本发明属于白菜类作物分子育种
技术领域：
，具体涉及一种用于白菜类作物抽薹开花鉴定的SNP标记。
背景技术：
：白菜类作物包括大白菜、小白菜、菜薹、水菜、乌塌菜、芜菁等多种类型的蔬菜作物以及作为油料作物的白菜型油菜，在全世界范围内栽培广泛，历史悠久。抽薹开花是白菜类作物的重要农艺性状之一，抽薹开花的时间直接影响白菜类作物的商品品质。在我国的春季及高寒地区的秋冬白菜类作物的生产栽培中，遭遇低温常常会导致先期抽薹开花，使得其完全丧失商品性，成为困扰生产的一大难题。提高品种的耐先期抽薹性一直以来就是白菜类蔬菜的重要育种目标。FLC是开花抑制因子，参与了植物开花调控网络中的春化路径和自主路径，在营养生长向生殖生长转换的调控网络中起到重要作用。低温可以抑制FLC基因的表达，从而解除FLC对开花的抑制作用，使得植物开花。FLC基因丧失功能会导致植物对低温的要求降低，不需要经历低温抑制FLC基因表达的过程，从而表现为早开花。白菜的祖先在与拟南芥分化后经历了基因组三倍化的过程(Wangetal.,2011)。在白菜基因组中存在4个FLC的同源基因，分别为BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5，其中BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3来自基因组三倍化复制，BrFLC5则是拟南芥与白菜的共同祖先经历基因组α复制产生的，这个拷贝在拟南芥基因组中已经丢失，但在白菜类作物中保留下来(Yangetal.,2006)。白菜类作物的4个FLC同源基因位于不同的染色体上，其中BrFLC1位于A10染色体，BrFLC2位于A02染色体，BrFLC3和BrFLC5位于A03染色体(Schranzetal.,2002)。张学铭等(2014)发现BrFLC5的外显子3存在Pi3+1(G-A)变异，这个变异导致BrFLC5基因不能正常转录。携带A基因型位点的白菜类作物的开花时间较携带G基因型位点的白菜类作物显著提早。利用这个位点的变异可以对白菜类作物的抽薹早晚进行预测。竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术是一种高通量、低成本、低错误检测率的SNP分型方法，已成为国际上SNP分析的主流方法之一，在作物分子育种方面已经被广泛应用。开发基于KASP技术的BrFLC5的SNP标记将能够用于白菜耐抽薹性的早期评估，有效提高耐抽薹分子育种的效率。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于白菜类作物抽薹开花鉴定的SNP标记，所述SNP标记能够鉴定白菜类作物控制抽薹开花相关基因BrFLC5存在的功能性变异位点，从而在白菜类作物耐抽薹性分子育种中有效地开展标记辅助选择，操作简便。为此，本发明提供了一种用于白菜类作物抽薹开花鉴定的SNP标记，所述SNP标记是位于白菜类作物A03染色体上BrFLC5基因的外显子3的Pi3+1位的核苷酸，其为A或G。根据本发明，SNP的位置是基于1.5版本的白菜基因组序列而确定的。在本发明的一些实施例中，所述SNP标记的GG基因型个体的抽薹开花时间晚于GA和AA基因型的个体。本发明还提供了一种用于PCR扩增所述SNP标记的引物，其序列信息为：正向FAM荧光引物：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGG-3'；正向VIC荧光引物：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGA-3'；反向引物：5'-GGAGGAGAGCAAAAATAGTCTCAG-3'。本发明又提供了一种所述SNP标记在白菜类作物抽薹开花鉴定中的应用。根据本发明，所述SNP标记的GG基因型个体的抽薹开花时间晚于GA和AA基因型的个体。在本发明的一些实施例中，所述的应用包括以下步骤：A，提取待测白菜类作物的DNA，获得DNA模板；B，向步骤A提取的DNA模板中加入特异的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，进行PCR扩增，获得PCR产物；C，对PCR产物进行荧光检测分析，根据PCR产物发出的荧光对白菜类作物的抽薹开花进行鉴定；所述KASPPrimermix含有三种特异性的引物，分别为：正向FAM荧光引物：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGG-3'；正向VIC荧光引物：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGA-3'；反向引物；5'-GGAGGAGAGCAAAAATAGTCTCAG-3'；所述KASPMastermix包含如下各组分：通用的TRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶和dNTP。根据本发明，若PCR产物发出的荧光为FAM荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的GG基因型个体；若PCR产物发出的荧光为VIC荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的AA基因型个体；若PCR产物发出的荧光为FAM和VIC的混合荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的GA基因型个体。在本发明的一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：组分96孔板384孔板1536孔板DNA模板5μl2.5μl0.625μlKASPPrimerMix5μl2.5μl0.625μlKASPMasterMix0.14μl0.07μl0.0175μl反应总体积10.14μl5.07μl1.2675μl所述PCR扩增的步骤为：在发明的另一些实施例中，所述PCR扩增还包括以下步骤：本发明的有益效果为：本发明所述的SNP标记能够高通量鉴定白菜类作物控制抽薹开花相关基因BrFLC5存在的功能性变异位点，经检验目标位点基因型的检测准确率可高达百分之百，具有高效性和准确性；利用该标记一次PCR可检测1536个样品(实验使用1536微孔板时)，或384个样品(实验使用384微孔板时)或96个样品(实验使用96微孔板时)，每个样品的检测费用仅为0.3元/样品(1536孔板)，0.8-1.0元/样品(384孔板)，1.8元/样品(96孔板)，操作简便、价格低廉，在白菜类作物耐抽薹性分子育种中能够有效地开展标记辅助选择。附图说明图1为实施例1中对281份白菜材料的PCR扩增产物进行荧光检测的结果示意图。具体实施方式为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。本发明所涉及的用于白菜类作物抽薹开花鉴定的SNP标记，是位于白菜类作物A03染色体上BrFLC5基因的外显子3的Pi3+1位的核苷酸，其为A或G；含有该SNP位点的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，SNP位点为该序列的第63位核苷酸y，y为A或G；所述SNP标记的GG基因型个体的抽薹开花时间晚于GA和AA基因型的个体。根据本发明，SNP的位置是基于1.5版本的白菜基因组序列(Bra022771(B.rapachromosomeV1.5)2013-05-17)而确定的，网址：http://brassicadb.org。根据SNP突变信息特点，设计特异成套的竞争性等位基因特异性PCR引物，包括两条正向引物(正向FAM荧光引物和正向VIC荧光引物)、一条反向引物；其序列信息为：正向FAM荧光引物：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGG-3'；正向VIC荧光引物：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGA-3'；反向引物：5'-GGAGGAGAGCAAAAATAGTCTCAG-3'。正向FAM荧光引物末端的碱基为G，正向VIC荧光引物末端的碱基为A，反向引物序列的选择要保证扩增的片段长度在60-120bp，以保证扩增的完整性。两条正向引物的5'端连接有公共的荧光标签序列，其中正向FAM荧光引物的5'端连接为FAM荧光标记序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，正向VIC荧光引物的5'端连接为VIC荧光标记序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。本发明所述的“两条正向引物”的序列不限于正向FAM荧光引物序列和正向VIC荧光引物序列；正向特异引物5'-ACTAGAACTTGTGGAAAGG-3'与5'-CATGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGA-3'的5'端可以连接其他公共的荧光标记序列；例如，也可以在5'-ACTAGAACTTGTGGAAAGG-3'的5'端连接VIC荧光标记序列，在5'-CATGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGA-3'的5'端连接FAM荧光标记序列，形成新的两条正向引物序列，后续检测时，若PCR产物发出的荧光为FAM荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的AA基因型个体；若PCR产物发出的荧光为VIC荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的GG基因型个体；若PCR产物发出的荧光为FAM和VIC的混合荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的GA基因型个体。本发明所涉及的SNP标记能够应用于白菜类作物抽薹开花鉴定中，所述SNP标记的GG基因型个体的抽薹开花时间晚于GA和AA基因型的个体。在本发明的一些实施例中，所述的应用包括以下步骤：A，提取待测白菜类作物的DNA，获得DNA模板；B，将步骤A获得的DNA模板稀释到15ng/μl，然后加入特异的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，进行PCR扩增，获得PCR产物；所述KASPPrimermix含有三种特异性的引物，分别为：正向FAM荧光引物：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGG-3'；正向VIC荧光引物：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGAGCTACTAGAACTTGTGGAAAGA-3'；反向引物；5'-GGAGGAGAGCAAAAATAGTCTCAG-3'；所述KASPMastermix包含如下各组分：通用的TRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶和dNTP，购自LGC公司(LaboratoryoftheGovernmentChemist英国政府化学家实验室，http://www.lgcgroup.com/)的KASPMastermix试剂盒；该试剂盒中含2×MasterMix，MgCl2以及DMSO，其中2×MasterMix即本发明提到的KASPMastermix；MgCl2和DMSO是在由于高或低G/C含量所造成的不能成功检测分型信号的情况下加入KASPMastermix中使用的，本发明没有用到MgCl2和DMSO，用户可以根据实验的实际情况选择加入上述组分或不加入；所述PCR扩增的反应体系为：所述PCR扩增的步骤为：上述PCR扩增的步骤2中，第1个循环的扩增为94℃保持20s，61℃保持60s；第2个循环的扩增为94℃保持20s，60.4℃保持60s；……；第10个循环的扩增为94℃保持20s，55.6℃保持60s；若经过上述步骤进行PCR扩增后，荧光检测分析显示分型结果不太理想，可继续进行如下步骤进行的PCR扩增，C，对PCR产物进行荧光检测分析，根据PCR产物发出的荧光对白菜类作物的抽薹开花进行鉴定；荧光检测可以利用LGC公司(LaboratoryoftheGovernmentChemist英国政府化学家实验室，http://www.lgcgroup.com/)的SNPline进行检测，也可利用其他能够检测FAM荧光和VIC荧光的仪器进行检测；若PCR产物发出的荧光为FAM荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的GG基因型个体；若PCR产物发出的荧光为VIC荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的AA基因型个体；若PCR产物发出的荧光为FAM和VIC的混合荧光，则待测白菜类作物为SNP标记的GA基因型个体。实施例为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。下述实施例中所采用的引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成获得；所采用的白菜品种均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。实施例1：利用基于KASP技术开发的SNP标记鉴定白菜品种中BrFLC5存在的Pi3+1(G-A)变异。(1)白菜品种全基因组DNA的提取：取待测白菜品种叶片组织(281份白菜)，采用CTAB法提取全基因组DNA，并将各白菜品种的全基因组DNA稀释到15ng/μl；(2)稀释引物：根据合成引物公司所提供的引物稀释信息进行稀释，先将干粉引物进行离心，防止开盖时管口附近的干粉引物迸溅，根据引物稀释信息，将正向FAM荧光引物、正向VIC荧光引物和反向引物(序列信息如序列表SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示)的浓度均稀释到10μM；(3)配制KASPPrimermix：取稀释好的正向FAM荧光引物、正向VIC荧光引物各12μl，反向引物30μl，加入无菌超纯水(ddH2O)46μl，得到100μl的KASPPrimermix；(4)配制PCR反应体系：按照表1所示的各组分的加入量，配制PCR反应体系；表1：PCR反应体系中各组分的加入量组分96孔板384孔板1536孔板DNA模板5μl2.5μl0.625μlKASPPrimerMix5μl2.5μl0.625μlKASPMasterMix0.14μl0.07μl0.0175μl反应总体积10.14μl5.07μl1.2675μl同时设置不添加DNA模板的空白对照(NTC)，每个反应板设置1个或多个空白对照；(5)PCR扩增：微孔板装好后，按照以下步骤进行PCR扩增反应；若经过上述步骤进行PCR扩增后，荧光检测分析显示分型结果不太理想，可继续进行如下步骤进行的PCR扩增，(7)荧光检测：PCR反应结束后，使用AppliedBiosystems公司生产的7900HTFastReal-TimePCRSystem机器对PCR扩增产物进行扫描，进行荧光检测分析；并利用软件SDS2.3中的AllelicDiscrimination模块进行分型，两荧光(FAM荧光和VIC荧光)的激发波长和发射波长不同，可利用上述仪器进行检测，检测结果如图1所示；根据检测结果，按照如下标准确定待测白菜品种中BrFLC5存在的Pi3+1(G-A)变异位点的基因型；所述标准具体为：待测白菜品种PCR扩增产物的荧光信号经过SDS2.3软件分析，显示荧光信号聚为以下3类，包括聚合在接近Y轴的蓝色圆点，代表样品具有VIC荧光，则所述的白菜品种BrFLC5的Pi3+1(G-A)变异位点的基因型为AA；聚合在接近X轴的红色圆点，代表样品具有FAM荧光，则该变异位点的基因型为GG；聚合在坐标对角线附近的绿色圆点，代表样品具有两种荧光数值，则该变异位点的基因型为杂合型GA。若待测白菜品种PCR扩增产物的荧光信号经过SDS2.3软件分析呈黑色×号，无规律的分散在坐标任意部分，则该变异位点的基因型未能被识别；分布在坐标左下角的原点附近，图例为黑色实心方框的样本为空白对照，空白对照应该既不具有FAM荧光数值，也不具有VIC荧光数值。(8)结果分析：利用上述检测结果和该白菜品种的抽薹时间(从播种到抽薹的时间)以及开花时间(从播种到开花的时间)，分析三者之间的相关性；本实施例共采用281份白菜进行上述分析，相关性的计算由软件IBMSPSSStatistics19计算得到。白菜类作物存在4个BrFLC基因，其中BrFLC1的外显子6的Pi6+1位置的G-A功能变异位点(以下简称为“BrFLC1目标位点”)与开花时间显著相关。因此在控制BrFLC1目标位点基因型的条件下进行BrFLC5的外显子3的Pi3+1位置的G-A变异位点(以下简称为“BrFLC5目标位点”)基因型和抽薹时间(以及开花时间之间的相关性分析。本实施例中281份白菜品种的上述两个目标位点基因型信息、品种类型、抽薹时间(从播种到抽薹的时间)以及开花时间(从播种到开花的时间)的详细信息如表2所示。表中“FLC1”代表在基因BrFLC1的外显子6的Pi6+1位置的G-A变异位点的基因型(是已知的基因型)，“FLC5”代表在基因BrFLC5的外显子3的Pi3+1位置的G-A变异位点的基因型(是通过上述实例步骤检测的基因型)。分析结果表明，当BrFLC1目标位点的基因型为AA的条件下，BrFLC5目标位点的基因型为AA白菜品种的抽薹时间和开花时间与基因型为GG白菜品种的抽薹时间和开花时间均具有显著差异，SNP位点为GG的白菜品种的抽薹时间和开花时间显著晚于SNP位点为AA的白菜品种(抽薹时间P＝0.045，开花时间P＝0.007)；当BrFLC1目标位点的基因型为GG的条件下，BrFLC5目标位点的基因型为AA白菜品种的抽薹时间和开花时间与基因型为GG的材料的抽薹时间也均具有显著差异，SNP位点为GG的白菜品种的抽薹时间和开花时间显著晚于SNP位点为AA的白菜品种(抽薹时间P＝0.000，开花时间P＝0.000)。通过对随机选择的来自9个不同栽培种群的281份白菜类作物(包括大白菜、小白菜、紫菜薹、芜菁、油用白菜、水菜等)进行分子标记筛选，结果表明，这个标记可以检测出全部281份材料目标位点的基因型，并且携带不同的BrFLC5等位基因的材料间开花时间和抽薹时间存在显著性差异。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>一种用于白菜类作物抽薹开花鉴定的SNP标记<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>46<212>DNA<213>正向FAM荧光引物<400>1gaaggtgaccaagttcatgcttgagctactagaacttgtggaaagg46<210>2<211>48<212>DNA<213>正向VIC荧光引物<400>2gaaggtcggagtcaacggattcatgagctactagaacttgtggaaaga48<210>3<211>24<212>DNA<213>反向引物<400>3ggaggagagcaaaaatagtctcag24<210>4<211>147<212>DNA<213>含SNP位点的核苷酸序列<400>4gatcttcagtcaaaatctctgaactatagttcacaccatgagctactagaacttgtggaa60agyttagtactaactgagactatttttgctctcctcctttcattacaaatatattagggt120ttcctgtcaatctgtgcatatatgcag147当前第1页1 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