RT‑qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法与流程

本发明涉及一种检测方法，尤其是涉及一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，属于分子生物技术领域。

背景技术：

黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)是体内核酸代谢中一种重要的酶，在嘌呤代谢过程中催化嘌呤代谢的最后两步，从黄嘌呤和次黄嘌呤形成尿酸代谢终产物尿酸。该酶广泛分布于各种动物及人类体内，主要存在于肝脏中。

高尿酸血症是由于尿酸盐沉积或尿酸代谢障碍所致血清尿酸水平增高所引起的一种疾病，近年来发病率不断上升。研究表明其不但是痛风发作的病理基础，还与糖尿病、高血压、代谢紊乱综合征、胰岛素抵抗综合症等疾病有密切的关系，动物模型作为研究疾病发病机制和药理药效的一种方法在科学发展中有着非常重要的作用。探讨高尿酸血症的发病机理和建立动物模型对于攻克高尿酸血症尤为重要。

文献报道中对黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)的研究主要集中在其结构、序列、功能及抑制物上，近来越来越重视其转录水平的研究，小鼠，树鼩的检测方法都已有研究。

实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。

为研究大鼠体内黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)的转录水平，需建立一种能够精确对黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)mRNA定量检测的方法，为大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)的进一步研究打下基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，以在转录水平上对黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因进行定量检测。

为实现上述目的，本发明通过下列技术方案完成：以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平。

本发明的具体方案是：一种RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)设计下列引物：

大鼠XDH/XO基因表达水平的特异性上、下游引物组合及对应的核苷酸序列为：

XDH/XO F：5＇-ATGCGGACCCTGAAACAACA-3＇

XDH/XO R：5＇-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA-3＇；

作为内参基因的大鼠GAPDH基因的特异性上、下游引物组合及对应的核苷酸序列为：

GAPDH F：5＇-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3＇

GAPDH R：5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3＇；

(2)以大鼠新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得大鼠肝脏组织cDNA第一链；

(3)建立大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因标准曲线：以Esidilution梯度稀释步骤(2)大鼠肝脏组织cDNA第一链，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，以步骤(1)中的XDH/XO F和XDH/XO R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系下：25μL体系，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)12.5μL，正向、反向引物各1μL，cDNA模板1μL，去离子水9.5μL，进行下列实时荧光定量PCR扩增：94℃预变性30s，94℃变性5s、59℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光，得到大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因的溶解曲线和标准曲线；

(4)大鼠肝脏提取的总RNA经实时荧光定量PCR检测收集荧光与步骤(3)所得溶解峰标准曲线比较，即得到Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平。

本发明具备的优点及效果：本发明适用于实时荧光定量PCR检测。应用本发明所公开的引物序列可实现对大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物可对大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。本发明为研究大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的功能及影响因素提供了有效工具。

附图说明

图1为大鼠RNA完整性测定的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为大鼠XDH/XO基因溶解曲线；

图3为大鼠XDH/XO mRNA RT-qPCRc产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为大鼠GAPDH基因的标准曲线；

图5为大鼠XDH/XO基因的标准曲线；

图6为大鼠mRNA XDH基因表达水平变化。

具体实施方法

下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。

1、本实施例中所使用的实验动物：清洁级Wistar大鼠，雌性，40只。

2、实验动物的分组及给药：健康的雌性大鼠40只，随机分成5组，8只/组，第一组腹腔注射300mg/kg剂量37.5mg/ml浓度的氧嗪酸钾(OA)作为OA组，第二组腹腔注射22mg/kg剂量2.75mg/ml的别嘌醇(ALLO)作为ALLO组，第三组腹腔注射1％的CMC-Na作为对照组，第四组腹腔注射300mg/kg剂量氧嗪酸钾和22mg/kg剂量的别嘌醇作为OA+ALLO22mg/kg组，第五组腹腔注射300mg/kg剂量氧嗪酸钾和3mg/kg剂量0.4mg/ml浓度的别嘌醇作为OA+ALLO3mg/kg，每只大鼠之间给药时间间隔10分钟，并于每组随机挑选2只大鼠，给药1.5h后处死各取肝脏0.1g，用于黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的检测。

3、实验方法

3.1大鼠肝脏组织的采集

分离并摘取肝脏组织置于RNA助溶剂(Tripure，Roche公司)用于黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的检测。

3.2肝脏总RNA的提取

取新鲜肝脏0.1g于匀浆器中，加入1ml tripure在室温下充分匀浆，静置5min，再将其转移至1.5mlEP管中静置5min，加入200ul-20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min后4℃、12000r/m离心25min，吸取上清液450ul于另一只1.5mlEP管中，等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min，4℃、12000r/m离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1ml-20℃预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/m离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30ulDEPC水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的总RNA样品取1ul经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值。测定浓度后加DEPC水稀释至1000ng/ul，放入-80℃冰箱备用。

3.3RNA完整性检测

随机取3.2步骤所提取的总RNA样品2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，400mA)20min，在凝胶成像系统下观察28S，18S和5S条带亮度，分析RNA的完整性。结果可观察到28S，18S和5S三条带，见图1，说明所提取的RNA无降解，完整性好，可用于后续实验。

3.4cDNA的合成

按照逆转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit说明操作，每10μl体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，总RNA(浓度稀释为1000ng/μl)1μl，R NaseFree dH2O 5.5μl，逆转录条件为:37℃，15min，85℃，5s，4℃，10min。

3.5目的基因引物的设计

根据NCBI基因库中大鼠的XDH/XO和GAPDH的基因序列，利用引物设计软件Pimer Express 5.0分别进行引物设计，经北京百泰克公司合成，GAPDH作为内参基因。

3.6本实施例大鼠XDH/XO基因表达水平定量用引物序列及片段大小见表1。

表1

3.7目的基因荧光定量PCR反应体系的确定

按TAKARA生物有限公司产品PCR试剂(SYBR Premix Ex TaqII)，在实时荧光定量仪CFX96Real-Time System上进行扩增和数据分析，PCR扩增体系如下：XDH及GAPDH上、下游引物各1ul(10p)，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)12.5ul，灭菌去离子水9.5ul、cDNA 1ul；进行下列PCR扩增：94℃预变性30s，94℃变性5s、59℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光。

3.8大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因标准曲线的建立：以Esidilution梯度稀释步骤3.4逆转录合成的大鼠肝脏cDNA第一链，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，各做2个平行样进行实时荧光定量检测，按步骤3.7荧光定量PCR体系进行实时荧光定量PCR，得到XDH/XO基因和GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线。

3.9样品基因表达差异分析

由标准曲线ct值可得各稀释梯度cDNA的拷贝数，以样品ct值对应得到目的基因的相对表达量。

4结果

4.1大鼠XDH/XO基因荧光定量PCR反应的溶解曲线

由图2和图3可见，在XOD/XO基因扩增过程中荧光定量PCR反应的溶解曲线仅见单独的峰，反应产物的电泳结果仅见一条特意条带，表明扩增的目的片段特异性良好。

4.2大鼠XDH/XO基因和GAPDH基因的标准曲线

由图4和图5可见，大鼠XOD/XO基因和GAPDH基因的标准曲线R²均接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与PCR的扩增相对同步，能准确检测PCR的表达，以GAPDH为内源控制物，得到mRNA表达水平的变化。

4.3别嘌醇对氧嗪酸钾所致的高尿酸血症大鼠肝脏组织XDH/XO mRNA表达水平的变化的定量检测

步骤2各组所获得的新鲜肝脏组织所提取的RNA，反转录得cDNA，经实时荧光定量PCR检测，可得各组XDH/XO mRNA表达水平差异，腹腔注射300mg/kg剂量的氧嗪酸钾，肝脏组织mRNA XDH基因表达上调，注射别嘌醇基因表达相对于对照组下调，注射氧嗪酸钾同时注射别嘌醇组基因表达相对对照组上调，相对氧嗪酸钾OA组基因表达均下调。见图6。

4.4氧嗪酸钾(OA)是尿酸酶抑制剂，能通过抑制尿酸酶活性，减少尿酸的分解与排泄，使尿酸值升高，可造成小鼠、大鼠高尿酸血症，在啮齿类动物造模中运用较多，用于上述实施例可使XDH/XO mRNA表达上调；别嘌醇(ALLO)通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性使尿酸生成减少,血中及尿中的尿酸含量降低到溶解度以下的水平，主要用于治疗痛风和防止痛风性肾病、继发性高尿酸血症以及重症癫痫的辅助治疗，用于上述实施例可使XDH/XO mRNA表达下调。步骤4.3的实验结果与氧嗪酸钾和别嘌醇对大鼠的影响结果一致，说明本发明可用于XDH/XO mRNA表达水平的检测，为研究大鼠XDH/XO基因的功能及影响因素提供了有效工具，为高尿酸血症等疾病的研究提供可靠手段。

XDH/XO基因特异性上游引物：

XDH/XO F：5＇-ATGCGGACCCTGAAACAACA-3＇

XDH/XO基因特异性下游引物：

XDH/XO R：5＇-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA-3＇

内参基因GAPDH特异性上游引物：

GAPDH F：5＇-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3＇

内参基因GAPDH特异性下游引物：

GAPDH R：5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3＇

所扩增的大鼠XDH/XO基因片段的核苷酸序列：

atgcggacc ctgaaacaac acttctggtc tacctgagaa gaaagttggg gctatgtggg accaagcttg gctgtggaga aggtggctgt ggggcatgca ccgtgatgat ctccaagtat gaccgtcttc agaaca

所扩增的大鼠内参基因GAPDH片段的核苷酸序列：

ggcacagtc aaggctgaga atgggaagct ggtcatcaac gggaaaccca tcaccatctt ccaggagcga gatcccgcta acatcaaatg gggtgatgct ggtgctgagt atgtcgtgga gtctactggc gtcttcacca ccat