基于反应‑扩散模型的多细胞结构的制备方法及制备系统与流程

本发明是一种在扩散反应数学模型引导下通过添加合适的细胞因子来调控多细胞结构和组织体外生长过程的方法,涉及生物制造与组织工程的使能技术,特别是骨组织和软骨组织修复的技术领域。

背景技术：

实现生物组织的修复和再生是组织工程的主要目标。为实现组织乃至器官的功能再生，越来越多的研究人员设计并制造各种人工替代结构体并将其广泛应用于生物组织工程，且此类制造逐渐向着更为复杂和精细的方向发展。具有各种几何结构特征的生物组织(比如气管、血管、淋巴管以及肠等)在高等生物体内广泛存在。此类组织结构体的人造替代物通常需要采用特定的材料在体外构建相应的三维结构体，然后进行相应技术处理，进而得到与体内的组织形状接近的替代物。此类局部组织替代物都需要先制造出由高分子或金属材料等外部材料构成的具备特定几何特征的结构，然后再将其植入体内并与相应的人体组织形成良好连接和融合，进而完成实现人造组织的功能。然而，此类管状结构体虽然制造精细，但由其本身的材料仍是一些人工合成材料(非生物体自身的组织)，因而仍然很有可能引起人体的排异反应以及不可预料的并发症等问题。虽然近年来一些国外研究者运用化合高分子材料结合能够较好抵抗排异反应的生物分子制作出了一些特殊的“印刷墨水”，并利用基于该“印刷墨水”的三维打印技术制造出人工组织替代物，但这种方法的实施过程复杂，且成本很高。

因此，目前有一部分研究工作者通过利用生物体自身细胞的自我组织(self-organizing)特性，构建特定的微环境进行干细胞的体外三维培养，使来源于人体自身的干细胞自组装成一种模拟天然生物组织的多细胞结构，且无需由外部的人工合成材料制备的具有特定几何特征的人工替代物，这样就能够从根本上大大减轻人体的排异反应，并大幅度降低人工组织乃至器官的制造成本。但纯粹的细胞的自组织行为充满了较多的不可控性，一些干细胞经过一段时间的三维培养自组织形成了特定的多细胞结构，但这些多细胞结构的出现通常难以事先预测，具有一定的随机性，这就为组织工程和再生医学领域的具体应用带了限制。

如能够在一定的理论或规律的引导下，通过简单的生物化学操作就能够可控的构建和调节细胞自组织形成的多细胞结构，则对解决上述问题具有积极的推进意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种制备方法，以解决三维多细胞结构的制备及结构形态调控的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种三维多细胞结构的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养；以及

步骤S2，调控多细胞结构形态。

进一步，所述步骤S1中通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养的方法包括如下步骤：

步骤S11，将外源细胞因子，即活化子、阻滞子、基质子按照一定比例混合，并均匀分散于细胞培养基中；

步骤S12，在细胞培养基中加入一定数量的干细胞和凝胶配制组合物进行混合，配制出凝胶前体溶液；

步骤S13，将所述凝胶前提溶液与交联分子溶液以一定的比例混合，经过一定时间的孵育，实现凝胶化；

步骤S14，在三维凝胶体的上方添加适量培养基，进行培养，构成一多细胞结构。

进一步，所述步骤S1中通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养的方法还包括：

重复上述步骤S11至步骤S14，配置含有不同配比的外源细胞因子的细胞培养基，以构成一系列具有不同几何结构特征的多细胞结构。

进一步，所述步骤S2中调控多细胞结构形态的方法包括如下步骤：

步骤S21，构建反应-扩散模型；

步骤S22，通过反应-扩散模型引导，对三维凝胶体中的多细胞结构进行形态调控，以形成所需的多细胞结构。

进一步，所述反应-扩散模型的数学表达式包括：

上式(1)-(3)中

U、V和n分别为活化子，阻滞子和基质子的无量纲浓度；

和分别描述活化子、阻滞子和基质子浓度的扩散程度；

c为活化子的降解率，e为阻滞子的降解率，b为由活化子生产出阻滞子的产出系数；以及式(3)中的为适于表示细胞向化学引诱物浓度更高区域运动的趋化作用项；

K代表U和V通过物理键联进行非线性降解的系数；

D＝D_U/D_V及q＝D_n/D_V分别为活化子对阻滞子，以及细胞对阻滞子的扩散系数之比；

γ为与计算域尺度、生物合成时间尺度以及阻滞子扩散率的关联比例因子；

t为模拟系统的时间，且t＝D_VT/L²,其中

T为试验中细胞培养的时间，L是所涉及的培养物的特征尺度的无量纲单位长度；

r_n为细胞最大增值率的无量纲形式；

ExU、ExV分别为活化子、阻滞子的外源项。

进一步，所述步骤S22中通过反应-扩散模型引导，对三维凝胶体中的多细胞结构进行形态调控，以形成所需的多细胞结构的方法包括如下步骤：

步骤S221，通过共聚焦显微镜对一系列多细胞结构进行拍照，

步骤S222，通过反应-扩散模型模拟出在与一系列多细胞结构相同配置参数条件下的模拟多细胞结构系列；

步骤S223，将培养获得的多细胞结构与模拟多细胞结构分别按照相同配置参数条件对比提取趋势性信息,以调整添加相关外源细胞因子参数。

又一方面，本发明还提供了一种反应-扩散模型，以实现对多细胞结构形态进行调控。

为了解决上述技术问题，本反应-扩散模型的数学表达式包括：

上式(1)-(3)中

U、V和n分别为活化子，阻滞子和基质子的无量纲浓度；

和分别描述活化子、阻滞子和基质子浓度的扩散程度；

c为活化子的降解率，e为阻滞子的降解率，b为由活化子生产出阻滞子的产出系数；以及

式(3)中的为适于表示细胞向化学引诱物浓度更高区域运动的趋化作用项；

K代表U和V通过物理键联进行非线性降解的系数；

D＝D_U/D_V及q＝D_n/D_V分别为活化子对阻滞子，以及细胞对阻滞子的扩散系数之比；

γ为与计算域尺度、生物合成时间尺度以及阻滞子扩散率的关联比例因子；

t为模拟系统的时间，且t＝D_VT/L²,其中

T为试验中细胞培养的时间，L是所涉及的培养物的特征尺度的无量纲单位长度；

r_n为细胞最大增值率的无量纲形式；

ExU、ExV分别为活化子、阻滞子的外源项。

第三方面，本发明还提供了一种三维多细胞结构制备系统，以解决三维多细胞结构的制备及结构形态调控的技术问题。

所述三维多细胞结构制备系统包括：

初步培养单元，通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养，形成一系列具有不同几何结构特征的多细胞结构；

形态调整单元，调控多细胞结构形态。

进一步，所述形态调整单元适于构建反应-扩散模型，且通过反应-扩散模型引导，对三维凝胶体中的多细胞结构进行形态调控，以形成所需的多细胞结构。

进一步，所述反应-扩散模型的数学表达式包括：

上式(1)-(3)中

U、V和n分别为活化子，阻滞子和基质子的无量纲浓度；

和分别描述活化子、阻滞子和基质子浓度的扩散程度；

c为活化子的降解率，e为阻滞子的降解率，b为由活化子生产出阻滞子的产出系数；以及

式(3)中的为适于表示细胞向化学引诱物浓度更高区域运动的趋化作用项；

K代表U和V通过物理键联进行非线性降解的系数；

D＝D_U/D_V及q＝D_n/D_V分别为活化子对阻滞子，以及细胞对阻滞子的扩散系数之比；

γ为与计算域尺度、生物合成时间尺度以及阻滞子扩散率的关联比例因子；

t为模拟系统的时间，且t＝D_VT/L²,其中

T为试验中细胞培养的时间，L是所涉及的培养物的特征尺度的无量纲单位长度；

r_n为细胞最大增值率的无量纲形式；

ExU、ExV分别为活化子、阻滞子的外源项。

本发明的有益效果是，本发明所提出的调控间充质干细胞自组织形成的多细胞结构形貌的方法完全依靠细胞的自组装，省去了目前已有的组织体外构建方法中所必需的外部结构材料及复杂的加工制作工艺，整个制备方法更充分的利用了大量细胞之间的相互通讯能力，并更接近于体内组织的天然形成过程，为人工组织的制备提供了一种更接近体内天然组织、可靠性高的方法。本发明中的多细胞结构完全由细胞构成,不含其它合成材料，能够大大减轻目前人造组织所需的由聚合物等材料制造的替代物所带来排异反应的问题，并能够大幅度降低成本。本发明中的外源细胞因子混合物对多细胞结构的调控作用可以使用细胞三维自组织过程的反应-扩散仿真模型来预测，而且每种细胞因子的不同浓度会取得具有不同结构特征的多细胞结构体，这在一定程度上减少了所需的细胞因子的种类，即仅需少量几种细胞因子即可完成调控出很多种具有不同特征的多细胞微观结构。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明的三维多细胞结构的制备方法的流程图；

图2为本发明实施例中的由细胞因子混合物调控多细胞结构形貌方法的步骤示意图；

图3(a)、图3(b)和图3(c)分别为本发明实施例中组合式细胞因子对间充质干细胞的作用结果示例图；

图4反应-扩散模型引导下通过施加细胞因子制备及调控三维多细胞结构的方法流程实施例图示。

以上的图中有：

活化子01、阻滞子02、干细胞03、基质子(底物)04、细而疏的多细胞结构11、粗而密的多细胞结构12、分布式球形多细胞结构13，其包括单个球形结构131，以及相邻球体之间发散出的条状多细胞结构132、133；

试验操作程序21、添加细胞因子或者组合式细胞因子的步骤22、多细胞结构系列23、所期望的多细胞结构24、依据反应扩散模型进行计算机仿真的步骤25、模拟得出的多细胞结构系列26、知识库27。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

本发明的原理是通过外源细胞因子构建三维凝胶系统，并通过特定方式向该凝胶系统添加相应干细胞，进而逐步使得其内部的间充质干细胞的自组织过程发生改变；另一方面，通过构建一种反应-扩散数学模型，来近似模拟正在钙化的间充质干细胞03(以下简称细胞)的自组织行为，并与试验结构对照，进而为下一次试验提供趋势性引导。如此反复多次，直至使得试验中所形成的多细胞结构的形貌也发生预期变化,并趋近于目标结构形式。

实施例1

本实施例中，用于细胞三维培养的细胞外基质为改性的透明质酸水凝胶。通过调节水凝胶内大分子或者连接肽链的浓度，可以构建出具有不同机械特性和不同的蛋白分子扩散率的三维凝胶体。本实施例中采用处于初步钙化状态的间充质干细胞03，因为其具有更强的聚集和结构成形能力，且其可分化成软骨、成骨细胞。细胞在凝胶中的密度是均匀的,各种多细胞结构也是基本均匀分布在三维凝胶体内。通过将细胞因子的溶液均匀添加至培养液中，即可在三维空间内使得整个三维多细胞结构的各局部位置产生不同变化。

如图1所示，本实施例1提供了一种三维多细胞结构的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养；以及

步骤S2，调控多细胞结构形态。

具体的，所述步骤S1中通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养的方法包括如下步骤：

步骤S11，将外源细胞因子，即活化子、阻滞子、基质子按照一定比例混合，并均匀分散于细胞培养基中；所述活化子可以为BMP-2和BMP-4,阻滞子为MGP，基质子为Noggin。这里的活化子是一个等效物理概念，其等效于多种起活化作用的分子的综合作用效果。同理，阻滞子和基质子(一种蛋白分子)也是相应的等效物理概念。细胞在三维凝胶中的自组织过程；

具体的，将Transforming growth factor(TGF)-beta超家族中的Bone morphogenetic proteins(BMP)-2蛋白和BMP-4蛋白、以及Noggin蛋白和Matrix gla protein(MGP)蛋白等按照一定的比例混合，并均匀分散于细胞培养基中。根据具体需要改变配比，可配制多组。

步骤S12，在细胞培养基中加入一定数量的干细胞和凝胶配制组合物进行混合，配制出凝胶前体溶液；具体的，将聚合物主干大分子、黏附蛋白及一定数量初步钙化的间充质干细胞按照一定比例进行混合，配制出凝胶前体溶液。

步骤S13，将所述凝胶前提溶液与交联分子溶液以一定的比例混合，经过一定时间的孵育，实现凝胶化。

步骤S14，在三维凝胶体的上方添加适量培养基，然后置入37度培养箱中进行培养，在一定时间长度之后(几小时至若干天)构成一多细胞结构。

本发明利用三维凝胶系统中的大分子反应扩散过程中的图灵不稳定性，经过一定时间的细胞三维培养，使得活化子和阻滞子的浓度在凝胶内部的均匀分布状态被打破，并逐渐构建出许多分布的活化子局部高浓度区域，这些高浓度局部区域的几何形状可以是线状、椭球状，或不规则形状等(这些图形可称为三维图灵斑图，这里简称细胞聚集区域)。在此之后，利用细胞的趋化移动特性(趋向于活化子浓度高的区域)和扩散移动特性，使得大量细胞逐渐继续向细胞聚集区域聚集，或者向着远离当前细胞聚集区域的方向扩散迁移。随着细胞向各方向扩散，这使得细胞在某些位置有向外分散的趋势；另一方面，趋化作用同时使得细胞向着活化子密集的位置迁移，这样亦会使得细胞在局部位置有聚集的趋势。于此同时，由活化子和细胞作用而生成的阻滞子亦会反过来削弱活化子的自催化生成过程，进而使得细胞的局部聚集产生削弱的趋势。在以上各个作用过程按照一定的时序规律的动态作用下，各个位置点处细胞的迁移逐渐趋于稳定，并使得细胞自组织过程逐渐趋向于收敛(即结构的变化越来越缓慢，并逐渐趋向于确定的图样)。

所述步骤S1中通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养的方法还包括：

重复上述步骤S11至步骤S14，配置含有不同配比的外源细胞因子的细胞培养基，以构成一系列具有不同几何结构特征的多细胞结构。

所述步骤S2中调控多细胞结构形态的方法包括如下步骤：

步骤S21，构建反应-扩散模型；

步骤S22，通过反应-扩散模型引导，对三维凝胶体中的多细胞结构进行形态调控，以形成所需的多细胞结构。

本发明通过对生物系统中图灵不稳定性原理的利用，特别是对图灵不稳定性导致的活化子、阻滞子(二者统称为成形素)的反应扩散过程进行引导和调控，具体表现在添加可以作为活化子或者阻滞子的外源细胞因子和/或其他可以影响成形素反应扩散过程的外源细胞因子；以及通过反应-扩散系统的模型可以从侧面对细胞多细胞结构的自组织形貌进行定性预测，并为试验中的多细胞结构构建与调控提供趋势性的引导。

所述反应-扩散模型的数学表达式包括：

上式(1)-(3)中

U、V和n分别为活化子，阻滞子和基质子的无量纲浓度；

和分别描述活化子、阻滞子和基质子浓度的扩散程度；

c为活化子的降解率，e为阻滞子的降解率，b为由活化子生产出阻滞子的产出系数；以及

式(3)中的为适于表示细胞向化学引诱物浓度更高区域运动的趋化作用项；

K代表U和V通过物理键联进行非线性降解的系数；

D＝D_U/D_V及q＝D_n/D_V分别为活化子对阻滞子，以及细胞对阻滞子的扩散系数之比；

γ为与计算域尺度、生物合成时间尺度以及阻滞子扩散率的关联比例因子；

t为模拟系统的时间(无量纲)，且t＝D_VT/L²,其中

T为试验中细胞培养的时间，L是所涉及的培养物的特征尺度的无量纲单位长度；

r_n(r_n＝L²R_N/D_h)是细胞最大增值率(R_N)的无量纲形式，阻滞子的扩散率D_h近似设为1×10^-7cm²/s；

ExU、ExV分别为活化子、阻滞子的外源项。

所述步骤S22中通过反应-扩散模型引导，对三维凝胶体中的多细胞结构进行形态调控，以形成所需的多细胞结构的方法包括如下步骤：

步骤S221，通过共聚焦显微镜对一系列多细胞结构进行拍照，

步骤S222，通过反应-扩散模型模拟出在与一系列多细胞结构相同配置参数条件下的模拟多细胞结构系列；其中配制参数除了细胞因子的配比，还包括细胞因子的添加随时间的变化、以及凝胶结构密度和培养时长等因素。

步骤S223，将培养获得的多细胞结构与模拟多细胞结构分别按照相同配比条件对比提取趋势性信息,以调整添加相关外源细胞因子参数。

本实施例中，通过均匀的添加外源细胞因子以改变三维多细胞结构的整体形态。当单独添加单一的外源细胞因子时，比如Noggin、BMP2或BMP4时，三维多细胞结构体的形态在每一种外源蛋白的作用下，会出现各自的独特的几何结构特征。尽管凝胶基质中均匀分布的外部添加的外源细胞因子对每个细胞的影响是等同的，但是不同区域的细胞的运动响应却是不同的。在未添加任何外源细胞因子时，血管间充质干细胞所形成的是蜂巢状的三维多细胞结构11，此时细胞之间紧密的连接在一起，并且交织在一起，形成的网络状多细胞结构是细小而稀疏的，大量细胞之间仍存在很多中空区域(图3)。当按照一定的时序规律添加一种或两种外源因子后，例如以逐天递增的方式添加Noggin，或者以逐天递增的方式添加noggin与少量BMP2/BMP4的混合物之后，多细胞结构12聚集程度更高，且出现局部连接粗大的特征,其形成的网络状多细胞结构是相对粗大而且密集的(参见图3)；在添加了外源细胞因子BMP2(200-500ng/ml)后，可促使样品在十几天之后出现直径约为200微米的三维球形多细胞结构131，每个球体包含紧密排列的几千甚至上万个细胞，且大多数相邻球体之间有发散出的条状多细胞结构132、133相连。当降低凝胶内交联分子的密度并添加浓度为0.1-0.5μg/ml的BMP2之后，间充质干细胞亦可以形成具有分布式的聚集体的多细胞结构(类似图3中的显微图案13)。

实施例2

在实施例1基础上，本实施例2提供了一种三维多细胞结构制备系统，包括：

初步培养单元，通过构建的三维凝胶系统对干细胞进行体外培养，形成一系列具有不同几何结构特征的多细胞结构；以及形态调整单元，调控多细胞结构形态。

所述形态调整单元适于构建反应-扩散模型，且通过反应-扩散模型引导，对三维凝胶体中的多细胞结构进行形态调控，以形成所需的多细胞结构。

反应-扩散模型的数学表达式如实施例1所述。

本发明中本通过在反应-扩散模型引导下通过施加外源细胞因子制备三维多细胞结构以及调控多细胞结构三维结构特征的方法的流程实施例参见图4。

在水凝胶内制备和调控多细胞结构的形状或功能时，首先在前期研究建立的知识库和参数的基础上，通过既定的试验操作程序21制作样品，并经过添加相应的外源细胞因子或者多种外源细胞因子的组合的步骤22，然后进行细胞的体外三维培养，并得到多细胞结构系列23，若此时未得到所期望的多细胞结构24；故而此时结合前面的一系列试验结果，再使用上述反应-扩散模型进行计算机仿真的步骤25，得出模拟的多细胞结构系列26,此时从模拟出的一系列多细胞结构中提取有用的趋势性信息(即变化某个或者多个外源性细胞因子的浓度可使得当前的多细胞结构类型更易于变为预期结构)，反馈给试验的前端流程部分(即添加细胞因子之前的操作部分)，然后采用改进的试验参数进行相应的系列化多细胞结构的三维培养；若之后还未得到所期望的所细胞结构24，则重复上述流程，继续进行仿真模拟，从仿真模型中挖掘多细胞结构的变化趋势和参数值之间的定性关系，并将此信息反馈给试验的前段流程部分。经过若干次上述过程的循环之后，所期望的多细胞结构14即可得到。然后，将从上述反复多次的过程中提取的关键规律性信息导入知识库27，根据更新之后的知识库，对试验操作程序21和计算机仿真步骤25进行改进。

上述流程中的试验操作程序21包括细胞的增殖、凝胶的前体溶液和交联分子溶液的配制、凝胶形成的操作流程以及细胞的包裹。依据反应扩散模型进行计算机仿真的步骤25包括模型的设定和参数的设置(活化子饱和速率、阻滞子生成或降解速率以及基质子生成或降解的速率等)，以及结合前面一系列试验结果对模型进行的改良。知识库27包括：活化子、阻滞子或基质子的扩散率、降解率以及细胞趋化迁移率、凝胶密度和均匀度、细胞初始浓度分布及外加细胞因子对三维多细胞结构形貌的影响规律；其他已知的物理化学和生物规律，比如活化子自催化生成时的饱和过程、细胞的趋化运动性和增殖规律；模型中特定参数值与模拟得出的整体或局部结构特征尺寸之间的关系等。

本实施例1和实施例2中，水凝胶例如但不限于选择纤维蛋白凝胶、基底膜基质凝胶或透明质酸凝胶，或者其他种类的适于细胞生长的水凝胶。干细胞种类可以选择初步钙化的间充质干细胞或其与上皮细胞或内皮细胞的组合。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。