本发明涉及维生素提取技术领域，具体是青占鱼内脏中维生素AD提取物的制备方法与用途。
背景技术：
维生素A又称视黄醇或抗干眼病因子，是一个具有脂环的不饱和一元醇，包括动物性食物来源的维生素A1、A2 两种，是一类具有视黄醇生物活性的物质。维生素A1多存于哺乳动物及咸水鱼的肝脏中，维生素A2常存于淡水鱼的肝脏中。由于维生素A2的活性比较低，所以通常所说的维生素A是指维生素A1。维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2（麦角钙化醇）和VD3（胆钙化醇)。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物。青占鱼内脏中存在维生素A、D等对人类有益的微量元素。但是，一般食用青占鱼，都会把内脏丢弃，这会造成能源浪费。
在目前检测食物中维生素A 方法中，是先将食物样品加入适量碱液进行皂化处理，使样品中的脂肪与碱结合形成皂化物，并经水洗除皂而去除脂类物质，再用乙醚对非皂化样品中的维生素A 进行提取。将乙醚提取液经无水硫酸钠滤去残留水分后，先置于旋转蒸发器内减压蒸馏除去大部分乙醚，再用氮气吹干残余的乙醚后获得维生素A 提取物，最后用乙醇将维生素A 提取物进行溶解提纯。这种方法需要先将食物样品进行皂化处理，再用乙醚进行提取，还需对乙醚提取液进行脱水处理和用乙醇进行溶解提纯，存在提取过程复杂，用时较长，容易导致维生素A 的氧化破坏等诸多不足。
为了避免皂化过程的不利影响，也有方法省略了皂化的过程，采用将样品中加入无水硫酸钠，在研钵进行研磨粉碎以吸收样品中的水分，然后用乙醚或正己烷反复提取。将提取液经氮气吹干后，再用甲醇溶解纯化维生素A。此种方法虽然省略了皂化过程，但存在样品中的水分去除不完全，并可因此而影响乙醚等有机溶剂对维生素A 提取效率的不足。而且在目前应用的方法中，都是采用乙醚或正己烷或甲醇作为提取溶剂，存在提取溶剂毒性大、易挥发，容易对人体产生损伤的危险。
授权公告号为CN103852367B的中国发明专利，公开了一种食物中维生素A 检测分析的提取处理方法。首先将食物样品进行冷冻干燥以去除水分，再将冷冻干燥的食物样品加入氯仿乙醇混合液并高速匀浆，再将匀浆样品离心并收取位于下层的氯仿提取液，用氮气吹干提取液后加入乙醇使维生素A复溶纯化，复溶步骤中采用超声波助溶，以使维生素A 溶解提取完全。该方法的提取不需要传统方法中的碱液皂化去脂和减压蒸馏等过程，也克服了加入无水硫酸钠研磨吸水所存在的食物样品除水不完全等问题，具有操作简便、时间缩短，提取效率高等特点，也克服了应用乙醚或正己烷或甲醇为提取溶剂的危险性。由于乙醇的水溶性，因而即便提取样品中有微量水，也不会对结果产生影响。但该方法的提取率和提取的维生素A的纯度及生物活性仍旧有提升的空间。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能温和高效的提取维生素A、D，提取的维生素A、D纯度高，活性高，绿色安全的青占鱼内脏中维生素A D提取物的制备方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
青占鱼内脏中维生素A D提取物的制备方法，具体操作步骤：
1）预处理：将青占鱼内脏清洗干净，高速匀浆，高速研磨，破坏青占鱼内脏细胞，使细胞中维生素A、D流出，内脏颗粒变小，比表面积增大，加快反应速度；
2）酶解：在匀浆中加入蒸馏水和酶解剂，酶解剂成份及其重量分为：4~8份胰蛋白酶，2~3份中性蛋白酶，0.5~1.5份木瓜蛋白酶，0.3~0.6份氯化钙，0.02~0.05份半胱氨酸和0.01~0.04份糖醇乙酸酯。酶解条件温和，不会破坏维生素A、D的结构，使其保持较高的活性；复合酶联合酶解，并有多种酶激活剂激活复合酶，酶解速度快且酶解更彻底，提高维生素A、D的提取率；水浴加热，水浴温度为40~55℃，混合液pH为6.5~7.5，酶解时间,0.1~0.3h。微波助溶，微波功率为100~300W，频率为400~800MHz，作用时间为10~25min。通过高频电磁波穿透内脏细胞，微波能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升,当细胞内部压力超过细胞壁承受能力,细胞破裂,细胞内维生素A、D自由流出。搅拌，搅拌速率为100~400r/min。沸水浴灭酶10~15min，真空冷冻干燥1~4h，使酶解液中的残余水分含量低于1%；
3）萃取：加入氯仿和乙醇混合液，氯仿与乙醇体积比为1:1~3:1，搅拌，避光浸提1~3h，加入生理盐水，氯仿和乙醇能使蛋白质变性而不溶于水，从而去除蛋白质。离心，取下层氯仿提取液，用氯仿乙醇混合液对沉淀重复提取，合并提取液；
4）纯化：用氮气将合并提取液吹干，加入乙醇复溶纯化，乙醇中溶有0.02~0.06%的硫酸镁和0.05~0.15%大豆皂醇B。乙醇中加入硫酸镁和大豆皂醇B能增大维生素A、D在乙醇中的溶解度，油脂不溶于乙醇，用乙醇复溶纯化，能去除油脂，得到纯度高的维生素A、D提取物。
用途：青占鱼内脏中维生素A D提取物用于保健品或药物或食品的制备。
与现有技术相比，本发明的优点在于：酶解条件温和，不会破坏维生素A、D的结构，使其保持较高的活性；糖醇乙酸酯与复合酶联合酶解，在多种酶激活剂激活复合酶，酶解速度快且酶解更彻底，提高维生素A、D的提取率；通过高频电磁波穿透内脏细胞，微波能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升,当细胞内部压力超过细胞壁承受能力,细胞破裂,细胞内维生素A、D自由流出，提高维生素A、D的提取率；用氯仿和乙醇的混合液去除蛋白质，用乙醇复溶纯化去除油脂，最后得到的维生素A、D提取物的纯度高；操作简单，成本低廉，经济价值高，制备的维生素A、D提取物可用于保健品或药物或食品的制备。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
青占鱼内脏中维生素A D提取物的制备方法，具体操作步骤：
1）预处理：将青占鱼内脏清洗干净，高速匀浆，高速研磨，破坏青占鱼内脏细胞，使细胞中维生素A、D流出，内脏颗粒变小，比表面积增大，加快反应速度；
2）酶解：在匀浆中加入蒸馏水和酶解剂，酶解剂成份及其重量分为：4~8份胰蛋白酶，2~3份中性蛋白酶，0.5~1.5份木瓜蛋白酶，0.3~0.6份氯化钙，0.02~0.05份半胱氨酸和0.01~0.04份糖醇乙酸酯。酶解条件温和，不会破坏维生素A、D的结构，使其保持较高的活性；复合酶联合酶解，并有多种酶激活剂激活复合酶，酶解速度快且酶解更彻底，提高维生素A、D的提取率；水浴加热，水浴温度为40~55℃，混合液pH为6.5~7.5，酶解时间,0.1~0.3h。微波助溶，微波功率为100~300W，频率为400~800MHz，作用时间为10~25min。通过高频电磁波穿透内脏细胞，微波能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升,当细胞内部压力超过细胞壁承受能力,细胞破裂,细胞内维生素A、D自由流出。搅拌，搅拌速率为100~400r/min。沸水浴灭酶10~15min，真空冷冻干燥1~4h，使酶解液中的残余水分含量低于1%；
3）萃取：加入氯仿和乙醇混合液，氯仿与乙醇体积比为1:1~3:1，搅拌，避光浸提1~3h，加入生理盐水，氯仿和乙醇能使蛋白质变性而不溶于水，从而去除蛋白质。离心，取下层氯仿提取液，用氯仿乙醇混合液对沉淀重复提取，合并提取液；
4）纯化：用氮气将合并提取液吹干，加入乙醇复溶纯化，乙醇中溶有0.02~0.06%的硫酸镁和0.05~0.15%大豆皂醇B。乙醇中加入硫酸镁和大豆皂醇B能增大维生素A、D在乙醇中的溶解度，油脂不溶于乙醇，用乙醇复溶纯化，能去除油脂，得到纯度高的维生素A、D提取物。
用途：青占鱼内脏中维生素A D提取物用于保健品或药物或食品的制备。
实施例2：
青占鱼内脏中维生素A D提取物的制备方法，最优选操作步骤：
1）预处理：将100份青占鱼内脏清洗干净，高速匀浆，高速研磨，破坏青占鱼内脏细胞，使细胞中维生素A、D流出，内脏颗粒变小，比表面积增大，加快反应速度；
2）酶解：在匀浆中加入300份蒸馏水和酶解剂，酶解剂成份及其最优选重量分为：7份胰蛋白酶，2.5份中性蛋白酶，1份木瓜蛋白酶，0.5份氯化钙，0.04份半胱氨酸和0.02份糖醇乙酸酯。酶解条件温和，不会破坏维生素A、D的结构，使其保持较高的活性；复合酶联合酶解，并有多种酶激活剂激活复合酶，酶解速度快且酶解更彻底，糖醇乙酸酯也进一步提高了维生素A、D的提取率；水浴加热，水浴温度为50℃，混合液pH为7.0，酶解时间,0.2h。微波助溶，微波功率为250W，频率为600MHz，作用时间为20min。通过高频电磁波穿透内脏细胞，微波能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升,当细胞内部压力超过细胞壁承受能力,细胞破裂,细胞内维生素A、D自由流出。搅拌，搅拌速率为300r/min。沸水浴灭酶12min，真空冷冻干燥2h，使酶解液中的残余水分含量低于1%；
3）萃取：加入50份氯仿和乙醇混合液，氯仿与乙醇体积比为2:1，搅拌，避光浸提2h，加入10份生理盐水，氯仿和乙醇能使蛋白质变性而不溶于水，从而去除蛋白质。离心，取下层氯仿提取液，用氯仿乙醇混合液对沉淀重复提取，合并提取液；
4）纯化：用氮气将合并提取液吹干，加入20份无水乙醇复溶纯化，乙醇中溶有0.04%的硫酸镁和0.08%大豆皂醇B。乙醇中加入硫酸镁和大豆皂醇B能增大维生素A、D在乙醇中的溶解度，油脂不溶于乙醇，用乙醇复溶纯化，能去除油脂，得到纯度高的维生素A、D提取物。
用途：青占鱼内脏中维生素A D提取物用于保健品或药物或食品的制备。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。