一种鉴定锁阳的方法与流程

本发明涉及一种鉴定锁阳品种的方法，特别涉及一种利用ITS序列鉴定锁阳品种的方法，属于植物物种鉴定技术领域。

技术背景

锁阳(Cynomorium songaricum Rupr)为锁阳科全寄生种子植物，多寄生于蒺藜科白刺属植物根部^[1]，锁阳主要分布于我国青海、甘肃、新疆、内蒙古、宁夏等地区的半荒漠或荒漠地带^[2]，药用部位为其除去花序的肉质茎，是中、蒙药中常用的重要药材，用作补肾、助阳、益精、润肠药物，主治阳痿遗精、腰膝酸软、肠燥便秘^[3]。近年来，由于锁阳价格不断上升，药材市场上出现地黄(Rehmannine Radix)、湖北地黄(Rehmannia henryi N.E.Brown)、裂叶地黄(R.piasezkii Maxim)等混伪品^[4]，另外，锁阳又常被做为肉苁蓉(Cistanches Herba)的伪品使用^[5]，严重影响了中药的使用安全。

DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术，已经成功用于生物物种分类和鉴定、生态学、分子系统发育与进化和生物多样性评估等研究领域，为现代生物学研究提供了丰富的分子信息和标准的数据平台，为植物遗传多样性检测提供了更直接、更精确的方法，即直接检测序列本身的变化，目前成为了最有效的遗传学分析方法^[7-8]。ITS序列位于高等植物中核糖体的rRNA基因(rDNA)，是高度重复的串联序列单位，由18SrDNA、5.8SrDNA、26SrDNA及位于三者之间的基因内转录间隔区(ITS)组成，而18S、5.8S、26SrDNA的序列非常保守，可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序。而且被子植物的ITS区长度比较稳定，包括5.8SrDNA在内，总长度一般只有600-700bp。已广泛应用于植物系统学研究，其碱基序列同源性的程度决定生物之间的亲缘关系远近^[9-10]。

目前锁阳的品种鉴定仅限于传统的中药材鉴定方法，如形态、显微结构、超微结构和化学指纹图谱等，但是这些传统的鉴定方法都有其自身缺点。对于形状相似的近缘种，药材形态性状鉴定难以区分，而且植物形态性状易受地理环境、生长期、贮存条件诸多因素的影响，从而影响鉴定的准确性；化学分析方法会因中药活性成分的含量受到其生理条件、采收时间、贮藏等因素的影响，同时对化学成分相似的物种也较难以区分；HPLC、CE、MS等化学分析仪器设备价格昂贵，非一般实验室能够负担。依靠传统的形态分类学方法在锁阳的鉴别上存在着局限性。

技术实现要素：

为了克服锁阳在形态学上鉴定的缺陷，本发明针对目前存在的锁阳真伪问题，将条形码技术应用于鉴别锁阳品种，通过扩增ITS序列和对其进行分析，从分子水平探讨它们之间的亲缘关系，进而提供一种鉴别锁阳的核苷酸序列及鉴别锁阳的方法，从DNA分子水平上分析锁阳种质资源的遗传特征，为鉴定锁阳提供有效的分子标记。

rDNA的ITS序列长度相对较短，对于生药饮片、粉末、标本、长期贮藏的中药材及样品DNA已部分降解的材料而言，ITS序列表现出较高的PCR扩增和测序效率。另外，ITS具备二级结构，为锁阳物种鉴别提供独特的分子形态特征。本发明首次运用ITS序列鉴别中药锁阳及其混伪品，该方法操作简便、用量少、实用性强，可以快速、准确的鉴别开锁阳及其混伪品，适于广泛推广应用。

具体而言，本发明提供以下各项：

1.一种鉴定锁阳的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从样本中提取基因组总DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用用于扩增ITS序列的特异性引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行测序；

(4)对测序结果进行序列比对和聚类分析，绘制系统发育树；

(5)根据序列比对和/或聚类分析结果鉴定锁阳品种。

2.根据1所述的方法，其中，所述ITS序列是锁阳的rDNA ITS序列，是位于锁阳18S和26S之间的DNA序列。

3.根据1所述的方法，所述ITS序列的核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列，或与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有T627C突变的序列。

4.根据1所述的方法，所述引物对包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列。

5.根据1所述的方法，所述序列比对和聚类分析分别利用DNAMAN3.0、Mega5.0软件进行。

6.一种用于鉴定锁阳的分子标记物，所述分子标记物是锁阳ITS序列。

7.根据6所述的分子标记物，所述ITS序列是锁阳的rDNAITS序列，是位于锁阳18S和26S之间的DNA序列。

8.根据6所述的分子标记物，所述ITS序列的核苷酸序列是如SEQ IDNO：1所示的序列，或与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有T627C突变的序列。

9.根据6所述的分子标记物，所述ITS序列由引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3扩增。

10.一种鉴定锁阳的试剂盒，其包括用于扩增ITS序列的引物对，优选所述引物对包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明提供的来源于锁阳的ITS序列，可用作对照鉴别锁阳通过在DNA水平上分析锁阳的遗传特征，为区分锁阳及其伪品等提供了有效的分子标记，为锁阳的品种真伪鉴定以及筛选优良品种等奠定了基础。

同时，本发明提供的利用上述ITS序列鉴别锁阳的方法，操作简单易行，可达到方便、快速、客观、准确区分锁阳与其他伪品种的目的。与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于锁阳品种的鉴定。

附图说明

图1为锁阳基因组电泳图谱。

其中，M为Maker Trans 2K(北京全式金生物技术有限公司)，泳道编号表示锁阳样品来源：1：张掖；2：高台；3：瓜州；4：肃北；5：德令哈；6：格尔木；7：贵德。

图2为利用本发明的引物对PCR扩增锁阳样品材料的产物的电泳图谱。其中，M为Trank2K(北京全式金生物技术有限公司)，泳道编号表示锁阳样品来源：1：张掖；2：高台；3：瓜州；4：肃北；5：德令哈；6：格尔木；7：贵德。

图3为不同产地锁阳材料ITS序列比对结果图。

图4为不同产地锁阳材料ITS序列聚类分析结果图。

图5为肉苁蓉、地黄和锁阳的PCR产物电泳图谱。其中，M为Trank2K(北京全式金生物技术有限公司)，泳道编号表示锁阳样品来源：1-2：肉苁蓉；3-4：地黄；5-6：锁阳(张掖产地)；7-8：锁阳(高台产地)

图6为肉苁蓉、地黄和锁阳的ITS序列序列比对结果图。其中zhangye：为锁阳(张掖产地)；gaotai：为锁阳(高台产地)；C.deserticola：肉苁蓉；R.glutinosa：地黄。

图7为肉苁蓉、地黄和锁阳的ITS序列聚类分析结果图。其中C.songaricum-zhangye：为锁阳(张掖产地)；C.songaricum-gaotai：锁阳(高台产地)；C.deserticola：肉苁蓉；R.glutinosa：地黄。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是本发明的优选例，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行变化与改进，均落入本发明的保护范围内。

实施例1

本实施例测定了来自7个产地锁阳的核糖体DNA ITS序列(张掖、高台、瓜州、肃北、德令哈、格尔木、贵德)，步骤如下：

1、样品的采集及处理

采用当年生的成熟的锁阳肉质茎(当地采集)作为提取基因组DNA的材料，切割成小部分片段后放入由吸水纸制作的密封袋中，并放在装有硅胶的干燥盒中进行干燥。

2、基因组总DNA的提取

采用北京百泰克生物技术有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(DP3111)

(1)将Buffer P1放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度0.2％。

(2)加热Buffer P1到65℃预热灭菌去离子水。

(3)取30mg左右锁阳肉质茎放置在2ml离心管中，在植物高速组织研磨仪中充分研磨成粉末。

(4)加入550ul 65℃预热Buffer P1(已加入β-巯基乙醇到终浓度0.2％)和4ul RnaseA剧烈涡旋震荡混匀1min，室温放置10min。

(5)加入130ul的Buffer P2，充分混匀，12,000rpm离心3min。

(6)小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要吸到界面物质，12,000rpm离心1min，收集下液。

(7)加入1.5倍体积的Buffer P3立刻轻柔涡旋，充分混匀。

(8)将上一步所得到的混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(9)加入700ul漂洗液WB(先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1min，弃掉废液。

(10)加入500ul漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃掉废液。

(11)将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心3-5min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(12)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入50ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热)，室温放置3-5min，12,000rpm离心1min收集DNA。收集的DNA样品放置-20℃备用。

3、锁阳基因组质量的检测

用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测所提锁阳基因组的质量，电泳120V，跑胶30min。结果如图1所示，DNA提取效果良好，基因组完整，符合接下来试验所需。

4、PCR扩增

通过文献分析及试验研究，选取锁阳核基因ITS，即位于18S和28SrRNA间的DNA序列片段作为检测目的序列，设计出本发明中锁阳ITS的PCR扩增引物。

正向引物Primer F所示和反向引物Primer R分别所示如下：

Primer F：5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’(SEQ ID NO：2)

Primer R：5’TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC 3’(SEQ ID NO：3)

以上述步骤1和2提取的总基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：

PCR反应体系如下所示：

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min40s，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。

PCR产物检测

PCR反应产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳来检测是否成功扩增了候选序列，取7ul的PCR反应产物，DNA Maker上样7ul，120v，30min。结果如图2所示，结果显示，各个PCR产物大小在750bp，与预期符合。

PCR反应产物序列测定

将PCR扩增产物直接送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，以保证数据的准确性。测序结果发现七个产地锁阳的ITS序列基本上完全一致，仅张掖的锁阳与其他地区存在一个变异位点，其中，来自高台、瓜州、肃北、德令哈、格尔木、贵德的锁阳样品2、3、4、5、6、7的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5、DNA序列数据分析

根据rDNA ITS测序结果，利用Contig Express软件(InforMax，Frederick，Md.)对测序结果进行拼接，BioEdit软件(Carlsbad，CA)去除引物以及不确定序列，利用DNAMAN3.0(Lynnon Corporation，Quebec，Canada)软件进行序列比对，序列比对结果如图3所示，利用MEGA软件(version 5.0，www.megasoftware.net)，绘制系统发育树，聚类结果如图所示4所示。不同产地锁阳的ITS序列没有差别，仅存在一个变异位点，同源率几近于为100％。张掖市样本与NCBI数据库锁阳ITS序列完全一致，其他地区样品ITS序列与其仅存在一个碱基的差异。

实施例2

与实施例1的区别仅在于将植物原料替换为肉苁蓉以及地黄的块茎，制得样品肉苁蓉和地黄的基因组DNA。通过PCR扩增获得其ITS序列，PCR反应产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳来检测是否成功扩增了候选序列，取7ul的PCR反应产物，DNA Maker上样7ul，120v，30min。结果如图5所示，结果显示，各个PCR产物大小在750bp，与预期符合。将PCR产物直接送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。所得地黄的ITS序列与张掖、和高台的锁阳进行对比和聚类分析，序列比对结果如图6所示，序列比对同源率大于95％，可以看作来源于同一物种，从而可以根据比对结果区分不同的种质资源，达到鉴别锁阳的目的。聚类结果如图7所示，张掖产地与高台产地的锁阳同源率100％，聚为一支，肉苁蓉与地黄聚为一支，但与锁阳同源性相差较远，从而与锁阳区分开来。结果表明肉苁蓉和地黄的序列与锁阳存在显著差异。综上，用本发明的方法可以有效鉴别锁阳。

可见本发明开发出的ITS特异性片段适合作为鉴别锁阳品种的条形码序列，对于规范锁阳药材的使用具有重要意义。

参考文献

[1]马建滨，都玉蓉.锁阳的化学成分及药理作用[J].青海师范大学学报：自然科学版，2008，2008(2)：72-75.

[2]崔树德，等.中药大全[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版社：1997：574-575.

[3]中国药典，2005年版[S].一部.2005：241.

[4]焦福贵，姚强.地黄及其伪品锁阳的生药鉴别[J].现代中药研究与实践，2000(2)：21-21.

[5]黄敏，柳刚.肉苁蓉与其易混品锁阳的鉴别研究[J].湖北中医杂志，2004，26(6)：54-55.

[6]Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al.Biological identificationsthrough DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society B BiologicalSciences，2003，270(1512)：313--321.

[7]高连明，刘杰，蔡杰，等.关于植物DNA条形码研究技术规范[J].植物分类与资源学报，2012，34(6)：592-606.

[8]裴男才，陈步峰.生物DNA条形码：十年发展历程、研究尺度和功能[J].生物多样性，2013，21(5)：616-627.

[9]谢晖，晁志，霍克克，等.9种柴胡属植物的核糖体ITS序列及其在药材鉴定中的应用[J].南方医科大学学报，2006，26(10)：1460-1463.

[10]赵欢，吴卫，郑有良，等.核糖体DNA ITS序列分析在药用植物研究中的应用[J].时珍国医国药，2009，20(4)：959-962.

SEQUENCE LISTING

<110> 中国环境科学研究院

<120> 一种鉴定锁阳的方法

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