石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用与流程

本发明涉及花卉生物技术领域，具体涉及一种石竹花色调控关键酶基因chs沉默体系的建立方法和应用。

背景技术：

石竹为石竹科石竹属植物，原产于中国，由于其花色众多，因此在花坛、地被等中广泛应用。研究石竹花色调控机理，获得相关基因，用于同属植物花色遗传改良，增加北方园林用植物种类，达到美化环境的目的。石竹从播种到开花需2-3个月，因此对控制这些花色的基因功能进行快速、有效验证，对今后石竹属植物花色遗传、育种的研究及应用具有重要意义。vigs(virus-inducedgenesilence,vigs)技术已应用于多种植物进行基因功能验证，如何利用该技术研究石竹花色基因目前尚无报道。

石竹从播种到开花需2-3个月，如何快速鉴定花色基因，获得其功能是目前花色研究中面临的问题。基于此本发明建立了一套快速、有效的花色鉴定体系，可以解决验证石竹花色基因功能的问题。

查尔酮合成酶(chalconesynthase,chs)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种石竹花色调控关键酶基因chs沉默体系的建立方法和应用，根据查尔酮合成酶的编码基因序列设计特异引物，通过rt-pcr在石竹中扩增出407bp的cdna片段，将获得的chscdna片段连接到trv2上，通过优化试验材料、侵染后培养温度等条件，根据花瓣出现的性状，建立了一套快速、有效的验证花色基因功能的体系，有效解决了目前验证石竹花色基因功能时间长的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

石竹花色调控关键酶基因chs沉默体系的建立方法，包括如下步骤：

s1、从石竹幼苗叶片中提取mrna，以反转录的cdna为模板，根据香石竹chs基因的保守序列设计引物，通过rt-pcr采用forward:gtcgcttcatgctctaccaac及reverse:gctaggactgaacgcatcctc进行扩增，获得407bp的扩增产物；

s2、将获得的407bp大小的片段连接到pgemt-easy上，得chs片段；

s3、将连接到载体pgemt-easy上的chs片段用ecori酶切后连接到采用同样酶切后的trv2载体上，得重组质粒ptrv2/dcchs407；

s4、将所得的重组质粒ptrv2/dcchs407转化gv3101农杆菌,得含有重组质粒的农杆菌。

所述步骤s4具体包括如下步骤：

将含重组质粒ptrv2/dcchs407的离心管置于液氮中速冻1min后快速置于37℃水浴锅中放置3min，再置于冰上,加入1mllb液体培养基，在28℃160-200rpm振荡培养3-5h,将菌液取100μl涂在含有rif和kana的lb平板上，29℃倒置培养2d至出现单菌落，单菌落经pcr检测后，摇菌扩繁、保存，得含有重组质粒的农杆菌。

上述石竹花色调控关键酶基因chs沉默体系的应用具体包括如下步骤：室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液中活化4h后，对处于不同发育时期的花蕾进行高压法侵染，待苞片出现水渍状时，表明侵染完成。

优选地，将侵染后的生长中期的花蕾在15℃、光照强度为50-72μmol·m^-2·s^-1的条件下于光照培养箱中培养4d后，花蕾开放，花色改变。

优选地，所述渗透缓冲液由10mmmes，10mmmgcl2和40μm乙酰丁香酮组成。

本发明具有以下有益效果：

根据查尔酮合成酶的编码基因序列设计特异引物，通过rt-pcr在石竹中扩增出407bp的cdna片段，将获得的chscdna片段连接到trv2上，通过优化试验材料、侵染后培养温度等条件，根据花瓣出现的性状，建立了一套快速、有效的验证花色基因功能的体系，有效解决了目前验证石竹花色基因功能时间长的问题；可以有效、大量、快速的鉴定调控中国石竹花色的新基因的功能，如花色、花香、花期等基因的功能。

附图说明

图1为本发明实施例中chs基因的rt-pcr扩增结果；

图中1，2为已扩增的407bp大小的片段。

图2为本发明实施例中香石竹、dianthusmonspessulanus及石竹chs核苷酸水平同源性比较示意图。

图3为本发明实施例中ptrv2/dcchs407的酶切结果；

图中，m为100bpladder。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种石竹花色调控关键酶基因chs沉默体系的建立方法，包括如下步骤：

s1、从石竹幼苗叶片中提取mrna，以反转录的cdna为模板，根据香石竹chs基因的保守序列设计引物，通过rt-pcr采用forward:gtcgcttcatgctctaccaac及reverse:gctaggactgaacgcatcctc进行扩增，获得407bp的扩增产物(图1)。

s2、将获得的407bp大小的片段连接到pgemt-easy上测序并在ncbi上进行序列比对(图2)。结果表明扩增的片段与dianthusmonspessulanus、香石竹的chs基因分别达100％和97％的同源性。

s3、将连接到载体pgemt-easy上的chs片段用ecori酶切后连接到采用同样酶切后的trv2载体上，然后对重组质粒ptrv2/dcchs407进行酶切验证(图3)；

将不同时期的花蕾采下后插入液体培养基(1/2×ms大量元素，1/2×ms钙盐，1×ms微量元素，1×ms铁盐，0.4mg/l维生素b1，10mg/l肌醇，3％蔗糖)中，放在光照培养箱中进行培养，在不同的温度(10℃、15℃及22℃)下观察其开花率及开花时间，结果表明不同温度下花蕾形态处于生长中期及花前期时均能开花，且开花率高，结果表1所示。

表1

表2花蕾不同发育时期以及侵染后不同培养温度对花色沉默效果的影响

结果表明在0.05mpa的压力下，花蕾形态处于生长中期，在15℃、光照强度50-72μmol·m^-2·s^-1的条件下于光照培养箱中培养，于第4天花瓣颜色出现变化且趋于白色，沉默花朵多、沉默效果好。

因此，根据上述结果，得出花蕾形态处于生长中期时，在0.05mpa的压力下侵染至苞片呈水渍状，然后在15℃、光照强度为50-72μmol·m^-2·s^-1的条件下于光照培养箱中培养大约4d后，花蕾开放，花色改变，侵染效率达最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。