基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法与流程

技术特征：

1.用于检测转基因玉米59122的LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合根据转基因玉米59122转化事件5’端序列设计，包括：

外侧正向引物59122-F3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCACCTGTGATTGGCTCAT-3’；

外侧反向引物59122-B3：5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGGCTGAGTGGCTCCTTCAAC-3’；以及

内侧正向引物59122-FIP：5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGGAGGGACGGAAGAAAGAGTGAAGGG-3；’

内侧反向引物59122-BIP：5’-AGGGAGTCACGTTATGACCCCCCTGGGAGGGAGGGAGGGGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3’。

2.含有权利要求1所述LAMP引物组合用于检测转基因玉米59122的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、ABTS显色液、hemin工作液、H₂O₂溶液、Thermopol缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述ABTS显色液的浓度为36mM，配制溶剂为1×DMSO；

所述hemin工作液的组成如下：50μM hemin、10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂和0.003％Triton X-100。

5.权利要求1所述LAMP引物组合或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测转基因玉米59122中的应用。

6.基于环介导等温扩增消光技术的转基因玉米59122检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB法提取基因组DNA；

2)显色反应，并通过肉眼观察反应混合液的颜色，或利用紫外分光光度计测定反应混合液在419nm处的OD值：

3)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组合，进行环介导等温扩增消光反应：

4)分析扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为：将hemin工作液与权利要求1所述LAMP引物组合混合，35-45℃孵育20-30min，然后添加ABTS显色液和H₂O₂，立即用肉眼观察颜色或利用紫外分光光度计测定OD_419nm值；

显色反应的反应体系为：40-60μM hemin工作液90μL，10μM引物59122-F3和59122-B3各0.5μL，10μM引物59122-FIP和59122-BIP各3-4μL，30-40mM ABTS显色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O补足至总体系130μL。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为：向步骤2)显色反应所得混合液中添加16μL扩增试剂，所述扩增试剂包括1.8-3.0mM dNTP、6-9mM MgSO₄、1-2M甜菜碱、3.6-10.0U BstDNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和2μL DNA模板，配制反应体系，然后60-65℃孵育40-60min，80-85℃放置2-3分钟，最后冰上终止反应。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为：目测判定反应前后反应混合液颜色变化，或利用紫外分光光度计测定步骤3)所得反应混合液在419nm处的OD值；若颜色由反应前的蓝色变成浅蓝色或无色，或者反应后OD_419nm值变小，表明待测样品中含有转基因玉米59122成分。

10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB法提取基因组，作为DNA模板；

②显色反应：将hemin工作液与LAMP引物组合混合，40℃孵育30min，然后添加ABTS显色液和H₂O₂，立即用肉眼观察颜色或利用紫外分光光度计测定OD_419nm值；

显色反应的反应体系为：50μM hemin工作液90μL，10μM引物59122-F3和59122-B3各0.5μL，10μM引物59122-FIP和59122-BIP各4μL，36mM ABTS显色液30μL，30％H₂O₂ 1μL，用dd H₂O补足至总体系130μL；

③环介导等温扩增消光反应：向步骤②显色反应所得混合液中添加16μL扩增试剂，所述扩增试剂包括2.5mM dNTP、7.8mM MgSO₄、1.6M甜菜碱、8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol缓冲液和2μL DNA模板，配制反应体系，然后65℃孵育40min，85℃放置3分钟，最后冰上终止反应；

④目测判定反应前后反应混合液颜色变化，或利用紫外分光光度计测定步骤③所得反应混合液在419nm处的OD值；若颜色由反应前的蓝色变成浅蓝色或无色，或者反应后OD_419nm值变小，表明待测样品中含有转基因玉米59122成分。