本发明涉及用于确定来自小群体或个体CYP2D6基因拷贝数变化的方法，该方法可以快速高效准确的检测CYP2D6基因的拷贝数变化，并发现在生物学和医学中的应用。
背景技术：
CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶。CYP2D6位于第22号染色体上，共含有9个外显子和8个内含子，总长度约为5400bp，是一个完整的功能性基因。现代研究发现，肝脏中CYP2D6的含量仅占P450肝脏蛋白总量的2％，但是它却参与代谢约25％的临床用药，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。这些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其编码蛋白的酶活性表现为缺失、降低、正常或是增加等几种类型，进一步对药物的代谢同样表现出多样性，。
目前已经发现CYP2D6基因有超过100个变异位点，但影响中国人CYP2D6功能的常见变异有8个，包括快代谢型基因变异(基因拷贝数增多)、中间代谢型基因变异(CYP2D6*9、*10、*14和*41)和慢代谢型基因变异(CYP2D6*3、*4和*5)。CYP2D6基因的这些变异可引起酶活性以及酶数量的差异，导致疗效不足或毒副作用的产生，最终产生药物疗效的个体差异。因此，CYP2D6的多态性研究对临床具有重要的意义，已经成为目前研究的热点。
CYP2D6基因的拷贝数变化尤其重要，因为基因重复引起的拷贝数增加和基因缺失引起的拷贝数减少是影响CYP2D6酶活性增高和降低的重要原因。检测CYP2D6基因的单核苷酸多态性、寡核苷酸插入和缺失能够检测CYP2D6酶活性的缺失和降低，但是只有基因拷贝数的增加能够决定CYP2D6酶活性的增加。因此，CYP2D6基因拷贝数检测在临床应用具有重要意义。
目前国内外检测CYP2D6基因突变的产品，如Luminex的xTAG液相芯片、Roche的AmpliChip CYP450芯片、直接测序法、PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测等灵敏性均不高，检测结果可重复性差。这些方法需要耗费大量人力，同时所需的检测时间较长，从核酸提取到结果获取超过8小时，即超过1天正常工作时间。另外这些方法都无法快速准确的测定CYP2D6基因的拷贝数变化。目前，较为准确的鉴定CYP2D6基因拷贝数变化的方法有数字PCR技术(专利CN 101821619 B)和基于定量PCR的标准曲线法技术(专利CN 104263820 A)，但是两种方法试剂成本较高，不宜推广。
在本申请中，我们采用实时荧光PCR法检测CYP2D6基因的拷贝数变化。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。同时，在我们的研究中，针对CYP2D6基因，我们采用了多个探针，能够做到结果准确性高，检测便捷高效，同时也能够对大样本量进行快速检测。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明针对现有技术的缺点，实时定量荧光PCR检测方法没有PCR后处理，能够大量节省时间与人力。从DNA提取到荧光PCR实验结束，及数据分析，全部过程仅需4小时，实体实验操作时间小于2小时。
传统的实时定量荧光PCR检测技术及产品往往只是针对单一位点设计，不能同时获得多个位点信息。在检测单位点情况下不能准确的获得CYP2D6基因拷贝数变化的准确信息。本发明详细的分析了CYP2D6基因与其同源基因的序列差异，进一步针对CYP2D6基因的特异DNA序列，分别在CYP2D6基因的第二外显子附近、第六内含子区和第九外显子区分别设计了一对检测引物和探针，从而能够获取CYP2D6基因的多个位点信息，为准确的鉴定CYP2D6基因打下了良好的科学基础。此外，该方法建立在普通荧光PCR的基础上，具有操作简便快捷，成本低廉，易于推广的优点。
本发明的技术方案如下：
1、一组检测CYP2D6基因多态性的引物，其特征在于：包括CYP2D6基因3个区段的PCR扩增引物和荧光探针。CYP2D6基因对应探针用FAM进行5’端标记。
具体CYP2D6基因的3组引物和探针序列如下：
2、为了研究CYP2D6基因的拷贝数变异，选用人类基因组单拷贝基因RPP30(ribonuclease P/MRP 30kDa subunit)作为参考序列。RPP30基因对应探针用HEX进行5’端标记。
RPP30基因引物和探针分别为：
3、荧光定量PCR反应：
采用单管二重定量PCR的方法检测检测CYP2D6基因的拷贝数变异，具体反应体系为10μL，包含8ng基因DNA，5μL 2x TaqMan mix,RPP30基因引物和探针以及一组CYP2D6基因的引物和探针(引物和探针终浓度均为0.2μM)，然后补水到10μL。针对每个样品，进行4个重复。PCR扩增条件为95℃10min进行热启动，然后95℃15s变性，60℃退火和扩增1min，共计40个循环。
4、取CYP2D6基因为单拷贝的样品作为对照样品。检测对象和对照样品各进行4个重复的PCR反应，获取实时定量PCR扩增的Ct值。
5、荧光定量PCR结果分析算法：
(1)利用内参基因确定CYP2D6的加权值。
加权值＝样品CYP2D6平均Ct值÷样品内参基因RPP30平均Ct值
(2)利用对照人群的CYP2D6拷贝数计算检测对象的基因拷贝数。
α＝检测对象加权值÷对照样品加权值
如果α<0.2，检测对象的CYP2D6拷贝数为0；
如果α为0.5-1.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为1；
如果α为1.5-2.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为2；
如果α为2.5-3.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为3；
如果α为3.5-4.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为4；
如果α为其他值则需要重新检测。
本发明的有益之处在于：
(1)本发明采用实时荧光定量PCR检测技术，设计了全新的CYP2D6基因及单拷贝基因内参引物和荧光探针用于拷贝数变化的检测。
(2)本发明要求测试人群和对照人群进行多组重复并且在同一个PCR板进行检测，采用了16x24的384孔板反应体系。能够准确、快速、高效的进行多个病人样品的拷贝数检测。
(3)本发明极大的降低了CYP2D6基因拷贝数检测的成本，提高了基因拷贝数检测的准确性。
(4)本发明的原理可以应用到现有的任何荧光实时定量PCR仪器，方便使用，易于大范围内推广。
(5)本发明所述检测方法可以简单快速的检测CYP2D6基因的拷贝数，结果可以用于以下多种药物的个性化用药指导，如β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药等，相应的药物种类有阿立哌唑、阿托西汀、文拉法辛、利哌利酮、塞托溴胺吸入、他莫昔芬、噻吗洛尔、氟西汀、奥氮平、西维美林、托特罗定、特比萘芬、曲马多、氯氮平、美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛、普罗帕酮、硫利达嗪、普罗替林、可待因、匹莫齐特、丁苯那嗪、伊潘立酮等。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
实施例1制备检测CYP2D6基因多态性的引物：
包括CYP2D6基因3个区段的PCR扩增引物和荧光探针。CYP2D6基因对应探针用FAM进行5’端标记。
具体CYP2D6基因的3组引物和探针序列如下：
实施例2制备RPP30基因引物和探针：
为了研究CYP2D6基因的拷贝数变异，选用人类基因组单拷贝基因RPP30(ribonuclease P/MRP 30kDa subunit)作为参考序列。RPP30基因对应探针用HEX进行5’端标记。
RPP30基因引物和探针分别为：
实施例3荧光定量PCR反应：
采用单管二重定量PCR的方法检测检测CYP2D6基因的拷贝数变异，具体反应体系为10μL，包含8ng基因DNA，5μL 2x TaqMan mix,RPP30基因引物和探针以及一组CYP2D6基因的引物和探针(引物和探针终浓度均为0.2μM)，然后补水到10μL。针对每个样品，进行4个重复。PCR扩增条件为95℃10min进行热启动，然后95℃15s变性，60℃退火和扩增1min，共计40个循环。
实施例4：
取CYP2D6基因为单拷贝的样品作为对照样品。检测对象和对照样品各进行4个重复的PCR反应，获取实时定量PCR扩增的Ct值。
实施例5荧光定量PCR结果分析算法：
(1)利用内参基因确定CYP2D6的加权值。
加权值＝样品CYP2D6平均Ct值÷样品内参基因RPP30平均Ct值
(2)利用对照人群的CYP2D6拷贝数计算检测对象的基因拷贝数。
α＝检测对象加权值÷对照样品加权值
如果α<0.2，检测对象的CYP2D6拷贝数为0；
如果α为0.5-1.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为1；
如果α为1.5-2.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为2；
如果α为2.5-3.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为3；
如果α为3.5-4.3，检测对象的CYP2D6拷贝数为4；
如果α为其他值则需要重新检测。
可见，与现有技术相比，该技术具有检测结果准确可靠、通量较高、实验设计灵活、操作简便快捷、检测速度快、易于推广，而且成本低廉。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。