基于双阻滞位点特异性PCR的铁皮石斛鉴定方法与流程

本发明涉及生物技术领域中，基于双阻滞位点特异性PCR的铁皮石斛鉴定方法。

背景技术：

铁皮石斛是我国名贵中药材，其应用始载于《神农本草经》，被列为上品。2010年版《中国药典》起将铁皮石斛从石斛中分开，单列一味，记载铁皮石斛来源于兰科石斛属植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力和有效减轻肝损伤等作用。

由于铁皮石斛具有良好的药用、保健价值，市场需求量大，价格昂贵且来源有限，市场上其混淆品屡见不鲜，常出现用石斛属(Dendrobium Sw.)近缘物种鱼目混珠作为“铁皮石斛”的现象。石斛属近缘物种与铁皮石斛形态和化学成分相似，尤其经过加工、运输环节，传统形态学和化学鉴别难以辨其原料真伪。这种在源头处出现的投料植物混杂，以次充好的现象，使得中药材质量不稳定，将严重影响其药效和安全性。

但目前已报道的铁皮石斛鉴定方法多表现为稳定性与重复性差(如RAPD),检测成本高(如AFLP),操作复杂(如ISSR)等缺陷。所以，急需建立一种简便可靠的方法，对铁皮石斛加工制品的原料进行有效的鉴别。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定铁皮石斛。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了石斛分子标记在鉴定或辅助鉴定铁皮石斛中的应用。

本发明所提供的石斛分子标记在鉴定或辅助鉴定铁皮石斛中的应用中，所述石斛分子标记为SNP1和/或SNP2，所述SNP1为石斛属基因组DNA中对应于序列表中序列1的第21位的核苷酸，所述SNP1在铁皮石斛中为G、在石斛属非铁皮石斛中为非G；所述SNP2为石斛属基因组DNA中对应于序列表中序列1的第378位的核苷酸，所述SNP2在铁皮石斛中为A、在石斛属非铁皮石斛中为非A。

其中，序列1的第1位为该序列所示DNA片段的5′端。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的引物对。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的引物对，为能从石斛属基因组DNA中扩增得到所述石斛分子标记的引物对。

所述引物对具有A1的特征或所述引物对为A2；

A1、所述引物对的两条单链DNA分别覆盖所述SNP1和所述SNP2，所述SNP1为G，所述SNP2为A；

A2、由名称分别为TPSH-AS1F和TPSH-AS1R的单链DNA组成的引物对；

所述TPSH-AS1F为如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：

b1)序列表中序列2所示的单链DNA；

b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述TPSH-AS1R为如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：

c1)序列表中序列3所示的单链DNA；

c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

其中，序列2的第1位为该序列所示DNA片段的5′端，序列3的第1位为该序列所示DNA片段互补链的5′端。

上述引物对中，所述引物对的两条单链DNA分别在所述SNP1和所述SNP2的一侧或两侧有一个或几个核苷酸与序列1所示DNA分子的相应位置的核苷酸不配对。

上述引物对中，b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在序列2所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在序列3所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。b3)所述单链DNA可为将序列2的第16-20位进行一个或几个核苷酸的替换，使序列2所示的单链DNA与序列表中序列1的第1-21位所示的单链DNA有一个或几个核苷酸的不同。c3)所述单链DNA可为将序列3的第15-19位进行一个或几个核苷酸的替换，使序列3所示的单链DNA与序列表中序列1的第378-397位所示的单链DNA有一个或几个核苷酸不配对。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列2或序列3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述引物对中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。

上述引物对中，所述TPSH-AS1F和所述TPSH-AS1R可独立包装。所述TPSH-AS1F和所述TPSH-AS1R的摩尔比可为1:1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的系统。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的系统，由所述引物对和M1组成；所述M1为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。

上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可仅为DNA聚合酶，也可为由所述DNA聚合酶与其他进行PCR扩增所需的试剂组成。所述其他进行PCR扩增所需的试剂可为PCR缓冲液、dNTPs和/或水。

上述系统中，所述进行PCR扩增所需的仪器可仅为PCR仪。

上述系统中，所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶具体可为rTaq酶。rTaq酶可为TaKaRa公司产品。所述PCR缓冲液可为TaKaRa公司的10×PCR Buffer。所述dNTPs可为TaKaRa公司产品。

上述系统中，所述PCR仪可为Veriti^TM 96孔梯度PCR仪(Applied Biosystems公司)、GeneAmp9700型PCR仪(Applied Biosystem公司)或TC-512梯度PCR仪(TECHNE公司)。

上述系统中的各试剂均可独立包装。

上述系统也可为仅包括相关试剂的试剂或试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1或H2的方法：

H1、鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；按照如下H11或H12确定所述待测样品是否为铁皮石斛：

H21、检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有397bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为铁皮石斛；如所述PCR产物不含有397bp的DNA片段，所述待测样品非或候选非铁皮石斛；

H22、检测所述PCR产物的序列，如所述PCR产物含有序列1所示的DNA片段，所述待测样品为或候选为铁皮石斛；如所述PCR产物不含有序列1所示的DNA片段，所述待测样品非或候选非铁皮石斛；

H2、鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的方法，包括：检测待测样品基因组DNA中所述SNP1和所述SNP2的核苷酸；

如所述待测样品基因组DNA中所述SNP1为G、且所述SNP2为A，所述待测样品为或候选为铁皮石斛；如所述待测样品基因组DNA中所述SNP1为非G，所述待测样品非或候选非铁皮石斛；如所述待测样品基因组DNA中所述SNP2为非A，所述待测样品非或候选非铁皮石斛。

由于DNA分子由两条互补的单链DNA组成，在检测样品基因组中对应于序列1的第21位核苷酸时，需考虑到该位点的侧翼序列，如果该位点的侧翼序列与序列1的第21位核苷酸的侧翼序列在相同的位置是相同而不是互补关系时(序列1的第378位除外)，检测得到的该位点的核苷酸即为待测样品基因组中对应于序列1的第21位的核苷酸；如果该位点的侧翼序列与序列1的第21位核苷酸的侧翼序列在相同的位置存在互补关系而不相同时(序列1的第378位除外)，与检测得到的该位点的核苷酸存在配对关系的脱氧核苷酸即为待测样品基因组中对应于序列1的第21位的核苷酸。所述相同位置是指待测样品基因组中距离对应于序列1的第21位核苷酸的长度与序列1中距离第21位核苷酸的长度相同的位置，当然，由于序列1长度有限，序列1中距离第21位核苷酸的长度可延伸至序列1未显示而待测样品基因组中实际是序列1第21位核苷酸两侧的序列中。

在检测样品基因组中对应于序列1的第378位核苷酸时，需考虑到该位点的侧翼序列，如果该位点的侧翼序列与序列1的第378位核苷酸的侧翼序列在相同的位置是相同而不是互补关系时(序列1的第21位除外)，检测得到的该位点的核苷酸即为待测样品基因组中对应于序列1的第378位的核苷酸；如果该位点的侧翼序列与序列1的第378位核苷酸的侧翼序列在相同的位置存在互补关系而不相同时(序列1的第21位除外)，与检测得到的该位点的核苷酸存在配对关系的脱氧核苷酸即为待测样品基因组中对应于序列1的第378位的核苷酸。所述相同位置是指待测样品基因组中距离对应于序列1的第378位核苷酸的长度与序列1中距离第378位核苷酸的长度相同的位置，当然，由于序列1长度有限，序列1中距离第378位核苷酸的长度可延伸至序列1未显示而待测样品基因组中实际是序列1第378位核苷酸两侧的序列中。

上述方法中，可利用Taq DNA聚合酶进行所述PCR扩增。

上述方法中，所述PCR扩增的反应体系可包括所述TPSH-AS1F、所述TPSH-AS1R、DNA聚合酶、PCR缓冲液、所述待测样品基因组DNA、dNTPs和水。所述反应体系中所述TPSH-AS1F和所述TPSH-AS1R的浓度均可为0.1μmol。所述待测样品基因组DNA的浓度可为30-0.03ng·μL^-1。所述待测样品基因组DNA的浓度可为30-0.3ng·μL^-1，3ng·μL^-1。所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶具体可为rTaq酶。rTaq酶可为TaKaRa公司产品。所述PCR缓冲液可为TaKaRa公司的10×PCR Buffer。所述dNTPs可为TaKaRa公司产品。

所述反应体系具体可为：2.5μL 10×PCR Buffer，1μL 10mmol·L^-1dNTPs，所述TPSH-AS1F和所述TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各0.25μL，0.2U rTaq酶，1μL所述待测样品基因组DNA，ddH₂O补足25μL。

上述方法中，利用所述引物对进行PCR扩增的退火温度可为58-62℃，如60℃。

上述方法中，所述PCR扩增中变性、退火和延伸可共进行27-36个循环。所述PCR扩增中变性、退火和延伸可共进行30-36个循环。所述PCR扩增中变性、退火和延伸可共进行33个循环。

上述方法中，所述PCR扩增的反应条件具体可为：95℃5min，35个循环(95℃30s，60℃40s，72℃40s)，72℃7min。

上述方法中，所述PCR扩增可利用上述系统中所述PCR仪进行。

上述方法中，检测所述PCR产物的大小具体可通过电泳进行。所述397bp的DNA片段具体可体现为在电泳时250bp和500bp间有一条带。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述石斛分子标记。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、检测所述石斛分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定铁皮石斛中的应用；

X2、检测所述石斛分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定铁皮石斛产品中的应用；

X3、检测所述石斛分子标记的物质在铁皮石斛育种中的应用；

X4、所述石斛分子标记在铁皮石斛育种中的应用；

X5、所述引物对在鉴定或辅助鉴定铁皮石斛中的应用；

X6、所述引物对在制备鉴定或辅助鉴定铁皮石斛产品中的应用；

X7、所述引物对在铁皮石斛育种中的应用；

X8、所述系统在鉴定或辅助鉴定铁皮石斛中的应用；

X9、所述系统在制备鉴定或辅助鉴定铁皮石斛产品中的应用；

X10、所述系统在铁皮石斛育种中的应用；

X11、所述方法在铁皮石斛育种中的应用。

所述产品可为试剂或试剂盒。

本发明通过对铁皮石斛及69种近缘物种共362个样品进行检测，发现了两个存在于铁皮石斛及其近缘物种中的SNP位点，其中一个位点位于铁皮石斛基因组DNA中对应于序列表中序列1的第21位，该位点在铁皮石斛中为G、在铁皮石斛的近缘物种中为非G，另一个位点位于铁皮石斛基因组DNA中对应于序列表中序列1的第378位，该位点在铁皮石斛中为A、在铁皮石斛的近缘物种中为非A。然后制备了引入错配碱基的鉴定铁皮石斛的引物对，建立一种快速、准确的基于双阻滞位点特异性PCR的鉴定铁皮石斛及其加工制品真伪的鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的方法。实验证明，利用本发明的鉴定铁皮石斛的引物对和鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的方法鉴定铁皮石斛的特异性和灵敏度高，可以从铁皮石斛及69种近缘物种中特异地鉴定出铁皮石斛，灵敏度可达0.03ng/μL。利用本发明的基于双阻滞位点特异性PCR的鉴定铁皮石斛及其加工制品真伪的鉴定或辅助鉴定铁皮石斛的方法与鉴定铁皮石斛的引物对可实现铁皮石斛及其近缘物种的准确鉴定，具有操作简便，稳定性好，应用范围广的优点。

附图说明

图1为利用引物对P鉴定铁皮石斛及其近缘物种的双阻滞位点特异性PCR反应示意图。其中，近缘物种是指石斛属中非铁皮石斛。

图2为不同因素对双向阻滞位点特异性PCR的影响。A为退火温度优化结果；B为循环数优化实验结果；C为DNA聚合酶优化实验结果，TaKaRa Taq表示rTaq酶，SpeedSTAR HS Taq DNA Polymerase表示SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，MightyAmp DNA Polymerase表示MightyAmp DNA聚合酶，PrimeSTAR Max DNA Polymerase表示PrimeSTAR HS DNA聚合酶，TaKaRa Ex Taq表示Ex Taq DNA聚合酶；D为PCR优化实验结果。1为来源于安徽的铁皮石斛；2为来源于云南的铁皮石斛；3为来源于安徽的霍山石斛；4为来源于云南的细茎石斛。

图3为利用引物对P进行双向阻滞位点特异性PCR鉴定铁皮石斛与铁皮石斛属近缘物种。A为双向阻滞位点特异性PCR鉴定铁皮石斛与近缘物种，1为铁皮石斛；2为细茎石斛；3为广东石斛；4为霍山石斛；5为河南石斛；6为叠鞘石斛；7为齿瓣石斛；8为美花石斛；9为束花石斛；10为杯鞘石斛；11为串珠石斛；12为肿节石斛；13为长苏石斛；14为密花石斛；15为黑毛石斛；16为竹枝石斛；17为金钗石斛；18为鼓槌石斛；19为报春石斛；20为重唇石斛；21为梵净山石斛；22为长距石斛；23为球花石斛。B为双向阻滞位点特异性PCR鉴定不同产地铁皮石斛，泾县石斛表示来源于泾县的铁皮石斛，霍山铁皮为来源于霍山的铁皮石斛，云南石斛为来源于云南的铁皮石斛，浙江石斛为来源于浙江的铁皮石斛，广西石斛为来源于广西的铁皮石斛。其中M为DNA分子量标准；NTC为空白对照。

图4位引物对P的灵敏度检测结果。其中，M为DNA分子量标准；1为来源于安徽的铁皮石斛；2为来源于云南的铁皮石斛；3为来源于安徽的霍山石斛；4为来源于云南的细茎石斛。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴定铁皮石斛的引物对的制备

本发明的发明人在石斛属33个物种(1、铁皮石斛；2、钩状石斛；3、兜唇石斛；4、短棒石斛；5、长苏石斛；6、翅萼石斛；7、束花石斛；8、鼓槌石斛；9、玫瑰石斛；10、晶帽石斛；11、黄花石斛；12、反瓣石斛；13、流苏石湖；14、棒节石斛；15、曲轴石斛；16、细叶石斛；17、苏瓣石斛；18、疏花石斛；19、重唇石斛；20、美花石斛；21、罗河石斛；22、长距石斛；23、勐海石斛；24、红花石斛；25、藏南石斛；26、杓唇石斛；27、紫瓣石斛；28、肿节石斛；29、单葶草石斛；30、报春石斛；31、华石斛；32、叉唇石斛；33、黑毛石斛)中发现，铁皮石斛基因组DNA中对应于序列表中序列1的第21位为G、第378位为A，而石斛属中非铁皮石斛基因组DNA中对应于序列表中序列1的第21位为非G、第378位为非A，铁皮石斛基因组DNA与石斛属中非铁皮石斛基因组DNA在对应于序列表中序列1所示的DNA片段中除第21位与第378位外均相同。将石斛属的不同物种间基因组DNA中对应于序列表中序列1的第21位的SNP命名为SNP1，将对应于序列表中序列1的第378位的SNP命名为SNP2。其中，序列1的第1位为该序列所示DNA片段的3′端。

根据铁皮石斛基因组DNA与石斛属中非铁皮石斛基因组DNA这两个SNP位点的差异，发明人设计并制备了铁皮石斛双向阻滞位点特异性PCR引物对(鉴定铁皮石斛的引物对)，用于鉴定铁皮石斛，将该引物对命名为引物对P，引物对P由名称分别为TPSH-AS1F和TPSH-AS1R的单链DNA组成，TPSH-AS1F为序列2所示的单链DNA，TPSH-AS1R为序列3所示的单链DNA(图1)。

引物对P中，TPSH-AS1F和TPSH-AS1R的摩尔比为1:1，TPSH-AS1F和TPSH-AS1R均独立包装。

实施例2、鉴定铁皮石斛的引物对的PCR反应体系与条件的确定

DNA的提取：取100mg铁皮石斛(Dendrobium officinale)干燥样品，研磨成细粉后，置于1.5mL离心管中，加入65℃预热的CTAB沉淀液750μL，充分震荡混匀，65℃温育40min，低速离心5min，弃去上清，剩下管内材料按改良CTAB法提取得到样品总DNA，调整样品总DNA至浓度约30ng·μL^-1。

质量检测：用通用引物ITS1(序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(序列为TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR反应以检测模板DNA质量。PCR反应体系为2.5μL10×PCR Buffer，1μL 10mmol·L^－1dNTPs，ITS1和ITS4各0.2μmol，0.5U r Taq酶(5U·μL^－1)，1μL DNA模板。反应在Veriti^TM 96孔梯度PCR仪上进行，反应程序为95℃5min，35个循环(95℃30s，60℃1min，72℃1min 40s)，72℃7min。反应结束后在PCR反应体系内加入5μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1％琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察成像。其中，10×PCR Buffer、dNTPs与rTaq酶均为Takara公司产品。

然后从来自不同产地的铁皮石斛168个样品和69种194个石斛属中铁皮石斛近缘物种共362个样品中随机选取2个铁皮石斛样品(来源于安徽与云南)和2个铁皮石斛近缘物种样品(来源于安徽的霍山石斛与来源于云南的细茎石斛)进行铁皮石斛双向阻滞位点特异性PCR反应，确定实施例1的引物对P的最佳反应体系与反应条件。植物样品采自安徽、云南、广西、浙江、重庆、贵州、西藏、海南、台北、尼泊尔、老挝、越南和泰国，分别由俞年军和金效华鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。

表1、试验材料

其中，物种名称记载在文献(Xu S,Li D,Li J,et al.Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium(Orchidaceae)from mainland Asia[J].PloS one,2015,10(1):e0115168.)和(吉占和，陈心启，罗毅波，等.中国植物志第19卷兰科3[M].北京：科学出版社，1999：75.)中。

1、最佳DNA聚合酶的确定

从如下DNA聚合酶中选出最佳DNA聚合酶/含有DNA聚合酶的试剂：rTaq酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶和2×High-Fidelity Master Mix，各DNA聚合酶与相应体系中的反应缓冲液(即PCR Buffer或Buffer)均为TaKaRa公司产品，2×High-Fidelity Master Mix为北京擎科新业生物技术有限公司产品。各反应体系如下：

反应体系1：2.5μL 10×PCR Buffer，1μL 10mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各0.25μL，0.2U rTaq酶，1μL DNA模板，ddH₂O补足25μL。

反应体系2：2.5μL 10×PCR Buffer，1μL 10mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各0.25μL，0.2U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL DNA模板，ddH₂O补足25μL。

反应体系3：12.5μL 2×Buffer(Ver.2)，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各0.5μL，0.8U MightyAmp DNA聚合酶，1μL DNA模板，ddH₂O补足25μL。

反应体系4：2.5μL 10×PCR Buffer，1μL 10mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各0.25μL，0.2U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，1μL DNA模板，ddH₂O补足25μL。

反应体系5：2.5μL 10×PCR Buffer，1μL 10mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各0.25μL，0.2U Ex Taq DNA聚合酶，1μL DNA模板，ddH₂O补足25μL。

反应体系6：12.5μL 2×High-Fidelity Master Mix,引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R(10μmol·L^-1)各1μL,1μL DNA模板，ddH₂O补足25μL。

将各反应体系置于Veriti^TM 96孔梯度PCR仪上进行PCR反应，反应条件为：95℃5min，35个循环(95℃30s，60℃(退火温度)40s，72℃40s)，72℃7min。反应结束后在PCR反应体系内加入5μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司)观察成像。

2、最佳退火温度的确定

利用步骤1的反应体系1，将步骤1的反应条件中的退火温度分别设为：56℃、58℃、60℃、62℃、64℃，在Veriti^TM 96孔梯度PCR仪上进行PCR反应确定最佳退火温度。

3、最佳循环数的确定

利用步骤1的反应体系1，将步骤1的反应条件中的循环数分别设为：27个循环、30个循环、33个循环、36个循环、39个循环，在Veriti^TM 96孔梯度PCR仪上进行PCR反应确定最佳循环数。

4、最佳PCR仪的确定

利用步骤1的反应体系1与反应条件，将反应体系1分别置于Veriti^TM 96孔梯度PCR仪(Applied Biosystems公司)、GeneAmp9700型PCR仪(Applied Biosystem公司)和TC-512梯度PCR仪(TECHNE公司)中进行PCR反应。

结果发现，退火温度DNA聚合酶对双向阻滞位点特异性PCR具有较大影响，而PCR仪及PCR循环数影响小。结果表明退火温度在58℃-62℃之间时，仅铁皮石斛获得目的特异性条带，退火温度过低时铁皮石斛近缘物种也产生微弱条带，导致假阳性(图2中A)，最佳退火温度为60℃；当循环数为27-36时，仅铁皮石斛出现特异性鉴定条带，而循环数超过39时，铁皮石斛近缘物种也可观测到微弱扩增条带(图2中B)，最佳循环数为33；在所选择的6种DNA聚合酶中，rTaq酶和PrimeSTAR HS DNA聚合酶能实现铁皮石斛与石斛属近缘物种的鉴定(图2中C)，最佳DNA聚合酶为rTaq酶，即最佳反应体系为反应体系1；对不同PCR仪进行考察，表明3种PCR仪均可用于铁皮石斛与石斛属近缘物种的鉴定(图2中D)。

实施例3、鉴定铁皮石斛的引物对的特异性

选取来自不同产地的铁皮石斛168个样品和69种194个石斛属近缘物种共362个样品进行检测鉴定铁皮石斛的引物对的特异性。植物样品采自安徽、云南、广西、浙江、重庆、贵州、西藏、海南、台北、尼泊尔、老挝、越南和泰国，分别由俞年军和金效华鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。

按照实施例2中的DNA提取的方法提取各样品的基因组DNA，按照步骤1中的最佳反应体系(即反应体系1)、最佳退火温度以及最佳循环数利用Veriti^TM 96孔梯度PCR仪、以上述不同样品的基因组DNA为模板进行双向阻滞位点特异性PCR，检测实施例1引物对P的特异性。

结果显示，在铁皮石斛及其同属69个近缘物种中，仅铁皮石斛出现目的条带，近缘物种均无该目的条带(部分结果如图3中A所示)，说明利用引物对P进行双向阻滞位点特异性PCR能专一性鉴定铁皮石斛石斛。对铁皮石斛主产区安徽、云南、浙江、广西的362个样品和来自亳州的22批铁皮石斛枫斗进行鉴定也均可得到特异性鉴定结果(部分结果如图3中B所示)，说明利用引物对P进行双向阻滞位点特异性PCR对铁皮石斛的鉴定适用性强。

实施例4、鉴定铁皮石斛的引物对的灵敏度

从表1的铁皮石斛168个样品和69种194个石斛属近缘物种共362个样品中随机选取2个铁皮石斛样品(来源于安徽与云南)和2个铁皮石斛近缘物种样品(来源于安徽的霍山石斛与来源于云南的细茎石斛)，按照实施例2中的DNA提取的方法提取基因组DNA，并调整各样品的浓度分别为300ng/μL、30ng/μL、3ng/μL、0.3ng/μL、0.03ng/μL。

按照实施例2步骤1中的最佳反应体系(即反应体系1)、最佳退火温度以及最佳循环数利用Veriti^TM 96孔梯度PCR仪、以上述不同浓度的基因组DNA为模板进行双向阻滞位点特异性PCR，检测实施例1引物对P的灵敏度。

结果显示，DNA模板浓度在30-0.03ng·μL^-1时，只有铁皮石斛能扩增出特异性目的条带，且条带亮度随DNA模板浓度降低而减弱，检出限达0.03ng·μL^-1。由结果还可以看出，当DNA模板浓度为300ng·μL^-1时，来源于安徽的霍山石斛与来源于云南的细茎石斛中均出现条带，当DNA模板浓度为30-0.03ng·μL^-1时，仅来源于安徽的铁皮石斛与来源于云南的铁皮石斛有目的条带，表明，鉴定铁皮石斛的引物对在鉴定待测样品时结果的准确性也收到模板浓度的影响，模板浓度为30-0.03ng·μL^-1时，结果更为准确。