本发明涉及微生物发酵培养技术领域，尤其涉及一种核糖霉素发酵液的制备方法。
背景技术：
核糖霉素是采用核糖苷链霉菌(streptomycesribosidificus)所产生一种氨基糖苷类抗生素，其化学结构式如下所示：
核糖霉素特点是耳、肾毒性甚低,为目前已发现所有的氨糖类抗生素中毒性最低的一个，因此，被用于治疗对本品敏感的链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌属、肺炎球菌、肺炎杆菌所致的呼吸道感染、尿路感染、胆道感染等。因核糖霉素生产工程复杂，尤其是发酵工艺比较复杂，因此，全球能够工业化生产的发酵培养基配方和发酵生产工艺不多，也未见有公开的文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种高效制备核糖霉素发酵液的制备方法，用以实现对核糖霉素发酵液的高效制备，同时防止杂质的产生。
为实现上述目的，本发明提供了一种核糖霉素发酵液的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将核糖苷链霉菌接种于斜面培养基上，于35～45℃下，湿度为40～60％Rh，培养5～8天；
步骤(2)、挑选成熟斜面接种于种子培养基上，于30～35℃下，转速200～300rmp下在摇床上培养40～60h；
步骤(3)、按5～10％的接种量接种于发酵摇瓶的摇瓶培养基上，于30℃下，发酵摇瓶震荡恒温培养160h；
步骤(4)、植入发酵罐中并向发酵罐中添加发酵培养基并发酵100～130h，发酵罐的温度为30～35℃，压力0.01～0.05MPa，放罐，即得核糖霉素发酵液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的斜面培养基的组分为：淀粉1.0～3g/L，硝酸钾0.05～2g/L，氯化钠0.01～0.1g/L，硫酸镁0.01～0.1g/L，磷酸二氢钾0.01～0.1g/L，硫酸亚铁溶液0.001～0.003g/L，饴糖0.5～1.2g/L，琼脂1.0～3g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的种子培养基的组分为：淀粉2.0～5.0g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，饴糖0.5～1.2g/L，硫酸铵0.1～0.5g/L，黄豆饼粉1.0～5g/L，轻质碳酸钙0.1～0.5g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(4)中的摇瓶培养基的组分为：淀粉4.0～7.0g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，饴糖3～7g/L，硫酸铵0.1～0.5g/L，黄豆饼粉1.0～5g/L，轻质碳酸钙0.1～0.5g/L，5％醋酸锌0.005～0.03g/L，磷酸二氢钾0.005～0.03g/L，余量为水。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(4)中的发酵培养基的组分为：黄豆饼粉2～5g/L，淀粉3～7g/L，氯化钠0.08～0.3g/L，饴糖4～8g/L，硫酸铵0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.005～0.015g/L，碳酸钙0.1～0.5g/L，硫酸锌0.005～0.015g/L，淀粉酶0.01～0.03g/L，豆油0.1～0.3g/L，醋酸钠0.03～0.06g/L，余量为水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在本发明中，通过改进和优化培养基配方，使被选用的核糖霉素生产菌株能够充分发掘自身产生抗生素的能力，同时降低其他杂质的产生，从而实现工业化生产。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。“VVM”为通气量单位(air volume/culture volume/min)，并具体为单位时间内(通常为每分钟)通入到发酵容器(例如“发酵罐”)的气体体积。“g/L”为培养基中各组分的含量单位。
一种核糖霉素发酵液的制备方法，包括以下步骤。
步骤(1)、将核糖苷链霉菌接种于斜面培养基上。将合格的砂土孢子均匀接种于斜面培养基上，力求成单个菌落，于35℃下，恒温培养8天，湿度40～60％Rh。在琼脂培养基上首先呈白色，再逐步变为灰色，形态为馒头形，亦可用砂土或优良菌株分离平皿，培养成熟。成熟的斜面孢子外观呈鼠灰色，形态为馒头形，无菌合格，可放置2～4℃冰箱中保存不超过30天，经无菌检查生产力测定后备用。该斜面培养基的组分为：淀粉1.0～3g/L，硝酸钾0.05～2g/L，氯化钠0.01～0.1g/L，硫酸镁0.01～0.1g/L，磷酸二氢钾0.01～0.1g/L，硫酸亚铁溶液0.001～0.003g/L，饴糖0.5～1.2g/L，琼脂1.0～3g/L，余量为水。
需要说明的是，本实施例中，以核糖苷链霉菌为起始物发酵培养核糖霉素，当然也可以以其他生产核糖霉素的链霉菌属为生产菌株为起始物发酵培养核糖霉素。
步骤(2)、挑选成熟斜面接种于种子培养基上，于30～35℃下，在转速为200～300rmp的摇床上培养40～60h。空白斜面的制备同装填有斜面培养基的母瓶，装量50ml/瓶，在合格母斜面上挑起正常饱满的单个菌落涂布于空白的种子培养基上，35℃恒温培养60h，湿度40～60％Rh，成熟的子瓶斜面是孢子层厚，呈鼠灰色，有少量小白点，可放置2～4℃冰箱中保存不超过30天，经无菌检查生产力测定后备用。空气流量：1:3VVM～1:4VVM。该种子培养基的组分为：淀粉2.0～5.0g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，饴糖0.5～1.2g/L，硫酸铵0.1～0.5g/L，黄豆饼粉1.0～5g/L，轻质碳酸钙0.1～0.5g/L，余量为水。
步骤(3)、按5～10％的接种量接种于发酵摇瓶的摇瓶培养基上，于30℃下，发酵摇瓶震荡恒温培养160h。按工艺配方准确称量，纯水配制浓度为20wt％NaOH溶液调节体系pH至7.2，分装60ml/500ml/瓶，包扎，经0.05MPa，118～120℃湿热灭菌30min，选取合格的种子瓶斜面，在无菌条件下用无菌铲挖块接种于摇瓶内，置于30℃下，在转速为220rpm的摇床上振荡培养40～46h，生长成熟的种子瓶应是菌丝挂壁、稠状、菌浓值达35～55％备用。使用显微镜观察菌丝粗壮、舒展、无游离孢子，即可投入发酵摇瓶中继续培养。空气流量：1:31.7VVM～1:1.8VVM。摇瓶培养基的组分为：淀粉4.0～7.0g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，饴糖3～7g/L，硫酸铵0.1～0.5g/L，黄豆饼粉1.0～5g/L，轻质碳酸钙0.1～0.5g/L，5％醋酸锌0.005～0.03g/L，磷酸二氢钾0.005～0.03g/L，余量为水。
步骤(4)、植入发酵罐中并向发酵罐中添加发酵培养基并发酵100～130h，发酵罐的温度为30～35℃，压力0.01～0.05MPa，放罐，即得核糖霉素发酵液。按工艺配方准确称量，纯水配制浓度为20wt％的NaOH溶液调节体系pH至7.2，分装50ml/500ml/瓶，包扎，经0.05MPa，118～120℃湿热灭菌30min,在无菌条件下，按5-10％的接种量，用无菌吸管接种至发酵摇瓶中，于30℃下，在转速为220rpm的摇床上振荡恒温培养168h后，放瓶测生产力。空气流量：1:1VVM。该发酵培养基的组分为：黄豆饼粉2～5g/L，淀粉3～7g/L，氯化钠0.08～0.3g/L，饴糖4～8g/L，硫酸铵0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.005～0.015g/L，碳酸钙0.1～0.5g/L，硫酸锌0.005～0.015g/L，淀粉酶0.01～0.03g/L，豆油0.1～0.3g/L，醋酸钠0.03～0.06g/L，余量为水。
在本实施例中，最终制备得到的核糖霉素发酵液中的有效成分，即核糖霉素的含量可达95％以上。
同时，在发酵罐的发酵过程中，还可进行中间补料。发酵罐中的发酵中期如菌浓高于25％，可适量补入0.5m3左右纯水，直至发酵结束。灭菌后培养基冷却到32±0.5℃，方可接入核糖苷链霉菌。斜面培养基、种子培养基与摇瓶培养基均采用火焰接种；发酵罐通过移种管道，由压差将长好的种子液输入。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。