好的稳定性。(2)所述偶氮水凝胶的临界降解温度十分温和，为44℃左右，适于作为人体生物材料。(3)所述偶氮水凝胶可用于生物活性分子以及药物的载体，控制释放所运载的生物活性物质，具有可调控的释放动力学。

附图说明

图1为实施例1中偶氮交联剂azo44的合成路线及分子结构。

图2为实施例1中偶氮交联剂azo44的一维核磁氢谱图。

图3为实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶的成胶照片。

图4为实施例3中所制备的azo44偶氮水凝胶的形态与温度的关系。

图5为实施例3中所制备的戊二醛水凝胶的形态与温度的关系。

图6为实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶的机械性能与温度的关系。

图7为实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶的降解行为与温度的关系。

图8为实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶对生物活性分子的控制释放行为与温度的关系。

图9为实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶的生物毒性测试。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：基于偶氮二异丁基咪唑啉的偶氮交联剂的合成

以偶氮二异丁基咪唑啉为例，其分子结构中的偶氮键断裂温度为44℃，将其两端修饰为醛基。

具体合成方法：室温下，将2.18ml的氯化亚砜与0.15mldmf先后逐滴加入对醛基苯甲酸(3.0g)的苯溶液(20ml)中，持续搅拌该混合物，并加热回流2h。可观察到该反应混合物逐渐由悬浊状态转变为澄清。待反应结束后，通过减压蒸馏除去多余的溶剂和氯化亚砜。将偶氮二异丁咪唑啉(1.25g，5mmol)与三乙胺(5.57ml,40mmol)溶于50ml氯仿中，并置于冰浴条件下，然后将上述活化的对醛基苯甲酸溶液逐滴加入其中，反应在室温下搅拌12h结束。将上述反应混合溶液加入到甲醇中(0.43ml,10mmol)，用饱和碳酸钠溶液清洗两次(10ml×2)，之后用无水硫酸钠干燥浓缩，并用色谱柱纯化(氯仿/甲醇＝80:1)，得到淡黄色的粉末(2.10g)。将该淡黄色粉末溶于4ml丙酮并搅拌2h，最终过滤得到白色的粉末，为两端修饰有醛基的偶氮交联剂azo44(1.65g，64％)。反应路线及所得偶氮交联剂的分子结构如图1所示。偶氮交联剂的¹hnmr如图2所示。

实施例2：偶氮水凝胶的制备

将实施例1制备得到的偶氮交联剂(azo44)以及氨基端四臂聚乙二醇分别配制成50mg/ml的偶氮交联剂溶液以及100mg/ml的氨基端四臂聚乙二醇溶液。之后，分别取50μl的偶氮交联剂azo44溶液与100μl聚乙二醇溶液混合，约10分钟可形成凝胶。

如进一步降低偶氮交联剂溶液浓度，会影响成胶。或者进一步降低聚乙二醇溶液的浓度，成胶时间会延长，一旦低于85mg/ml则会影响成胶。所得凝胶图片如图3所示，将样品瓶倒置5min，该体系能克服重力呈稳定状态且无任何流动发生，从而可确定本发明中偶氮水凝胶的形成。

实施例3：偶氮水凝胶的热响应性

将实施例1制备得到的偶氮交联剂azo44(50μl,50mg/ml)与氨基末端的四臂聚乙二醇(100μl，100mg/ml)混合，振荡大约10分钟成胶，得到所述azo44偶氮水凝胶。并将所形成的凝胶依次置于43℃，44℃，45℃下，观察其凝胶状态。

实验结果：如图4所示，所制备的azo44偶氮水凝胶在43℃能保持稳定的凝胶结构，当温度高于44℃时，凝胶逐渐降解。

此外，用戊二醛与氨基末端的四臂聚乙二醇所形成的凝胶作为参照。将所形成的戊二醛凝胶依次置于47℃，70℃，100℃下，观察其形态变化。实验结果如图5所示，戊二醛凝胶在高温状态下依旧保持十分稳定的凝胶状态，并未出现降解现象。

由以上实验结果可得出：偶氮交联剂azo44所形成的凝胶由于交联剂分子结构中的偶氮键具有温度不稳定性，从而使得凝胶具有热降解性。分子结构中不含有任何温敏基团的戊二醛，其所形成的凝胶在高温下持久稳定，也侧面证实了偶氮类凝胶温度响应性的机理。

实施例4：偶氮水凝胶的机械性能与温度之间的关系

研究实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶的机械性能与温度之间的关系，具体方法为：将azo44所形成的凝胶(azo44胶)直接放置在流变仪的平行铝板上，之后依次在43℃,44℃,45℃与47℃下检测了azo44凝胶的弹性模量。

实验结果：如图6所示，azo44偶氮水凝胶的存储模量g’在43℃时一直处于恒定状态，大约为1170pa左右，当温度升至44℃时，存储模量出现些许下降，说明凝胶的强度开始降低，当温度超过44℃时，凝胶的存储模量出现明显下降，下降趋势随着温度的升高更为明显。弹性模量的变化趋势进一步证明了该类偶氮水凝胶具有热刺激响应性，且azo44偶氮水凝胶的临界溶解温度与偶氮交联剂的分解温度相似，为44℃左右，较为温和，适宜作为生物材料使用。因此，本发明中，可通过温度来控制所述偶氮水凝胶的机械强度。

实施例5：偶氮水凝胶的降解行为与温度之间的关系

研究实施例2中所制备的azo44偶氮水凝胶的降解行为与温度的关系，具体方法为将azo44偶氮水凝胶分别保持在37℃以及47℃，每隔5分钟将降解所得到的溶液用移液器轻轻移除，称量并记录剩余凝胶的质量。实验结果：如图7所示，azo44偶氮水凝胶在37℃时质量保持恒定，而在47℃时的质量随着时间持续降低，进一步说明了该凝胶的热降解性能，在人体正常温度下保持稳定状态，但在稍高于人体温度下即会逐渐降解。

实施例6：偶氮水凝胶的温度响应性控制释放行为

研究实施例2中的azo44偶氮水凝胶对生物活性大分子的控制释放行为。具体试验方法为：将100μg的溶菌酶混入到200μlazo44偶氮水凝胶中，之后加入2ml25℃的磷酸缓冲溶液(ph7.4)，每隔10分钟采集300μl的释放溶液，30分钟后，将凝胶置于45℃的磷酸缓冲溶液中(ph7.4)，每10分钟采集300μl的释放溶液。所释放的溶菌酶通过紫外-可见光谱进行测定。

实验结果：如图8所示，当在室温条件下，azo44凝胶可以维持稳定的凝胶状态，仅有少量的溶菌酶通过自由扩散释放而出。当放入45℃的体系中，溶菌酶被大量释放而出，呈现出“on-off”开关式的释放行为，这正是由于azo44结构中的偶氮双键在45℃下会断裂，导致凝胶逐渐降解，从而快速释放出包裹在凝胶中的溶菌酶。由此可得，本发明所制备的偶氮水凝胶可通过温度来控制所装载的生物活性物质的释放。

实施例7：偶氮水凝胶的细胞毒性检测

研究实施例2中制备得到的azo44凝胶的生物毒性，具体试验方法为：直接在96孔板内形成azo44凝胶，之后在该孔板内的凝胶上接种小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)，接种密度为5000细胞/孔，37℃，5％co2，完全培养基条件下孵育24h。随后采用ao/eb染色法对该细胞进行染色，并用荧光显微镜拍照。

实验结果：如图9所示，在azo44凝胶上孵育24h后，nih3t3细胞仍保持良好的形态和较高的细胞存活率，说明该凝胶不具有生物毒性，可作为生物材料用途。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。