基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法与流程

本发明涉及植物分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法。

背景技术：

转基因玉米59122兼具抗虫害及耐除草剂两种特异性转化事件，是通过农杆菌介导技术将质粒载体PHP17662导入玉米转化事件Hi-Ⅱ基因组筛选得到的基因改造玉米。载体PHP17662包含来自苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)PS149B1的cry34Ab1与cry35Ab1抗虫基因以及抗除草剂pat基因。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是Notomi等，于2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下(60-65℃)反应，在1h内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增10⁹倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。目前环介导等温检测技术的产物检测方法主要有浊度法、染料法、电泳法以及核酸试纸条，但是这些方法都容易引起交叉污染。

核酶是一种具有类过氧化物酶活性、富含鸟嘌呤的单链DNA分子，在特定的条件下能够折叠成G4重结构，在H₂O₂存在下能够催化无色底物2,2′-连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS^2-)氧化成蓝绿色物质ABTS^-·自由基。当存在单链DNA分子的互补链时，这种类过氧化物酶的活性降低甚至消失。将折中显色/消光技术结合到环介导等温扩增技术上，利用引物显色，产物消光的手段，来验证目的片段的存在。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一套用于检测转基因玉米59122的LAMP引物组合以及含有该引物组合的试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一套用于检测转基因玉米59122的LAMP引物组合，所述引物组合根据转基因玉米59122转化事件5’端序列设计，包括(Seq ID No:1-4)：

外侧正向引物59122-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCACCTGTGATTGGCTCAT-3’；

外侧反向引物59122-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCTGAGTGGCTCCTTCAAC-3’；以及

内侧正向引物59122-FIP：5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGGGACGGAAGAAAGAGTGAAGGG-3’；

内侧反向引物59122-BIP：5’-AGGGAGTCACGTTATGACCCCCCTGGGAGGGAGGGAGGGGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3’。

本发明还提供含有上述LAMP引物组合用于检测转基因玉米59122的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、ABTS显色液、hemin工作液、H₂O₂溶液(优选30％H₂O₂溶液)、Thermopol缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

其中，所述ABTS显色液的浓度为36mM，配制溶剂为1×DMSO。现用现配。

所述hemin工作液的组成如下：50μM hemin、10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂和0.003％Triton X-100。

本发明中，Bst DNA聚合酶冻干在PCR管内底部，于-20℃保存。dNTPs、ABTS显色液、hemin工作液、ABTS粉剂、DMSO缓冲液、30％H₂O₂可常温保存。反应液需4℃保存。

本发明还提供所述LAMP引物组合或所述试剂盒在检测转基因玉米59122中的应用。

本发明进一步提供一种基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法，包括以下步骤：

1)将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB法提取基因组DNA；

2)显色反应，并通过肉眼观察反应混合液的颜色，或利用紫外分光光度计测定反应混合液在419nm处的OD值：

3)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述LAMP引物组合，进行环介导等温扩增消光反应：

4)分析扩增产物。

步骤1)可采用CTAB法提取待测样品中的DNA。

步骤2)具体为：将hemin工作液与所述LAMP引物组合混合，35-45℃孵育20-30min，然后添加ABTS显色液和H₂O₂，立即用肉眼观察颜色或利用紫外分光光度计测定OD_419nm值；

显色反应的反应体系为：40-60μM hemin工作液90μL，10μM引物59122-F3和59122-B3各0.5μL，10μM引物59122-FIP和59122-BIP各3-4μL，30-40mM ABTS显色液30μL，30％H₂O₂1μL，用dd H₂O补足至总体系130μL。

步骤3)具体为：向步骤2)显色反应所得混合液中添加16μL扩增试剂，所述扩增试剂包括1.8-3.0mM dNTP、6-9mM MgSO₄、1-2M甜菜碱、3.6-10.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和2μL DNA模板，配制反应体系，然后60-65℃孵育40-60min，80-85℃放置2-3分钟，最后冰上终止反应。

步骤4)具体为：目测判定反应前后反应混合液颜色变化，或利用紫外分光光度计测定步骤3)所得反应混合液在419nm处的OD值；若颜色由反应前的蓝色变成浅蓝色或无色，或者反应后OD_419nm值变小，表明待测样品中含有转基因玉米59122成分。

本发明的环介导等温扩增消光反应在水浴锅或金属浴內进行。

在本发明的一个具体实施方式中，基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法包括以下步骤：

①将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB法提取基因组，作为DNA模板(例如将提取的基因组DNA稀释至50ng/μL作为模板)；

②显色反应：将hemin工作液与LAMP引物组合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS显色液和H₂O₂，立即用肉眼观察颜色或利用紫外分光光度计测定OD_419nm值；

显色反应的反应体系为：50μM hemin工作液90μL，10μM引物59122-F3和59122-B3各0.5μL，10μM引物59122-FIP和59122-BIP各4μL，36mM ABTS显色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O补足至总体系130μL；

③环介导等温扩增消光反应：向步骤②显色反应所得混合液中添加16μL扩增试剂，所述扩增试剂包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜碱、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和2μL DNA模板，配制反应体系，然后65℃孵育40min，85℃放置3分钟，最后冰上终止反应；

④目测判定反应前后反应混合液颜色变化，或利用紫外分光光度计测定步骤③所得反应混合液在419nm处的OD值；若颜色由反应前的蓝色变成浅蓝色或无色，或者反应后OD_419nm值变小，表明待测样品中含有转基因玉米59122成分。

本发明利用环介导等温扩增消光技术检测转基因玉米59122具有以下优点：

(一)反应快速，一般情况下在15-30min即可有大量的扩增产物产生，为了保证检测准确度，本发明优选反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增10⁹倍，该方法操作简便，适于核酸分子的快速检测。

(二)特异性好，该方法对靶基因的6个区域设计引物，引物具有更高的特异性。

(三)灵敏度高，该方法反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高1～2个数量级，该技术为转基因玉米59122成分的监测提供了技术支持。

(四)操作简单，适于基层使用。本发明开发设计出检测转基因玉米59122的试剂盒，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，可供基层检测使用。

附图说明

图1为本发明实施例2中环介导等温消光扩增反应电泳结果；其中，泳道1为阳性扩增，泳道2为阴性扩增，M为D2000maker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于检测转基因玉米59122的LAMP引物的设计与合成

通过日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件PrimerExplorerV5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)针对转基因玉米59122转化事件5’端基因的部分区域(Seq ID No:5)设计引物，引物由上海英潍捷基有限公司合成，将引物稀释至10μmol/L。引物序列如下：

外侧正向引物59122-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCACCTGTGATTGGCTCAT-3’；

外侧反向引物59122-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCTGAGTGGCTCCTTCAAC-3’；以及

内侧正向引物59122-FIP：5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGGGACGGAAGAAAGAGTGAAGGG-3’；

内侧反向引物59122-BIP：5’-AGGGAGTCACGTTATGACCCCCCTGGGAGGGAGGGAGGGGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3’。

利用软件设计引物，与普通LAMP引物相比，本发明的内侧引物由两条引物以及DNAzyme序列构成，要求F1c与F2之间不超过35bp，同理B1与B2c之间不超过35bp，否则，内侧引物则无法折叠成哑铃状结构。

其中，外侧正向引物59122-F3与Seq ID No:5上的第522-539位碱基相匹配，外侧反向引物59122-B3与Seq ID No:5上的第730-748位碱基相匹配，内侧正向引物59122-FIP分别与Seq ID No:5上的第556-575位碱基以及第611-632位碱基相匹配，内侧反向引物59122-BIP分别与Seq ID No:5上的第656-677位碱基以及第718-727位碱基相匹配。

实施例2基于环介导等温扩增消光技术检测转基因玉米59122的方法

1、实验方法

①将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB法提取基因组，作为DNA模板，将模板稀释至50ng/μL；

②显色反应：将hemin工作液与实施例1的LAMP引物组合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS显色液和H₂O₂，立即用肉眼观察颜色或利用紫外分光光度计测定OD_419nm值；

显色反应的反应体系为：50μM hemin工作液90μL，10μM引物59122-F3和59122-B3各0.5μL，10μM引物59122-FIP和59122-BIP各4μL，36mM ABTS显色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O补足至总体系130μL；其中，配制ABTS显色液的溶剂为1×DMSO，现用现配；所述hemin工作液的组成如下：50μM hemin、10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂和0.003％Triton X-100；

③环介导等温扩增消光反应：向步骤②显色反应所得混合液中添加16μL扩增试剂，所述扩增试剂包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜碱、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和2μL DNA模板，配制反应体系，然后65℃水浴锅中孵育40min，85℃放置3分钟，最后冰上终止反应；

④目测判定反应前后反应混合液颜色变化，或利用紫外分光光度计测定步骤③所得反应混合液在419nm处的OD值；若颜色由反应前的蓝色变成浅蓝色或无色，或者反应后OD_419nm值变小，表明待测样品中含有转基因玉米59122成分。

2、实验结果

显色反应液呈蓝色，OD_419nm值为0.74685，扩增后反应液接近无色，OD_419nm值为0.05364，阴性对照(模板用ddH₂O代替)反应液呈蓝色，OD_419nm值为0.74213，由此判定样品中含有转基因玉米59122成分。

经过上述环介导等温消光扩增，得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，表现出典型的LAMP-PCR产物条带。该结果表明本发明引物组合的特异性强，且可直接用于转基因玉米59122的检测。

实施例3环介导等温扩增消光反应体系及反应条件的优化

为保证显色体系最佳，本发明对下述各反应因素进行优化。

1.显色时间的优化

配制试剂：10μM引物59122-F3、59122-B3、59122-FIP和59122-BIP，40μM hemin工作液，30mM ABTS显色液，30％H₂O₂。

实验方法：向90μL hemin工作液，添加0.5μL引物59122-F3和59122-B3以及4μL引物59122-FIP和59122-BIP，35℃孵育20min。然后再添加30μL ABTS显色液和1μL H₂O₂，利用紫外分光光度计测定所得反应混合液在0s、30s、1min、2min、5min、10min、30min的OD_419nm值。阴性对照不添加引物，用ddH₂O替代。根据表1结果可知，随着时间的延长，阳性和阴性的显色都会显著增加，通过阳性和阴性的比值发现，测量时间越早越好，本发明采用显色后立即测定OD值。

表1不同显色时间下的显色结果

2.孵育温度和时间的优化

配制试剂：10μM引物59122-F3、59122-B3、59122-FIP和59122-BIP，40μM hemin工作液，30mM ABTS显色液，30％H₂O₂。

实验方法：阳性反应(+)向90μL hemin工作液，添加0.5μL引物59122-F3和59122-B3以及4μL引物59122-FIP和59122-BIP，35-45℃孵育20-30min。然后再添加30μL ABTS显色液和1μL H₂O₂，利用紫外分光光度计立即测定所得反应混合液的OD_419nm值。阴性对照(-)不添加引物，用ddH₂O替代。根据表2结果可知，随着时间的延长，

阳性和阴性的显色都会逐渐增加，通过阳性和阴性的比值发现，后期结果差异不大，本发明采用的孵育条件为40℃，30min。

表2不同孵育温度及时间下的显色结果(OD_419nm值)

3.浓度的优化

配制试剂：10μM引物59122-F3、59122-B3、59122-FIP和59122-BIP，40-50μM hemin工作液，30-40mM ABTS显色液，30％H₂O₂。

实验方法：向90μL hemin工作液，添加0.5μL引物59122-F3和59122-B3以及4μL引物59122-FIP和59122-BIP，40℃孵育30min。然后再添加30μL ABTS显色液和1μL H₂O₂，利用紫外分光光度计立即测定所得反应混合液的OD_419nm值。阴性对照不添加引物，用ddH₂O替代。根据表3结果可知，随着hemin浓度的增加，阳性(+)的显色都会逐渐增加，这是由于与核酶结合的量增加了；随着ABTS浓度的增加，阳性的显色逐渐增加，但是阴性(-)的显色也会逐渐增加，这是由于显色底物本身的颜色增加了，背景值的增加造成阳性和阴性的比值下降，本发明采用的孵育条件为hemin浓度50μM，ABTS浓度36mM。

表3不同hemin工作液及ABTS显色液的显色结果(OD_419nm值)

实施例4基于环介导等温扩增消光技术检测转基因玉米59122与普通PCR方法的比较

1、实验方法

①将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB法提取基因组，作为DNA模板，模板浓度稀释到50ng/μL，然后按10倍稀释至0.05pg/μL；

②显色反应：将hemin工作液与实施例1的LAMP引物组合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS显色液和H₂O₂，立即用肉眼观察颜色或利用紫外分光光度计测定OD_419nm值；

显色反应的反应体系为：50μM hemin工作液90μL，10μM引物59122-F3和59122-B3各0.5μL，10μM引物59122-FIP和59122-BIP各4μL，36mM ABTS显色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，以dd H₂O配制；

③环介导等温扩增消光反应：向步骤②显色反应所得混合液130μL中添加16μL扩增试剂，包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜碱、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和2μL DNA模板，配制反应体系，然后65℃水浴锅中孵育40min，85℃放置3分钟，最后冰上终止反应；

④利用紫外分光光度计测定步骤③所得反应混合液在419nm处的OD值；若反应后OD_419nm值变小，表明待测样品中含有水稻59122成分。

2、实验结果

根据表4结果可知，实验组OD_419nm值随着基因组浓度的增加而降低，阴性对照OD_419nm值与原OD值基本一致，为保证结果的准确性，我们认定阳性OD_419nm/阴性OD_419nm的值大于2的情况下证明有扩增，由此判定本方法的最低检测限为10pg，约3拷贝。根据文献报道(Li X,Yang L,Zhang J,et al.Simplex and duplex polymerase chain reaction analysis of RW(59122)maize based on one reference molecule including separated fragments of 5integration site and endogenous gene[J].Journal of AOAC International,2009,92(5):1472-1483.)，PCR方法检测转基因玉米59122的灵敏度约为10拷贝。

表4不同DNA模板浓度下的显色结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。