本公开涉及包含通常与衰老、肥胖症和癌症有关的基因T3dh(III型醇脱氢酶,CG3425)、fbp(果糖1,6-双磷酸酶,CG31692)和AGL(淀粉-α-1,6-葡糖苷酶、4-α-葡聚糖转移酶,CG9485)的生物标志物,更具体地涉及使用所述生物标志物的诊断试剂盒等。
背景技术:
有关衰老调控基因的研究始于90年代初,并且目前正在积极地进行。目前已知的衰老调控基因可以分为活性氧隔离体系(过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等)、胰岛素/IGF-1信号体系(胰岛素、InR、PI3K、Akt、Foxo等)、基因表达抑制体系(去乙酰化酶等)、肿瘤抑制体系(p53等)、物质转运体系(二羧酸钠协同转运蛋白等)、端粒调控体系等。属于这些体系的基因与衰老的调控密切相关。
伴随着衰老,癌症的发生也会增加。令人关注的是,一些肿瘤抑制基因如p53也与衰老的调控有关。已知与致癌作用相关的基因包括具有GTP酶活性的Ras基因(Ras、Rac、Rap1、Rala、Rhoa等)、具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Akt相关基因(Akt/PKB、PKC、PKA、RAF等)、刺猬蛋白相关基因、原癌基因如c-Myc等。而且,已知p53、NFkB等是肿瘤抑制基因。特别地,HGF及其受体HGFR(c-met)主要与肝癌有关。肿瘤抑制基因PTEN抑制PI3K的活性。当PTEN过表达时,胰岛素/IGF-1信号体系的活性降低,寿命通常增加。所有这些基因都是从酵母、线虫、果蝇、小鼠等模型生物体中观察到的,同时调控癌症和衰老的人基因尚未研究很多。
而且,肥胖症的发生随着衰老而增加。与衰老相关的肥胖症的原因包括缺乏运动、生长激素(GH)和甲状腺激素分泌减少等。GH分泌降低导致降解碳水化合物、脂肪、蛋白质等的GH代谢效应降低,导致肌肉重量减少和脂肪堆积。由于GH增加肝脏中的IGF-1分泌,由于衰老引起的GH分泌减少改变了胰岛素/IGF-1信号体系的活性,并可能与寿命的调控有关。例如,从脂肪细胞中去除胰岛素受体的FIRKO小鼠即使在暴饮暴食后也不显示脂肪的积累,果蝇衰老模型显示体脂随着衰老而增加。因此,肥胖症和衰老彼此密切相关。然而,同时调控衰老和肥胖症的人基因的研究还不够。
也就是说,目前开发能够检测共同调控衰老、癌症和肥胖症的基因并且通过研究这些基因的表达来共同诊断衰老、癌症和肥胖症的生物标志物、诊断试剂盒、筛选方法等的努力是不够的。
作为与本公开相关的现有技术文献,韩国专利公开第10-2012-0021401号(专利文献1)公开了寿命延长的转基因动物以及通过过表达Atg5基因来准备该动物的方法。然而,在专利文献1中没有公开或提出关于使用共同调控衰老、癌症和肥胖症的基因的生物标志物、诊断试剂盒、筛选方法等。
技术实现要素:
技术问题
本公开旨在提供能够快速、准确且简单地确定衰老进展、确定肥胖症和诊断癌症的生物标志物。
本公开还涉及提供用于使用所述生物标志物确定或诊断的试剂盒和方法。
技术方案
在一个方面,本公开提供了用于确定衰老进展的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
在另一方面,本公开提供了用于确定肥胖症的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
在另一方面,本公开提供了用于诊断癌症的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
在另一方面,本公开提供了用于同时确定衰老进展、确定肥胖症和诊断癌症的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
在另一方面,本公开提供了用于确定衰老进展的试剂盒,其包含生物标志物;以及杂交溶液。
在用于确定衰老进展的试剂盒中,生物标志物分散在溶液中或以固定在基底上的微阵列的形式存在。
在另一方面,本公开提供了用于确定肥胖症的试剂盒,其包含生物标志物;以及杂交溶液。
在用于确定衰老进展的试剂盒中,生物标志物分散在溶液中或以固定在基底上的微阵列的形式存在。
在另一方面,本公开提供了用于诊断癌症的试剂盒,其包含生物标志物;以及杂交溶液。
在用于诊断癌症的试剂盒中,生物标志物分散在溶液中或以固定在基底上的微阵列的形式存在。
在另一方面,本公开提供了用于同时确定衰老进展、确定肥胖症和诊断癌症的试剂盒,其包含生物标志物;以及杂交溶液。
在另一方面,本公开提供了用于确定衰老进展的方法,其包括:I)从诊断的对象分离和提取RNA的步骤;II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于确定衰老进展的试剂盒接触,而使RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
在另一方面,本公开提供了用于确定肥胖症的方法,其包括:I)从诊断的对象分离和提取RNA的步骤;II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于确定肥胖症的试剂盒接触,而使RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
在另一方面,本公开提供了用于诊断癌症的方法,其包括:I)从诊断的对象分离和提取RNA的步骤;II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于诊断癌症的试剂盒接触,而使RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
在另一方面,本公开提供了用于同时确定衰老进展、确定肥胖症和诊断癌症的方法,其包括:I)从诊断的对象分离和提取RNA的步骤;II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于同时确定衰老进展、确定肥胖症和诊断癌症的试剂盒接触,而使RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
有益效果
本发明涉及生物标志物,其能够检测与衰老、肥胖症和癌症的诱导和发生相关的基因T3dh(III型醇脱氢酶,CG3425)、fbp(果糖1,6-双磷酸酶,CG31692)和AGL(淀粉-α-1,6-葡糖苷酶、4-α-葡聚糖转移酶,CG9485),从而快速、准确且简单地确定衰老进展、确定肥胖症并诊断癌症。生物标志物可以用于单独或共同分析或诊断人、非人的哺乳动物或昆虫的衰老、癌症和肥胖症的进展。
附图说明
图1显示Actin-GS-Gal4/+W1118取决于RU486的处理的寿命曲线。
图2显示当使用Actin-GS-Gal4和UAS-T3dh RNAi抑制T3dh表达时,T3dh mRNA的量减少。
图3显示Actin-GS-Gal4/+W1118取决于RU486的处理的寿命曲线。
图4显示当使用Actin-GS-Gal4和UAS-fbp RNAi抑制AGL表达时,AGL mRNA的量减少。
图5显示Actin-GS-Gal4/+W1118取决于RU486的处理的寿命曲线。
图6显示当使用Actin-GS-Gal4和UAS-AGL RNAi抑制AGL表达时,AGL mRNA的量减少。
图7显示当T3dh表达减少时,寿命缩短。
图8显示用RU486喂养的野生型果蝇的甘油三酯含量的变化。
图9显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/+;UAS-T3dh RNAi/+果蝇的甘油三酯含量的变化。
图10显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-nls.GFP果蝇的脂肪体组织的共焦显微图像。
图11显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-T3dh RNAi果蝇的脂肪体组织的脂肪用尼罗红染色后获得的共焦显微图像。
图12显示比较肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)的翼长的结果。
图13显示比较抑制T3dh基因表达的肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K/+;c765-Gal4/UAS-T3dh RNAi)的翼长的结果。
图14显示比较抑制T3dh基因表达的肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K/+;c765-Gal4/UAS-T3dh RNAi)的翼面积的结果。
图15显示当fbp表达减少时,寿命缩短。
图16显示用RU486喂养的野生型果蝇的甘油三酯含量的变化。
图17显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/+;UAS-fbp RNAi/+果蝇的甘油三酯含量的变化。
图18显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-nls.GFP果蝇的脂肪体组织的共焦显微图像。
图19显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-fbp RNAi果蝇的脂肪体组织的脂肪用尼罗红染色后获得的共焦显微图像。
图20显示比较肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)的翼长的结果。
图21显示比较抑制fbp基因表达的肿瘤生长模型果蝇(UAS-Ras85D/+;c765-Gal4/UAS-fbp RNAi)的翼长的结果。
图22显示比较抑制fbp基因表达的肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D/+;c765-Gal4/UAS-fbp RNAi)的翼面积的结果。
图23显示当AGL表达减少时,寿命缩短。
图24显示用RU486喂养的野生型果蝇的甘油三酯含量的变化。
图25显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/+;UAS-AGL RNAi/+果蝇的甘油三酯含量的变化。
图26显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-nls.GFP果蝇的脂肪体组织的共焦显微图像。
图27显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-AGL RNAi果蝇的脂肪体组织的脂肪用尼罗红染色后获得的共焦显微图像。
图28显示比较肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)和肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)的翼长的结果。
图29显示比较抑制AGL基因表达的肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K/+;c765-Gal4/UAS-AGL RNAi)的翼长的结果。
图30显示比较抑制AGL基因表达的肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K/+;c765-Gal4/UAS-AGL RNAi)的翼面积的结果。
图31显示比较抑制AGL基因表达的肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D/+;c765-Gal4/UAS-AGL RNAi)的翼长的结果。
图32显示比较抑制AGL基因表达的肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D/+;c765-Gal4/UAS-AGL RNAi)的翼面积的结果。
最佳实施方式
在下文中更详细地描述本公开。
本公开旨在提供能够快速且简单地确定人、非人的哺乳动物或昆虫的衰老进展的生物标志物。
本公开的一个方面涉及用于确定衰老进展的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
根据本公开的用于确定衰老进展的生物标志物是指能够定性地确定衰老进展的生物标志物。基于寿命或衰老表型随着选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达降低而缩短的事实,生物标志物能够通过比较在诊断对象中测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象的相同物种中的生物标志物的标准表达水平来确定衰老进展。
由于人、非人的哺乳动物和昆虫在遗传上是不同的,它们表现出完全不同的衰老进展。然而,根据本公开的用于确定衰老进展的生物标志物可以快速、准确和简单地针对个体物种确定诊断对象的衰老进展,所述生物标志物包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或多个碱基序列。
选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的碱基序列没有特别限制,只要它是从被UAS-GLA4体系抑制特定基因表达的突变果蝇中提取的即可。具体地,SEQ ID NO 1对应于果蝇的T3dh(III型醇脱氢酶,CG3425)基因,SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 5对应于果蝇的fbp(果糖1,6-双磷酸酶,CG31692)基因,SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 11对应于果蝇的AGL(淀粉-α-1,6-葡糖苷酶,4-α-葡聚糖转移酶,CG9485)。
具体地,在本公开中,使用诱导型基因开关(GS)GAL/UAS表达体系以评估使用果蝇的候选基因的功能。GAL4是最初来源于酵母的蛋白质。当GAL4被引入果蝇后表达时,它在药物RU486(米非司酮)的存在下与称为上游激活序列(UAS)的DNA序列结合,从而激活UAS下游的特定基因的转录。在没有RU486时,特定基因的转录未被激活。基于此,通过调节T3dh RNAi、fbp RNAi或AGL RNAi的活性来控制T3dh、fbp或AGL基因的表达,并鉴定其功能。
当选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达特异性降低时,果蝇衰老加速。
具体地,将被UAS-GAL4体系抑制特定基因表达的突变果蝇暴露于RU486之后,由于特定基因的表达降低两倍或更多而产生的效果通过重复实验得到证明。结果证实,当含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的基因的表达降低两倍或更多时,衰老进一步发展。因此,该基因可以用作确定人、非人的哺乳动物或昆虫的衰老的生物标志物。
此外,因为选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列与人ADHFE1(醇脱氢酶,含铁,1,NP_653251.2 467aa)基因是同源的,除昆虫之外,根据本公开的生物标志物可以用于确定人的衰老进程。
选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列的一个或更多个碱基序列是缺乏内含子的cDNA。该cDNA是使用通过转录由基因组DNA产生的mRNA制备为互补DNA的cDNA。
也就是说,因为生物标志物可以用于确定人、非人的哺乳动物、或昆虫的衰老进展,所以它预期用于确定诊断对象的衰老进展。
本公开涉及提供能够快速且简单地确定人、非人的哺乳动物、或昆虫的肥胖症的生物标志物。
本公开的另一个方面涉及用于确定肥胖症的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
在本公开中,用于确定肥胖症的生物标志物是指能够定性地确定肥胖症的增加(具体地,脂肪体组织中的甘油三酯含量的增加及脂滴的尺寸和密度的增加)的生物标志物。通过比较诊断对象中测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种中的生物标志物的标准表达水平,生物标志物能够确定肥胖症的增加,这基于以下事实:随着选自SEQ ID NO 1至SEQID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达降低,身体脂肪含量和脂肪体组织中的脂滴的尺寸和密度增加。
由于人、非人的哺乳动物和昆虫在基因上是不同的,它们也会在肥胖症方面表现出差异。然而,根据本公开,含有选自SEQ ID NO 1至SEQ IDNO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的用于确定肥胖症的生物标志物可以针对单个物种快速、准确且简单地确定诊断对象的肥胖症。
选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的碱基序列没有特别限制,只要它是从被UAS-GAL4体系抑制特定基因表达的突变果蝇中提取的即可。具体地,SEQ ID NO 1对应于果蝇的T3dh(III型醇脱氢酶,CG3425)基因,SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 5对应于果蝇的fbp(果糖1,6-双磷酸酶,CG31692)基因,SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 11对应于果蝇的AGL(淀粉-α-1,6-葡糖苷酶,4-α-葡聚糖转移酶,CG9485)。
具体地,在本公开中,使用诱导型基因开关(GS)GAL/UAS表达体系来评估使用果蝇的候选基因的功能。GAL4是最初来源于酵母的蛋白质。当GAL4被引入果蝇后表达时,它在药物RU486(米非司酮)的存在下与称为上游激活序列(UAS)的DNA序列结合,从而激活UAS下游的特定基因的转录。在没有RU486时,特定基因的转录未被激活。基于此,通过调节T3dh RNAi、fbp RNAi或AGL RNAi的活性来控制T3dh、fbp或AGL基因的表达,并鉴定其功能。
随着果蝇的甘油三酯含量和脂肪体组织的脂滴的大小和密度大大增加,选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达特异性地降低。
具体地,将被UAS-GAL4体系抑制特定基因表达的突变果蝇暴露于RU486之后,由于特定基因的表达降低两倍或更多而产生的效果通过重复实验得到证明。结果证实,当含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的基因的表达降低两倍或更多时,肥胖症增加。因此,该基因可以用作测定人、非人的哺乳动物或昆虫的肥胖症的生物标志物。
此外,由于选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列与人ADHFE1(醇脱氢酶,含铁,1,NP_653251.2 467aa)基因同源,因此除昆虫之外,根据本公开的生物标志物可以用于确定人的肥胖症。
选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列的一个或更多个碱基序列是缺乏内含子的cDNA。该cDNA是使用通过转录由基因组DNA产生的mRNA制备为互补DNA的cDNA。
也就是说,因为生物标志物可以用于确定人、非人的哺乳动物、或昆虫的肥胖症增加,所以其预计用于确定诊断对象的肥胖症增加。
本公开旨在提供能够快速且简单地诊断人、非人的哺乳动物、或昆虫的癌症的生物标志物。
本公开的另一个方面涉及用于诊断癌症的生物标志物,其包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。
在本公开中,用于诊断癌症的生物标志物是指能够定性地确定癌细胞和组织的增殖或生长的生物标志物。生物标志物能够通过比较在诊断对象中测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种中的生物标志物的标准表达水平来确定癌症的发生或增殖,这是基于以下事实:随着选自SEQID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达降低,肿瘤生长模型果蝇(或肿瘤增殖模型果蝇)的表型减少。
由于人、非人的哺乳动物和昆虫在遗传上是不同的,它们也会在癌症发生方面显示出差异。然而,根据本公开,含有选自SEQ ID NO 1至SEQ IDNO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的用于诊断癌症的生物标志物可以快速、准确且简单地针对单个物种确定诊断对象的癌症的发生。
选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的碱基序列没有特别限制,只要它是从被UAS-GAL4体系抑制特定基因表达的突变果蝇中提取的即可。具体地,SEQ ID NO 1对应于果蝇的T3dh(III型醇脱氢酶,CG3425)基因,SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 5对应于果蝇的fbp(果糖1,6-双磷酸酶,CG31692)基因,SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 11对应于果蝇的AGL(淀粉-α-1,6-葡糖苷酶,4-α-葡聚糖转移酶,CG9485)。
具体地,在本公开中,使用诱导型基因开关(GS)GAL/UAS表达体系来评估使用果蝇的候选基因的功能。GAL4是最初来源于酵母的蛋白质。当GAL4被引入果蝇后表达时,它在药物RU486(米非司酮)的存在下与称为上游激活序列(UAS)的DNA序列结合,从而激活UAS下游的特定基因的转录。在没有RU486时,特定基因的转录未被激活。基于此,通过调节T3dh RNAi、fbp RNAi或AGL RNAi的活性来控制T3dh、fbp或AGL基因的表达,并鉴定其功能。
随着肿瘤生长模型果蝇(或肿瘤增殖模型果蝇)的翼表型大大减少,选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达特异性地降低。
具体地,将被UAS-GAL4体系抑制特定基因表达的突变果蝇暴露于RU486之后,由于特定基因的表达降低两倍或更多而产生的效果(通过抑制癌症相关PI3K的表达来减少翼长度和面积)通过重复实验得到证明。结果证实,当含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的基因的表达降低两倍或更多时,肿瘤生长模型果蝇的翼表型增加。因此,该基因可以用作诊断人、非人的哺乳动物、或昆虫的癌症发生的生物标志物。
此外,因为选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列与人ADHFE1(醇脱氢酶,含铁,1,NP_653251.2 467aa)基因同源,因此除昆虫之外,根据本公开的生物标志物可以用于诊断人的癌症的发生或增殖。
选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列的一个或更多个碱基序列是缺乏内含子的cDNA。该cDNA是使用通过转录由基因组DNA产生的mRNA制备为互补DNA的cDNA。
也就是说,因为生物标志物可以用于确定人、非人的哺乳动物或昆虫的癌症的发生或增殖,所以其预期用于诊断诊断对象的癌症。
如上所述,虽然包含选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的生物标志物可以用于单独确定衰老、确定肥胖症并诊断癌症,其也可以用于同时确定衰老进展、确定肥胖症增加并检测癌症发生。
如上所述,由于选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列的表达降低,被UAS-GA14体系抑制特定基因表达的突变果蝇经历进一步的衰老进程、脂肪体组织中甘油三酯以及脂滴的密度和尺寸增加、以及癌症发生减少。因此,通过比较诊断对象中测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种中的生物标志物的标准表达水平,生物标志物能够同时确定衰老进展、确定肥胖症增加和检测癌症发生。
此外,在本公开中,生物标志物不仅可以是SEQ ID NO 1至SEQ ID NO11的碱基序列、与其互补的碱基序列或其mRNA,也可以是由该碱基序列编码的一种或更多种蛋白质。蛋白质可以由选自氨基酸序列12至氨基酸序列22中的一个或更多个构成。
基于与正常对照组(与诊断对象相同物种的标准表达水平)相比的蛋白质增加或减少量,由氨基酸序列12至氨基酸序列22构成的蛋白质也可以确定和诊断选自衰老、肥胖症和癌症中的一种或更多种。
使用蛋白质的试剂盒可以是用于ELISA(酶联免疫吸附测定)的试剂盒,并且可以通过使与蛋白质特异性结合的抗体与选自诊断对象的组织、细胞、尿液、血液、血清和血浆等的生物样品接触来定量地检测抗原-抗体复合物。
通过将检测结果与诊断对象的标准蛋白质表达水平进行比较,可以确定和诊断选自诊断对象的衰老、肥胖症和癌症中的一种或更多种。
用于测量蛋白质表达水平的分析技术包括Western印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀、补体结合试验、FACS、蛋白质芯片等,但不限于此。
通过这些分析技术,可以将诊断对象中形成的抗原-抗体复合物的量与诊断对象相同物种中形成的抗原-抗体复合物的标准量相比较,衰老进展、肥胖症增加和癌症发生中的一种或更多种可以通过研究选自氨基酸序列12至氨基酸序列22的一种或更多种蛋白质的表达水平是否显著增加来确定或诊断。
本公开的另一方面涉及用于确定衰老进展的试剂盒,其包含生物标志物和杂交溶液。
生物标志物与上述相同,并且可以分散在溶液中或以高密度固定在基底上。换句话说,生物标志物可以是固定在特定区域上的微阵列的形式。微阵列在本领域中是众所周知的。
通过将分散在溶液中或固定在基底上的生物标志物与从诊断对象提取的mRNA或cDNA杂交,试剂盒可以确定是否表达相同序列的mRNA或cDNA。
因此,试剂盒中使用的生物标志物需要分离碱基序列的一条链的过程。
当生物标志物为固定在基底上的微阵列形式时,基底可以是在杂交背景水平保持为低的条件下生物标志物可以与之结合的任何基底。通常,基底可以是微量滴定板、膜(例如尼龙或硝化纤维素)、微球(珠)或芯片。
在应用或固定到膜上之前,可以对生物标志物进行修饰以提高杂交效率。修饰可以包括同聚物加尾,与各种反应性官能团例如脂肪族基团、NH2基团、SH基团和羧基结合,或与生物素、半抗原或蛋白质结合。
“杂交”是指将两条互补核酸链组合以形成双链分子(杂交体)的过程。
杂交溶液是允许生物标志物与从诊断对象提取的mRNA或cDNA杂交的缓冲溶液,可以使用本领域已知的溶液。
试剂盒还可以包括能够检测由与生物标志物杂交形成的诊断对象的核酸的检测器。可以使用扫描仪、分光光度计、液体闪烁计数器等作为检测器,但不限于此。本公开的试剂盒还可以包含描述最佳反应条件的说明。
试剂盒可以通过比较对诊断对象测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种的生物标志物的标准表达水平来定性检测衰老进展。具体地,在使用该试剂盒将对诊断对象测定的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种的生物标志物的标准表达水平进行比较时,如果诊断对象的表达水平降低,则可以准确而迅速地确定与相同物种的平均衰老相比,诊断对象的衰老进一步进展。
本公开的另一方面涉及用于确定肥胖症的试剂盒,其包含生物标志物和杂交溶液。
生物标志物与上述相同,并且可以分散在溶液中或以高密度固定在基底上。换句话说,生物标志物可以是固定在特定区域上的微阵列的形式。微阵列在本领域中是众所周知的。
通过将分散在溶液中或固定在基底上的生物标志物与从诊断对象提取的mRNA或cDNA杂交,试剂盒可以确定是否表达相同序列的mRNA或cDNA。
因此,试剂盒中使用的生物标志物需要分离碱基序列的一条链的过程。
当生物标志物为固定在基底上的微阵列形式时,基底可以是在杂交背景水平保持为低的条件下生物标志物可以与之结合的任何基底。通常,基底可以是微量滴定板、膜(例如尼龙或硝化纤维素)、微球(珠)或芯片。
在应用或固定到膜上之前,可以对生物标志物进行修饰以提高杂交效率。修饰可以包括同聚物加尾,与各种反应性官能团例如脂肪族基团、NH2基团、SH基团和羧基结合,或与生物素、半抗原或蛋白质结合。
“杂交”是指将两条互补核酸链组合以形成双链分子(杂交体)的过程。
杂交溶液是允许生物标志物与从诊断对象提取的mRNA或cDNA杂交的缓冲溶液,可以使用本领域已知的溶液。
试剂盒还可以含有能够检测由与生物标志物杂交形成的诊断对象的核酸的检测器。可以使用扫描仪、分光光度计、液体闪烁计数器等作为检测器,但不限于此。本公开的试剂盒还可以包含描述最佳反应条件的说明。
试剂盒可以通过比较对诊断对象测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种的生物标志物的标准表达水平来定性检测肥胖症。具体地,在使用该试剂盒将对诊断对象测定的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种的生物标志物的标准表达水平进行比较时,如果诊断对象的表达水平降低,则可以准确而迅速地确定与相同物种的平均甘油三酯含量和脂滴的尺寸和密度相比,诊断对象的平均甘油三酯含量和脂滴的尺寸和密度增加。
本公开的另一方面涉及用于诊断癌症的试剂盒,其包含生物标志物和杂交溶液。
生物标志物与上述相同,并且可以分散在溶液中或以高密度固定在基底上。换句话说,生物标志物可以是固定在特定区域上的微阵列的形式。微阵列在本领域中是众所周知的。
通过将分散在溶液中或固定在基底上的生物标志物与从诊断对象提取的mRNA或cDNA杂交,试剂盒可以确定是否表达相同序列的mRNA或cDNA。
因此,试剂盒中使用的生物标志物需要分离碱基序列的一条链的过程。
当生物标志物为固定在基底上的微阵列形式时,基底可以是在杂交背景水平保持为低的条件下生物标志物可以与之结合的任何基底。通常,基底可以是微量滴定板、膜(例如尼龙或硝化纤维素)、微球(珠)或芯片。
在应用或固定到膜上之前,可以对生物标志物进行修饰以提高杂交效率。修饰可以包括同聚物加尾,与各种反应性官能团例如脂肪族基团、NH2基团、SH基团和羧基结合,或与生物素、半抗原或蛋白质结合。
“杂交”是指将两条互补核酸链组合以形成双链分子(杂交体)的过程。
杂交溶液是允许生物标志物与从诊断对象提取的mRNA或cDNA杂交的缓冲溶液,可以使用本领域已知的溶液。
试剂盒还可以含有能够检测由与生物标志物杂交形成的诊断对象的核酸的检测器。可以使用扫描仪、分光光度计、液体闪烁计数器等作为检测器,但不限于此。本公开的试剂盒还可以包含描述最佳反应条件的说明。
试剂盒可以通过比较对诊断对象测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种的生物标志物的标准表达水平来定性诊断癌症。具体地,在使用该试剂盒将对诊断对象测定的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种的生物标志物的标准表达水平进行比较时,如果诊断对象的表达水平降低,则可以准确而迅速地确定与相同物种相比,在诊断对象中发生或生长癌症。
如上所述,尽管根据本公开的试剂盒可以用于单独确定衰老、确定肥胖症和诊断癌症,但其也可以用于同时确定衰老进展、确定肥胖症增加并检测癌症的发生。
如上所述,试剂盒含有生物标志物和杂交溶液,所述生物标志物含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列、与其互补的碱基序列及其mRNA的一个或更多个碱基序列。随着生物标志物的表达降低,被UAS-GA14体系抑制特定基因表达的突变果蝇经历进一步的衰老进程、脂肪体组织中甘油三酯增加以及脂滴的密度和尺寸增加、以及癌症发生减少。因此,通过比较诊断对象中测量的生物标志物的表达水平和与诊断对象相同物种中生物标志物的标准表达水平,试剂盒能够同时确定衰老进展、确定肥胖症增加并检测癌症发生。
本公开的另一方面涉及用于确定衰老进展的方法,其包括:
I)从诊断对象中分离和提取RNA的步骤;
II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于确定衰老进展的试剂盒接触,以使得RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和
III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
从诊断对象分离RNA可以通过本领域众所周知的方法进行。具体地,可以从诊断对象分离细胞,然后可以在体外从诊断对象的分离细胞分离RNA。
在本公开的示例性实施方案中,cDNA可以是使用分离的RNA作为模板合成的第一链cDNA。第一链cDNA可以通过本领域常用的方法合成。例如,它可以使用逆转录酶、RNA酶阻断核糖核酸酶抑制剂等来合成。逆转录酶的实例包括来自各种来源的逆转录酶,例如禽成髓细胞瘤病毒衍生的病毒逆转录酶(AMV逆转录酶)、鼠白血病病毒衍生的病毒逆转录酶(MMLV逆转录酶)和Rous相关的病毒2逆转录酶(RAV-2逆转录酶)。
具体地,可以用可检测标记来标记cDNA。标记可以是发射荧光、磷光或辐射的物质,但不限于此。具体地,标记是Cy5或Cy3。当合成第一链cDNA时,如果通过在引物的5’末端标记Cy5或Cy3进行合成,则靶序列可以用可检测的荧光标记进行标记。用放射性物质标记可以如下实现。当合成第一链cDNA时,如果向反应溶液中加入放射性同位素如32P、35S等,则所得的合成产物可以用放射性物质标记。
检测杂交程度的步骤可以通过毛细管电泳、凝胶电泳、辐射测量、荧光测量、或磷光测量来进行。
在本公开的另一个示例性实施方案中,用于确定衰老进展的方法还可以包括通过将检测结果与相应诊断对象的标准进行比较来确定诊断对象的衰老进展的步骤。
同时,用于确定衰老进展的方法可以用于提供对于确定诊断对象的衰老进展所需的信息。通过从诊断对象分离细胞,并在体外从诊断对象的分离细胞中分离RNA,并向其中添加能够检测选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的表达的探针、或能够检测选自SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 22的氨基酸序列的表达的抗体,可以检测含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的基因或含有选自SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 22的氨基酸序列的蛋白质。
所述方法还可以包括通过将所检测的基因和蛋白质的表达水平与相应的诊断对象的标准进行比较来确定诊断对象的衰老进展的步骤。
诊断对象可以是人、非人的哺乳动物、或昆虫。
本公开的另一方面涉及用于确定肥胖症的方法,其包括:
I)从诊断对象中分离和提取RNA的步骤;
II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于确定肥胖症的试剂盒接触,以使RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和
III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
从诊断对象分离RNA可以通过本领域众所周知的方法进行。具体地,可以从诊断对象分离细胞,然后可以在体外从诊断对象的分离细胞中分离RNA。
在本公开的示例性实施方案中,cDNA可以是使用分离的RNA作为模板合成的第一链cDNA。第一链cDNA可以通过本领域常用的方法合成。例如,它可以使用逆转录酶、RNA酶阻断核糖核酸酶抑制剂等来合成。逆转录酶的实例包括来自各种来源的逆转录酶,例如禽成髓细胞瘤病毒衍生的病毒逆转录酶(AMV逆转录酶)、鼠白血病病毒衍生的病毒逆转录酶(MMLV逆转录酶)和Rous相关病毒2逆转录酶(RAV-2逆转录酶)。
具体地,可以用可检测标记来标记cDNA。标记可以是发射荧光、磷光或辐射的物质,但不限于此。具体地,标记是Cy5或Cy3。当合成第一链cDNA时,如果通过在引物的5’末端标记Cy5或Cy3进行合成,则靶序列可以用可检测的荧光标记进行标记。用放射性物质标记可以如下实现。当合成第一链cDNA时,如果向反应溶液中加入放射性同位素如32P、35S等,则所得的合成产物可以是用放射性物质标记的。
检测杂交程度的步骤可以通过毛细管电泳、凝胶电泳、辐射测量、荧光测量、或磷光测量来进行。
在本公开的另一个示例性实施方案中,用于确定肥胖症的方法还可以包括通过将脂肪体组织中甘油三酯含量的增加和脂滴的尺寸和密度的增加与相应的诊断对象的标准进行比较来确定肥胖症的步骤。
同时,用于确定肥胖症的方法可以用于提供对于确定诊断对象的肥胖症所需的信息。通过从诊断对象分离细胞,并在体外从诊断对象的分离细胞中分离RNA,并向其中添加能够检测选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的表达的探针、或能够检测选自SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 22的氨基酸序列的表达的抗体,可以检测含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的基因或含有选自SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 22的氨基酸序列的蛋白质。
所述方法还可以包括通过将所检测的基因和蛋白质的表达水平与相应诊断对象的标准进行比较来确定诊断对象肥胖症增加(脂肪体组织中甘油三酯含量的增加和脂滴的尺寸和密度的增加)的步骤。
诊断对象可以是人、非人的哺乳动物、或昆虫。
本公开的另一方面涉及用于诊断癌症的方法,其包括:
I)从诊断对象中分离和提取RNA的步骤;
II)通过使分离的RNA或由其合成的cDNA与用于诊断癌症的试剂盒接触,以使得该RNA或cDNA与生物标志物杂交的步骤;和
III)检测生物标志物与RNA或cDNA之间杂交程度的步骤。
从诊断对象分离RNA可以通过本领域众所周知的方法进行。具体地,可以从诊断对象分离细胞,然后可以在体外从诊断对象的分离细胞分离RNA。
在本公开的示例性实施方案中,cDNA可以是使用分离的RNA作为模板合成的第一链cDNA。第一链cDNA可以通过本领域常用的方法合成。例如,它可以使用逆转录酶、RNA酶阻断核糖核酸酶抑制剂等来合成。逆转录酶的实例包括来自各种来源的逆转录酶,例如来自禽成髓细胞瘤病毒衍生的病毒逆转录酶(AMV逆转录酶)、鼠白血病病毒衍生的病毒逆转录酶(MMLV逆转录酶)和Rous相关病毒2逆转录酶(RAV-2逆转录酶)。
具体地,可以用可检测标记来标记cDNA。标记可以是发射荧光、磷光或辐射的物质,但不限于此。具体地,标记是Cy5或Cy3。当合成第一链cDNA时,如果通过在引物的5’末端标记Cy5或Cy3进行合成,则靶序列可以用可检测的荧光标记进行标记。用放射性物质标记可以如下实现。当合成第一链cDNA时,如果向反应溶液中加入放射性同位素如32P、35S等,则所得的合成产物可以是用放射性物质标记的。
检测杂交程度的步骤可以通过毛细管电泳、凝胶电泳、辐射测量、荧光测量、或磷光测量来进行。
在本公开的另一个示例性实施方案中,用于诊断癌症的方法还可以包括如下诊断癌症的步骤:通过将检测结果与相应诊断对象的标准进行比较而确定诊断对象中癌症的发生或生长。
同时,用于诊断癌症的方法可以用于提供对于诊断诊断对象的癌症所需的信息。通过从诊断对象分离细胞,并在体外从诊断对象的分离细胞中分离RNA,并向其中添加能够检测选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的表达的探针、或能够检测选自SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 22的氨基酸序列的表达的抗体,可以检测含有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 11的碱基序列的基因或含有选自SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 22的氨基酸序列的蛋白质。
所述方法可以还包括通过将所检测的基因和蛋白质的表达水平与相应的诊断对象的标准进行比较来诊断所诊断的对象中癌症的发生和生长的步骤。
诊断对象可以是人、非人的哺乳动物、或昆虫。
如上所述,尽管所述试剂盒可以用于单独确定衰老进展、确定肥胖症和诊断癌症,但其也可以用于同时确定衰老进展、确定肥胖症的增加并检测癌症的发生。
使用用于同时确定衰老进展、确定肥胖症增加和检测癌症发生的试剂盒的方法可以与上述使用各个试剂盒的方法相同的方式进行。
通过将检测结果与相应诊断对象的标准进行比较,可以确定和诊断所诊断的对象的衰老、肥胖症和癌症的发生或生长。
发明实施方式
在下文中,通过具体实施例详细描述本公开,使得本公开所属领域的普通技术人员可以容易地实施本公开。然而,本公开可以以各种不同的形式来实施并且不限于这些实施例。
实施例1.准备T3dh基因表达被抑制的突变果蝇
<准备过程>
使Actin-GS-Gal4果蝇与野生型(w1118)果蝇交配以研究RU486对寿命的影响。证实RU486对寿命没有影响(参见图1)。
在RU486的存在下,Actin-GS-Gal4通过果蝇体被表达。对于UAS-T3dh RNAi,如果产生Gal4,则由于RNAi干扰了T3dh的转录,因此T3dh(III型醇脱氢酶,CG3425)的表达降低。为了研究由Actin-GS-Gal4和UAS-T3dh RNAi果蝇交配得到的后代(F1)果蝇中T3dh表达是否下降,通过RT-PCR测量T3dh mRNA的量。结果发现,当果蝇被喂食RU486时,与没有喂食RU486时相比,T3dh mRNA的量显著减少。该结果表明Actin-GS-Gal4和UAS-T3dh-RNAi运作正常(参见图2)。
实施例2.准备具fbp基因表达被抑制的突变果蝇
<准备过程>
使Actin-GS-Gal4果蝇与野生型(w1118)果蝇交配以研究RU486对寿命的影响。证实RU486对寿命没有影响(参见图3)。
在RU486的存在下,Actin-GS-Gal4通过果蝇体被表达。对于UAS-fbp RNAi,如果产生Gal4,则因为RNAi干扰了fbp的转录,所以fbp(果糖-1,6-双磷酸酶,CG31692)的表达降低。为了研究由Actin-GS-Gal4和UAS-fbp RNAi果蝇交配获得的后代(F1)果蝇中fbp表达是否降低,通过RT-PCR 测量fbp mRNA的量。结果发现当果蝇被喂食RU486时,与未喂食RU486时相比,fbp mRNA的量显著降低。该结果表明Actin-GS-Gal4和UAS-fbp RNAi运作正常(参见图4)。
实施例3.准备具有抑制的AGL基因表达的突变果蝇
<准备过程>
使Actin-GS-Gal4果蝇与野生型(w1118)果蝇交配以研究RU486对寿命的影响。证实RU486对寿命没有影响(参见图5)。
在RU486的存在下,Actin-GS-Gal4通过果蝇体被表达。对于UAS-AGL RNAi,如果产生Gal4,则由于RNAi干扰了AGL的转录,所以AGL的表达降低。为了研究从Actin-GS-Gal4和UAS-AGL RNAi果蝇交配获得的后代(F1)果蝇中AGL表达是否降低,通过RT-PCR测量AGL mRNA的量。结果发现,当果蝇被喂食RU486时,与没有喂食RU486时相比,AGL mRNA的量显著减少。该结果表明Actin-GS-Gal4和UAS-AGL RNAi运作正常(参见图6)。
<T3dh基因与衰老、肥胖症和癌症的关系>
实验实施例1:Actin-GS-Gal4>UAS-T3dh RNAi的RT-PCR
为了研究UAS-T3dh RNAi果蝇是否运作正常,使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-T3dh RNAi果蝇交配。收集F1代的雄性,并用含RU486(150μM)的培养基(蔗糖2.5%、葡萄糖5%、琼脂0.7%、玉米粉6.1%、酵母2.6%、10%Tegosept 1.6%、水80.7%)培育10天,或用不含RU486的培养基培育10天。然后,进行逆转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)以测量T3dh mRNA的量。结果证实,在用含有RU486的培养基培育的UAS-T3dh RNAi果蝇中,T3dh mRNA的量在统计学上显著降低。
实验实施例2:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4>UAS-T3dh RNAi果蝇寿命的测量
使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-T3dh RNAi果蝇交配后,收集120只雄性F1代,并用含有RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基进行培育。在25℃、相对湿度50%和12小时光照-12小时黑暗周期的条件下培育它们,同时测量寿命,直至6只蝇存活。寿命测量重复3次。如图7所示,证实随着T3dh表达降低,寿命降低或衰老进一步进展(参见图7)。
实验实施例3:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4;UAS-T3dh RNAi果蝇的甘油三酯含量的测定
使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-T3dh RNAi果蝇交配后,收集约100只或更多的雄性F1代,并用含有RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基进行培育。10天后,通过薄层色谱法(TLC)测量甘油三酯含量(图8显示了用RU486喂养的野生型果蝇的甘油三酯含量的变化)。将每个测试组的10只蝇加入Eppendorf管中。加入100μL提取溶剂(10mM的Tris,1mM的EDTA,0.1%的TritonX-100)并粉碎5分钟后,进行离心。然后,将5μL所得上清液滴在TLC板上。用于分离甘油三酯的TLC洗脱液的组成为己烷:乙醚:乙酸(70:30:1),芝麻油(Sigma-Aldrich S3547-250ML)用作甘油三酯标准品。干燥TLC,放入碘饱和盒中染色,然后成像。使用Image J软件对甘油三酯带进行定量。结果证实,在用RU486喂养的果蝇中或T3dh表达抑制组中甘油三酯含量显著增加(参见图9)。
实验实施例4:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4>UAS-T3dh RNAi果蝇的脂肪体的共焦显微分析
为了观察脂滴的尺寸,使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-T3dh RNAi果蝇交配,收集F1代雄性,并用含有RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基培育10天,然后用尼罗红染色。解剖果蝇,并将脂肪体组织在室温下在含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定30分钟。用PBS洗涤溶液,用0.5mg/mL尼罗红(Sigma)溶液稀释至1:2500,在室温下染色30分钟,然后用蒸馏水洗涤两次。将染色的样品放置在载玻片上,并在加入80%的甘油溶液后在共焦显微镜下观察(图10显示了用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UAS-nls.GFP果蝇的脂肪体组织的共焦显微图像)。结果证实脂滴的尺寸和密度增加(参见图11)。
实验实施例5:准备肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)
通过使c765-Gal4果蝇与UAS-PI3K果蝇交配来准备肿瘤生长模型果蝇。
实验实施例6:肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)的表型分析
为进行所准备的UAS-PI3K;c765-Gal4肿瘤增殖模型果蝇的表型分析,比较野生型果蝇(CS10)和c765-Gal4/+CS10;UASPI3K/+CS10和UAS-PI3K/+CS10;由c765-Gal4与CS10交配获得的c765-Gal4/+CS10的翼长。发现与三个对照组相比,UASPI3K/+CS10;c765-Gal4/+CS10的翼长增加。测量了相对于胸长的翼长以补偿个体蝇之间的差异。证实了果蝇模型可足以用作肿瘤增殖模型(参见图12)。
实验实施例7:在肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)中抑制的T3dh基因表达对表型的影响
为了估计抑制的T3dh基因表达对肿瘤生长的影响,研究了由肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)与UAS-T3dh RNAi果蝇交配获得的F1代的翼表型。结果证实,随着T3dh表达被抑制,由于PI3K的过表达而增加的翼长和面积显著降低(参见图13和图14)。
<fbp基因与衰老、肥胖症和癌症的关系>
实验实施例8:Actin-GS-Gal4>UAS-fbp RNAi的RT-PCR
为了研究UAS-fbp RNAi果蝇是否运作正常,使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-fbp RNAi果蝇交配。收集F1代的雄性,用含RU486(150μM)的培养基(蔗糖2.5%、葡萄糖5%、琼脂0.7%、玉米粉6.1%、酵母2.6%、10%的Tegosept 1.6%、水80.7%)培育10天,或用不含RU486的培养基培育10天。然后,进行逆转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)以测量fbp mRNA的量。结果证实,在用含有RU486的培养基培育的UAS-fbp RNAi果蝇中,fbp mRNA的量在统计学上显著降低。
实验实施例9:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4>UAS-fbp RNAi果蝇寿命的测量
使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-fbp RNAi果蝇交配后,收集120只雄性F1代,并用含有RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基培育。在25℃、相对湿度50%和12小时光照-12小时黑暗周期的条件下培育,同时测量寿命,直至6只蝇存活。寿命测量重复3次。如图15所示,证实随着fbp表达降低,寿命降低或衰老进一步进展(参见图15)。
实验实施例10:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4;UAS-fbp RNAi果蝇的甘油三酯含量的测量
使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-fbp RNAi果蝇交配后,收集约100只或更多的雄性F1代,并用含有RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基进行培育。10天后,通过薄层色谱法(TLC)测量甘油三酯含量(图16显示了用RU486喂养的野生型果蝇的甘油三酯含量的变化)。将每个测试组的10只蝇加入Eppendorf管中。加入100μL提取溶剂(10mM的Tris、1mM的EDTA、0.1%的TritonX-100)并粉碎5分钟后,进行离心。然后,将5μL所得上清液滴在TLC板上。用于分离甘油三酯的TLC洗脱液的组成为己烷:乙醚:乙酸(70:30:1),芝麻油(Sigma-Aldrich S3547-250ML)用作甘油三酯标准品。将TLC干燥,放入碘饱和盒中染色,然后成像。使用Image J软件对甘油三酯带进行定量。结果证实,用RU486喂养的果蝇或fbp表达抑制组中甘油三酯含量显著增加(参见图17)。
实验实施例11:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4>UAS-fbp RNAi果蝇的脂肪体的共焦显微分析
为了观察脂滴的尺寸,使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-fbp RNAi果蝇交配,收集F1代雄性,用含有RU486(150μM)的培养基或不含有RU486的培养基培育10天,然后用尼罗红染色。解剖果蝇,将脂肪体组织在室温下在含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定30分钟。用PBS洗涤溶液,用0.5mg/mL尼罗红(Sigma)溶液稀释至1:2500,在室温下染色30分钟,然后用蒸馏水洗涤两次。将染色的样品置于载玻片上,并在加入80%的甘油溶液后在共焦显微镜下观察(图18显示用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UASnls.GFP果蝇的脂肪体组织的共焦显微图像)。结果证实脂滴的尺寸和密度增加(参见图19)。
实验实施例12:准备肿瘤生长模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)
通过使c765-Gal4果蝇与UAS-Ras85D果蝇交配来准备肿瘤生长模型果蝇。
实验实施例13:肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)的表型分析
为进行所准备的UAS-Ras85D;c765-Gal4肿瘤增殖模型果蝇的表型分析,比较野生型果蝇(CS10)和c765-Gal4/+CS10;UAS-Ras85D/+CS10和UAS-Ras85D/+CS10;由c765-Gal4与CS10交配获得的c765-Gal4/+CS10的翼长。发现与三个对照组相比,UAS-Ras85D/+CS10;c765-Gal4/+CS10的翼长增加。测量相对于胸长的翼长以补偿个体蝇之间的差异。证实果蝇模型可足以用作肿瘤增殖模型(参见图20)。
实验实施例14:肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)中抑制的fbp表达的作用
为了评估抑制的fbp基因表达对肿瘤生长的影响,研究了由肿瘤生长模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)与UAS-fbp RNAi果蝇交配获得的F1代的翼表型。结果证实,随着fbp表达被抑制,由于Ras85D的过表达而增加的翼长和面积显著降低(参见图21和图22)。
<AGL基因与衰老、肥胖症和癌症的关系>
实验实施例15:Actin-GS-Gal4>UAS-AGL RNAi的RT-PCR
为了研究UAS-AGL RNAi果蝇是否运作正常,使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-AGL RNAi果蝇交配。收集F1代的雄性,用含RU486(150μM)的培养基(蔗糖2.5%、葡萄糖5%、琼脂0.7%、玉米粉6.1%、酵母2.6%、10%的Tegosept 1.6%、水80.7%),或不含RU486的培养基培育10天。然后,进行逆转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)以测量AGL(淀粉-α-1,6-葡糖苷酶,4-α-葡聚糖转移酶,CG9485)mRNA的量。结果证实,在用含有RU486的培养基培育的果蝇中,AGL mRNA的量在统计学上显著降低。
实验实施例16:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4>UAS-AGL RNAi果蝇的寿命的测量
使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-AGL RNAi果蝇交配后,收集120只雄性F1代,并用含RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基培育。在25℃、相对湿度50%和12小时光照-12小时黑暗周期的条件下培育,同时测量寿命,直至6只蝇存活。寿命测量重复3次。如图23所示,证实了随着fbp表达降低,寿命降低或衰老进一步进展(参见图23)。
实验实施例17:用RU486喂养的Actin-GS-Gal4;UAS-AGL RNAi果蝇的甘油三酯含量的测量
使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-AGL RNAi果蝇交配后,收集大约100只或更多雄性F1代,并用含RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基培育。10天后,通过薄层色谱(TLC)测量甘油三酯含量(图24显示用RU486喂养的野生型果蝇的甘油三酯含量的变化)。将每个测试组的10只蝇加入Eppendorf管中。加入100μL的提取溶剂(10mM的Tris,1mM的EDTA,0.1%的TritonX-100)并粉碎5分钟后,进行离心。然后,将5μL所得上清液滴在TLC板上。用于分离甘油三酯的TLC洗脱液的组成为己烷:乙醚:乙酸(70:30:1),芝麻油(Sigma-Aldrich S3547-250ML)用作甘油三酯标准品。将TLC干燥,放入碘饱和盒中染色,然后成像。使用Image J软件对甘油三酯带进行定量。结果证实,用RU486喂养的果蝇或AGL表达抑制组中甘油三酯含量显著增加(参见图25)。
实验实施例18:喂养RU486的Actin-GS-Gal4>UAS-AGL RNAi果蝇的脂肪体的共焦显微分析
为了观察脂滴的尺寸,使雌性Actin-GS-Gal4果蝇与雄性UAS-AGL RNAi果蝇交配,收集F1代雄性,用含有RU486(150μM)的培养基或不含RU486的培养基培育10天,然后用尼罗红染色。解剖果蝇,将脂肪体组织在室温下在含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定30分钟。用PBS洗涤溶液,用0.5mg/mL尼罗红(Sigma)溶液稀释至1:2500,在室温下染色30分钟,然后用蒸馏水洗涤两次。将染色的样品置于载玻片上,并在加入80%甘油溶液后在共焦显微镜下观察(图26显示了用RU486喂养的Actin-GS-Gal4/UASnls.GFP果蝇的脂肪体组织的共焦显微图像)。结果证实脂滴的尺寸和密度增加(参见图27)。
实验实施例19:准备肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)
通过使c765-Gal4果蝇与UAS-PI3K果蝇交配来准备肿瘤生长模型果蝇。
实验实施例20:肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)的准备
通过使c765-Gal4果蝇与UAS-Ras85D果蝇交配来准备肿瘤生长模型果蝇。
实验实施例21:肿瘤增殖模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)的表型分析
为进行准备的UAS-PI3K;c765-Gal4肿瘤增殖模型果蝇的表型分析,比较野生型果蝇(CS10)和c765-Gal4/+CS10;UASPI3K/+CS10和UAS-PI3K/+CS10;由c765-Gal4与CS10交配获得的c765-Gal4/+CS10的翼长。发现与三个对照组相比,UAS-PI3K/+CS10;c765-Gal4/+CS10的翼长增加。测量相对于胸长的翼长以补偿个体蝇之间的差异。证实果蝇模型可足以用作肿瘤增殖模型(参见图28)。
实验实施例22:肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)的表型分析
为进行准备的UAS-Ras85D;c765-Gal4肿瘤增殖模型果蝇的表型分析,比较野生型果蝇(CS10)和c765-Gal4/+CS10;UAS-Ras85D/+CS10和UAS-Ras85D/+CS10;由c765-Gal4与CS10交配获得的c765-Gal4/+CS10的翼长。发现与三个对照组相比,UAS-Ras85D/+CS10;c765-Gal4/+CS10的翼长增加。测量相对于胸长的翼长以补偿个体蝇之间的差异。证实果蝇模型可足以用作肿瘤增殖模型(参见图28)。
实验实施例23:在肿瘤增殖模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)中抑制AGL表达的作用
为了评估抑制AGL基因表达对肿瘤生长的影响,研究了由肿瘤生长模型果蝇(UAS-PI3K;c765-Gal4)与UAS-AGL RNAi果蝇交配获得的F1代的翼表型。结果证实,随着AGL表达被抑制,由于PI3K的过表达而增加的翼长和面积显著降低(参见图29和图30)。
实验实施例24:在肿瘤增殖模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)中抑制AGL表达的作用
为了评估抑制AGL基因表达对肿瘤生长的影响,研究了由肿瘤生长模型果蝇(UAS-Ras85D;c765-Gal4)与UAS-AGL RNAi果蝇交配获得的F1代的翼表型。结果证实,随着AGL表达被抑制,由于Ras85D的过表达而增加的翼长和面积显著降低(参见图31和图32)。
尽管上文详细描述了本公开的具体示例性实施方案,但应该理解,本公开的范围不受它们限制,而是在本公开的范围内可以有各种修改,并且它们也被包括在所附权利要求的范围内。
工业适用性
由于本公开的生物标志物可以迅速而准确地确定人、非人的哺乳动物或昆虫的衰老进展、癌症发生和肥胖症,这为新药开发和各种物种的个性化医疗提供了重要指标并且可以减少生物医学发展的时间和成本。
序列表
<110> 高丽大学校产学协力团
<120> 用于确定衰老、确定肥胖症和诊断癌症的生物标志物和使用其的诊断试剂盒
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 1
atgtcgcgga agaatgtctt aggtttgatc aacacgatcg tggccaactc ctgcaagtgc 60
cccgcccatt cgcataacta tggctcagca gctccaaccg cctcccaaac gggtcgcatg 120
gaatacgcct tcgagatgtc agcctcgact gttcgatttg gaccgggagt aagtgccgaa 180
gtgggagccg atcttcgcaa cttgggagct cggaaggttt gtttggtcac ggataaaaat 240
gtcgtgcaat tgccctccgt gaaagtggcc ttggattcac tggctcgtaa tggcatcaac 300
tacgaagtct atgatgaaac ccgggtggag cccacggatg ggagcatgtg gcatgccgtg 360
gagtttgcgc gcggcaagga gttcgatgca tttctggcca tcggaggagg atctgccatg 420
gatacagcca aggcagctaa tctttttagc agtgatgcaa atgcagagtt tttggattat 480
gtaaactgcc caattggcag aggcaaggag atatccgtaa aactgaagcc cctgattgcg 540
atgcccacca cttcgggaac aggttccgaa accactggag tagctatatt tgattacaag 600
aagttgcatg ccaaaactgg gatttccagc aagttcctca aacctacttt ggctgtgatt 660
gatcctctgc acaccctatc ccagccgcaa cgcgtgatgg ctttcgctgg ctttgatgtg 720
ttctgccatg ccctggagag tttcacggcg gtggattaca gggaacgcgg tttggcgccc 780
agtgatccca gcttgagacc cacctaccag ggcaggaacc cagtgtcgga tgtgtgggca 840
cgattcgcat tggagacgat aaggaaaaac tttgtgaacg ccatttacca gcccgataac 900
ctagaagccc gatcccagat gcacctggct tccacaatgg ctggcgtggg atttggtaat 960
gccggagtgc acctgtgtca tggcctttcc tatcctattt ctggaaatgt gagggattac 1020
aagccaaagg gctactccgc ggatcacgct cttattccac acggcctatc cgtggtgatc 1080
agtgctccgg cggtctttga gttcactgct ccagcttgtc cggatcggca tttggaggct 1140
gcccagttgc tgggcgcaga agtgcgaggt gtcgaaaaag cagacgccgg tcgtcttttg 1200
gcggacactg tacgcggttt tatgcaacgc gcgggcatag aaaatggcct ccgagagctg 1260
ggattctcca gcagcgatat acccgccttg gtggagggaa ccctgcccca ggaaaggatc 1320
actaagctag cacccagggc gcagacgcag gaaaacctgt cgcaactctt tgagaagtcc 1380
atggaggtct attaa 1395
<210> 2
<211> 1005
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 2
atgacccaac agaggccagc tttcgactcc aatgcgatga cgctgacgcg tttcgtgctg 60
caggagcagc gaaagttcaa gagcgccact ggcgatctct cccagctgct caactccatc 120
cagaccgcca tcaaggctac atcatccgcg gtgcggaagg caggtatcgc caagctccat 180
ggattcgctg gcgacgtgaa tgtccaaggc gaggaggtca agaaactgga cgtgctctcc 240
aacgagctgt tcatcaacat gctgaagtca tcctatacca catgtctaat ggtttccgag 300
gagaacgaga atgtgatcga ggtggaagtg gagaaacagg gcaaatacat cgtgtgcttc 360
gatcccttgg atggatcctc caacatagac tgcctggtgt cgatcggttc aatcttcgcc 420
atttaccgca agaaaagcga tggtccgccc acagtggagg atgcactgca gcccggaaat 480
cagctggtgg ccgccggcta cgcgctatac ggttcggcca cagcaattgt cctgggtctg 540
ggttcgggag tgaatggctt cacttatgac ccggccatcg gagagttcgt gctgaccgat 600
cccaacatgc gggtgccgga gaagggaaag atatactcta tcaacgaggg atatgcagcg 660
gattgggagg atggtgtctt caactacatt gcggccaaga aggatcccgc caagggaaag 720
ccctatggag cgcggtacgt gggttccatg gtcgcggatg tgcatcgcac cattaaatac 780
ggcggcatct ttatctatcc ggcaacaaag tccgctccca gcggaaaact tcgtctgctg 840
tacgagtgcg tgcccatggc ctatctgatg atccaggctg gaggtctggc cagcgacgga 900
aagatcagca ttttggacat tgtgcccaag aagatccacg agcgcagtcc catattccta 960
ggatccaagt ccgacgtgga ggaggcactt agctacttaa agtga 1005
<210> 3
<211> 969
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 3
atgacgctga cgcgtttcgt gctgcaggag cagcgaaagt tcaagagcgc cactggcgat 60
ctctcccagc tgctcaactc catccagacc gccatcaagg ctacatcatc cgcggtgcgg 120
aaggcaggta tcgccaagct ccatggattc gctggcgacg tgaatgtcca aggcgaggag 180
gtcaagaaac tggacgtgct ctccaacgag ctgttcatca acatgctgaa gtcatcctat 240
accacatgtc taatggtttc cgaggagaac gagaatgtga tcgaggtgga agtggagaaa 300
cagggcaaat acatcgtgtg cttcgatccc ttggatggat cctccaacat agactgcctg 360
gtgtcgatcg gttcaatctt cgccatttac cgcaagaaaa gcgatggtcc gcccacagtg 420
gaggatgcac tgcagcccgg aaatcagctg gtggccgccg gctacgcgct atacggttcg 480
gccacagcaa ttgtcctggg tctgggttcg ggagtgaatg gcttcactta tgacccggcc 540
atcggagagt tcgtgctgac cgatcccaac atgcgggtgc cggagaaggg aaagatatac 600
tctatcaacg agggatatgc agcggattgg gaggatggtg tcttcaacta cattgcggcc 660
aagaaggatc ccgccaaggg aaagccctat ggagcgcggt acgtgggttc catggtcgcg 720
gatgtgcatc gcaccattaa atacggcggc atctttatct atccggcaac aaagtccgct 780
cccagcggaa aacttcgtct gctgtacgag tgcgtgccca tggcctatct gatgatccag 840
gctggaggtc tggccagcga cggaaagatc agcattttgg acattgtgcc caagaagatc 900
cacgagcgca gtcccatatt cctaggatcc aagtccgacg tggaggaggc acttagctac 960
ttaaagtga 969
<210> 4
<211> 969
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 4
atgacgctga cgcgtttcgt gctgcaggag cagcgaaagt tcaagagcgc cactggcgat 60
ctctcccagc tgctcaactc catccagacc gccatcaagg ctacatcatc cgcggtgcgg 120
aaggcaggta tcgccaagct ccatggattc gctggcgacg tgaatgtcca aggcgaggag 180
gtcaagaaac tggacgtgct ctccaacgag ctgttcatca acatgctgaa gtcatcctat 240
accacatgtc taatggtttc cgaggagaac gagaatgtga tcgaggtgga agtggagaaa 300
cagggcaaat acatcgtgtg cttcgatccc ttggatggat cctccaacat agactgcctg 360
gtgtcgatcg gttcaatctt cgccatttac cgcaagaaaa gcgatggtcc gcccacagtg 420
gaggatgcac tgcagcccgg aaatcagctg gtggccgccg gctacgcgct atacggttcg 480
gccacagcaa ttgtcctggg tctgggttcg ggagtgaatg gcttcactta tgacccggcc 540
atcggagagt tcgtgctgac cgatcccaac atgcgggtgc cggagaaggg aaagatatac 600
tctatcaacg agggatatgc agcggattgg gaggatggtg tcttcaacta cattgcggcc 660
aagaaggatc ccgccaaggg aaagccctat ggagcgcggt acgtgggttc catggtcgcg 720
gatgtgcatc gcaccattaa atacggcggc atctttatct atccggcaac aaagtccgct 780
cccagcggaa aacttcgtct gctgtacgag tgcgtgccca tggcctatct gatgatccag 840
gctggaggtc tggccagcga cggaaagatc agcattttgg acattgtgcc caagaagatc 900
cacgagcgca gtcccatatt cctaggatcc aagtccgacg tggaggaggc acttagctac 960
ttaaagtga 969
<210> 5
<211> 1032
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 5
atggcggcca gtagcggtga ttccaaaatg acccaacaga ggccagcttt cgactccaat 60
gcgatgacgc tgacgcgttt cgtgctgcag gagcagcgaa agttcaagag cgccactggc 120
gatctctccc agctgctcaa ctccatccag accgccatca aggctacatc atccgcggtg 180
cggaaggcag gtatcgccaa gctccatgga ttcgctggcg acgtgaatgt ccaaggcgag 240
gaggtcaaga aactggacgt gctctccaac gagctgttca tcaacatgct gaagtcatcc 300
tataccacat gtctaatggt ttccgaggag aacgagaatg tgatcgaggt ggaagtggag 360
aaacagggca aatacatcgt gtgcttcgat cccttggatg gatcctccaa catagactgc 420
ctggtgtcga tcggttcaat cttcgccatt taccgcaaga aaagcgatgg tccgcccaca 480
gtggaggatg cactgcagcc cggaaatcag ctggtggccg ccggctacgc gctatacggt 540
tcggccacag caattgtcct gggtctgggt tcgggagtga atggcttcac ttatgacccg 600
gccatcggag agttcgtgct gaccgatccc aacatgcggg tgccggagaa gggaaagata 660
tactctatca acgagggata tgcagcggat tgggaggatg gtgtcttcaa ctacattgcg 720
gccaagaagg atcccgccaa gggaaagccc tatggagcgc ggtacgtggg ttccatggtc 780
gcggatgtgc atcgcaccat taaatacggc ggcatcttta tctatccggc aacaaagtcc 840
gctcccagcg gaaaacttcg tctgctgtac gagtgcgtgc ccatggccta tctgatgatc 900
caggctggag gtctggccag cgacggaaag atcagcattt tggacattgt gcccaagaag 960
atccacgagc gcagtcccat attcctagga tccaagtccg acgtggagga ggcacttagc 1020
tacttaaagt ga 1032
<210> 6
<211> 4890
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 6
atgcgttatc agctcttccg atggctttat ggactaatag cgactgttga taacgaaccg 60
ctaccgttac aaatcaaaag cgaagaggaa gcgttcgggg aaaacaagaa gaagaagcag 120
ctggcgagtc tggagaatgc catctccccc ggaaaattgg attcagtcgc gattagaacc 180
gttccaagtg caaatgcgaa tgcaatgggc aatgcaggca gtgccgagat cgtatcaaat 240
caaatcatcc gccgccgtga gatgagcacc atgggcaagg agacggagtc gcatagcata 300
cccatcagcg agggccagga tgcggagcat atcctgtacc gtctgaagcg gggttccaag 360
ctgagtgttc atccggatgc ctcgttgctg ggcaggaaga tcgtattgta caccaactat 420
cccgccgagg gacagaagtt tgtgcgtacg gagtatcgcg tgctgggatg gcaactcagc 480
aatggcaagc agattacctc tgtaatgcat ccggaggccc atgtggtaga tactgacatt 540
cgtagtcagg tggagctcaa catgtccggc acctaccact tttacttccg gtatctggaa 600
agacccgaca ctggctgctc cggagcagat ggagctctat atgtgcaagt ggagcccacg 660
ctgcatgttg ggccgcctgg cgcccagaag accattccct tggactcggt gcgctgccaa 720
acggtgctgg ccaagctcct gggaccactg gacacttggg agcctaagct gcgcgtggca 780
aaggaggccg gatacaatgt gatccacttc actcccatcc aggagttggg tggctcccga 840
tcctgctatt cgctgcgtga tcaactcaag gtcaactccc attttgcacc ccaaaaggga 900
ggtaagatca gttttgagga tgtggagaag gtcatcaaga agtgccgcca ggagtggggg 960
gtggcctcca tctgcgacat cgtgctcaat cacaccgcca acgagtccga ttggctacta 1020
cagcatccgg atgccaccta ctcatgcgcc acctgtccct acctccgccc cgccttcctg 1080
ctggacgcca cattcgccca gtgcggagcg gacatagccg agggcagcct ggagcatgta 1140
ggcgtacctg cggtcatcga gcaggagtgc catttggaag cgttaaagta ccagttgcac 1200
acctcctaca tgtccaaggt caatatacac gagctgtatc agtgcgatgt gatgaagtac 1260
gtgaacgagt tcatgtccca ggtgcgaact cgcgagccac cgaagaatgt ggccaacgag 1320
tgtcgcttcc aggaaatcca actgatacag gacccgcaat atcgacgctt ggccagcacc 1380
attaatttcg agctggcgct ggagatcttt aatgctttcc atggcgactg cttcgatgag 1440
gagtcacggt tccgcaagtg cgccgaaacc ctccgccggc atctcgatgc cctcaacgat 1500
cgtgtgcgct gcgaggttca aggctacata aactatgcga tagacaatgt tttggccgga 1560
gttcgctacg aaagagtcca gggcgatggg cccagagtga aggagatctc cgagaagcac 1620
tcggtcttta tggtctactt tacgcatacc ggcacccagg gaaaatcgct cactgagatc 1680
gaggcggata tgtataccaa ggctggagag ttcttcatgg cccacaacgg ttgggtcatg 1740
ggatacagcg atcctctgag ggattttgct gaggagcaac ctggacgcgc caatgtctac 1800
ctcaagcggg agctcatctc gtggggcgat agtgtgaagt tgcgcttcgg cagacggccg 1860
gaggacagtc cctacctatg gcagcacatg accgagtacg ttcagaccac agcgcgcatc 1920
ttcgacggtg tgcgattgga caactgccac tccacgccat tgcacgtagc tgagtacctt 1980
ctcgatgcag ctcgtaagat caacccagag ctgtatgtgg tggctgaact gttcaccaat 2040
tccgattaca ccgacaatgt gtttgtgaac cgattgggta tcacctcctt gatccgtgaa 2100
gctctttccg cttgggactc ccacgagcaa ggccgcttag tgtatcggta tggaggagtg 2160
cctgtaggtg gtttccaagc aaactcatcg cgccacgagg ccaccagtgt cgctcatgcc 2220
ctcttcctgg acctcaccca cgataatccg tctccggtgg agaagcgttc cgtgtacgat 2280
cttctaccat cggcggcact ggtttccatg gcatgctgtg ccacaggaag taaccgtggt 2340
tacgacgaac tggtccccca tcatatccat gtcgtagatg aggaacgcac ctaccaagaa 2400
tggggcaaag gtgttgactc gaagtccgga attatgggtg ccaaaagagc actgaatttg 2460
ctgcatggac agctcgcaga ggagggattt agccaagttt acgtagacca gatggatccc 2520
aacgtagttg cagttactcg tcattcgcca atcacgcatc agtcagttat tctcgtggcc 2580
cacactgcct ttggctatcc ctctcctaat gccggaccca ccggaatccg cccgctgcgt 2640
ttcgagggtg tgctggacga gatcatcctg gaggccagct tgaccatgca gagtgacaag 2700
ccattcgatc gtcctgctcc attcaaaaag gatccgaatg taatcaacgg ctttactcag 2760
ttccagttga atctgcagga gcacatcccg ctggctaagt cgacagtgtt tcagacccaa 2820
gcctattcgg atggcaacaa cacggagcta aactttgcca atctacgacc cggcactgtg 2880
gtggccatca gagtgtctat gcatcctggt cctcgcacca gtttcgataa gctccagaaa 2940
atctcggctg ccctgcgtat tggatctggc gaggagtatt cccagctgca ggctatcgtc 3000
tccaagttgg atctggtggc acttagtggt gcccttttca gctgcgatga tgaggagagg 3060
gatcttggca aaggtggcac cgcctacgac attcccaact ttggaaagat cgtttactgc 3120
ggattgcaag gattcatttc cctgttgacg gagatttcgc ctaaaaatga cttgggacat 3180
ccgctttgta acaatctgcg cgacggaaac tggatgatgg attacatttc tgatcgccta 3240
actagttatg aagacctgaa accactctcc gcctggttca aagctacctt tgagccactg 3300
aagaatattc cacgctacct cataccctgc tactttgatg ccattgtcag cggggtttac 3360
aatgtgctca tcaaccaggt caacgaacta atgccagact tcattaagaa tggccacagt 3420
ttcccacaat ccctggccct gtccacgttg cagttcctct ccgtttgcaa gtcggccaat 3480
ctgccgggat tcagtcctgc tctaagtcca cccaagcctc caaagcaatg tgtgactcta 3540
tctgctggtc tgccgcattt ctcaacgggc tatatgcggt gctggggccg tgataccttc 3600
atcgctctgc gtggctccat gttcctcact ggccgttaca acgaggctcg cttcatcatc 3660
attggatttg gtcagaccct tcgacacgga ctcattccga atcttttgga cagcggcagc 3720
aagccgagat tcaactgccg cgatgctatc tggtggtgga tgtactgcat caagcagtat 3780
gtggaggatg cccccaaggg tgccgagatc ctgaaggaca aggtgtcccg catatttccg 3840
tacgacgatg ccgatgccca tgctccaggt gccttcgacc aacttctctt cgacgtgatg 3900
caggaggcac tgcaggtgca ttttcagggc ttgcagtata gggagcgcaa tgcaggctat 3960
gagatcgatg cgcacatggt ggaccagggc tttaacaatc agatcggaat tcacccggag 4020
actggctttg tattcggagg caataacttc aactgcggca cttggatgga caaaatggga 4080
tcctcacaga aggccggaaa caagggacgt ccaagtacgc cgcgcgacgg atcagccgtg 4140
gagctcgttg gcctccagta tgccgtactc cggtttatgc aaagcctagc cgaaaaggag 4200
gttatcccgt acaccggcgt ggaacgaaag ggtccatcgg gcgaagtgac caagtggagc 4260
tacaaggagt gggcggatcg catcaagaac aactttgaca agtatttctt tgtatccgaa 4320
tcggaaacct gctcggtggc caacaagaag cttatctaca aggacagcta tggagccacc 4380
cagagttgga cggactacca gctgcgatgc aacttcccca tcaccttgac cgtggctccc 4440
gacctgtgca atcctcagaa tgcctggcgt gcactggagc gcgccaaaaa gtatcttctg 4500
ggaccgctgg gcatgaagac gatggatccc gaggactgga actatagggc caactatgac 4560
aactcaaatg actccaccga ttgcactgta gcccatggcg caaactacca ccaggggccg 4620
gagtgggtat ggcccatcgg tttttacctg cgggcgcgcc tgatcttcgc caaaaagtgt 4680
ggccatttgg acgagaccat tgccgagacc tgggccatac tacgggccca tctccgagag 4740
ctacagacat cccattggcg cggattgccc gagttgacca acgataatgg ctcctactgc 4800
ggtgactcct gtcgcacgca ggcctggagt gttgctgcca ttttggaagt cctgtacgat 4860
ctgcactcct tgggagcaga cgtggcctaa 4890
<210> 7
<211> 4629
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 7
atgagcacca tgggcaagga gacggagtcg catagcatac ccatcagcga gggccaggat 60
gcggagcata tcctgtaccg tctgaagcgg ggttccaagc tgagtgttca tccggatgcc 120
tcgttgctgg gcaggaagat cgtattgtac accaactatc ccgccgaggg acagaagttt 180
gtgcgtacgg agtatcgcgt gctgggatgg caactcagca atggcaagca gattacctct 240
gtaatgcatc cggaggccca tgtggtagat actgacattc gtagtcaggt ggagctcaac 300
atgtccggca cctaccactt ttacttccgg tatctggaaa gacccgacac tggctgctcc 360
ggagcagatg gagctctata tgtgcaagtg gagcccacgc tgcatgttgg gccgcctggc 420
gcccagaaga ccattccctt ggactcggtg cgctgccaaa cggtgctggc caagctcctg 480
ggaccactgg acacttggga gcctaagctg cgcgtggcaa aggaggccgg atacaatgtg 540
atccacttca ctcccatcca ggagttgggt ggctcccgat cctgctattc gctgcgtgat 600
caactcaagg tcaactccca ttttgcaccc caaaagggag gtaagatcag ttttgaggat 660
gtggagaagg tcatcaagaa gtgccgccag gagtgggggg tggcctccat ctgcgacatc 720
gtgctcaatc acaccgccaa cgagtccgat tggctactac agcatccgga tgccacctac 780
tcatgcgcca cctgtcccta cctccgcccc gccttcctgc tggacgccac attcgcccag 840
tgcggagcgg acatagccga gggcagcctg gagcatgtag gcgtacctgc ggtcatcgag 900
caggagtgcc atttggaagc gttaaagtac cagttgcaca cctcctacat gtccaaggtc 960
aatatacacg agctgtatca gtgcgatgtg atgaagtacg tgaacgagtt catgtcccag 1020
gtgcgaactc gcgagccacc gaagaatgtg gccaacgagt gtcgcttcca ggaaatccaa 1080
ctgatacagg acccgcaata tcgacgcttg gccagcacca ttaatttcga gctggcgctg 1140
gagatcttta atgctttcca tggcgactgc ttcgatgagg agtcacggtt ccgcaagtgc 1200
gccgaaaccc tccgccggca tctcgatgcc ctcaacgatc gtgtgcgctg cgaggttcaa 1260
ggctacataa actatgcgat agacaatgtt ttggccggag ttcgctacga aagagtccag 1320
ggcgatgggc ccagagtgaa ggagatctcc gagaagcact cggtctttat ggtctacttt 1380
acgcataccg gcacccaggg aaaatcgctc actgagatcg aggcggatat gtataccaag 1440
gctggagagt tcttcatggc ccacaacggt tgggtcatgg gatacagcga tcctctgagg 1500
gattttgctg aggagcaacc tggacgcgcc aatgtctacc tcaagcggga gctcatctcg 1560
tggggcgata gtgtgaagtt gcgcttcggc agacggccgg aggacagtcc ctacctatgg 1620
cagcacatga ccgagtacgt tcagaccaca gcgcgcatct tcgacggtgt gcgattggac 1680
aactgccact ccacgccatt gcacgtagct gagtaccttc tcgatgcagc tcgtaagatc 1740
aacccagagc tgtatgtggt ggctgaactg ttcaccaatt ccgattacac cgacaatgtg 1800
tttgtgaacc gattgggtat cacctccttg atccgtgaag ctctttccgc ttgggactcc 1860
cacgagcaag gccgcttagt gtatcggtat ggaggagtgc ctgtaggtgg tttccaagca 1920
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<210> 8
<211> 4641
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 8
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<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 9
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<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
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aacccagagc tgtatgtggt ggctgaactg ttcaccaatt ccgattacac cgacaatgtg 1800
tttgtgaacc gattgggtat cacctccttg atccgtgaag ctctttccgc ttgggactcc 1860
cacgagcaag gccgcttagt gtatcggtat ggaggagtgc ctgtaggtgg tttccaagca 1920
aactcatcgc gccacgaggc caccagtgtc gctcatgccc tcttcctgga cctcacccac 1980
gataatccgt ctccggtgga gaagcgttcc gtgtacgatc ttctaccatc ggcggcactg 2040
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catatccatg tcgtagatga ggaacgcacc taccaagaat ggggcaaagg tgttgactcg 2160
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gagggattta gccaagttta cgtagaccag atggatccca acgtagttgc agttactcgt 2280
cattcgccaa tcacgcatca gtcagttatt ctcgtggccc acactgcctt tggctatccc 2340
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gtggcctaa 4629
<210> 11
<211> 4629
<212> DNA
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 11
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cagcacatga ccgagtacgt tcagaccaca gcgcgcatct tcgacggtgt gcgattggac 1680
aactgccact ccacgccatt gcacgtagct gagtaccttc tcgatgcagc tcgtaagatc 1740
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tttgtgaacc gattgggtat cacctccttg atccgtgaag ctctttccgc ttgggactcc 1860
cacgagcaag gccgcttagt gtatcggtat ggaggagtgc ctgtaggtgg tttccaagca 1920
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gataatccgt ctccggtgga gaagcgttcc gtgtacgatc ttctaccatc ggcggcactg 2040
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catatccatg tcgtagatga ggaacgcacc taccaagaat ggggcaaagg tgttgactcg 2160
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cattcgccaa tcacgcatca gtcagttatt ctcgtggccc acactgcctt tggctatccc 2340
tctcctaatg ccggacccac cggaatccgc ccgctgcgtt tcgagggtgt gctggacgag 2400
atcatcctgg aggccagctt gaccatgcag agtgacaagc cattcgatcg tcctgctcca 2460
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<211> 464
<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 12
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Val Val Gln Leu Pro Ser Val Lys Val Ala Leu Asp Ser Leu Ala Arg
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Asp Gly Ser Met Trp His Ala Val Glu Phe Ala Arg Gly Lys Glu Phe
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Asp Ala Phe Leu Ala Ile Gly Gly Gly Ser Ala Met Asp Thr Ala Lys
130 135 140
Ala Ala Asn Leu Phe Ser Ser Asp Ala Asn Ala Glu Phe Leu Asp Tyr
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Val Asn Cys Pro Ile Gly Arg Gly Lys Glu Ile Ser Val Lys Leu Lys
165 170 175
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Gly Val Ala Ile Phe Asp Tyr Lys Lys Leu His Ala Lys Thr Gly Ile
195 200 205
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210 215 220
Thr Leu Ser Gln Pro Gln Arg Val Met Ala Phe Ala Gly Phe Asp Val
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Phe Cys His Ala Leu Glu Ser Phe Thr Ala Val Asp Tyr Arg Glu Arg
245 250 255
Gly Leu Ala Pro Ser Asp Pro Ser Leu Arg Pro Thr Tyr Gln Gly Arg
260 265 270
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275 280 285
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Val Arg Asp Tyr Lys Pro Lys Gly Tyr Ser Ala Asp His Ala Leu Ile
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<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 13
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Arg Phe Val Leu Gln Glu Gln Arg Lys Phe Lys Ser Ala Thr Gly Asp
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Leu Ser Gln Leu Leu Asn Ser Ile Gln Thr Ala Ile Lys Ala Thr Ser
35 40 45
Ser Ala Val Arg Lys Ala Gly Ile Ala Lys Leu His Gly Phe Ala Gly
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Asp Val Asn Val Gln Gly Glu Glu Val Lys Lys Leu Asp Val Leu Ser
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Gly Val Phe Asn Tyr Ile Ala Ala Lys Lys Asp Pro Ala Lys Gly Lys
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Pro Tyr Gly Ala Arg Tyr Val Gly Ser Met Val Ala Asp Val His Arg
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<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ala Lys Gly Lys Pro Tyr Gly Ala Arg Tyr Val Gly Ser Met Val Ala
225 230 235 240
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260 265 270
Pro Met Ala Tyr Leu Met Ile Gln Ala Gly Gly Leu Ala Ser Asp Gly
275 280 285
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Pro Ile Phe Leu Gly Ser Lys Ser Asp Val Glu Glu Ala Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Leu Lys
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<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 16
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145 150 155 160
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165 170 175
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275 280 285
Leu Tyr Glu Cys Val Pro Met Ala Tyr Leu Met Ile Gln Ala Gly Gly
290 295 300
Leu Ala Ser Asp Gly Lys Ile Ser Ile Leu Asp Ile Val Pro Lys Lys
305 310 315 320
Ile His Glu Arg Ser Pro Ile Phe Leu Gly Ser Lys Ser Asp Val Glu
325 330 335
Glu Ala Leu Ser Tyr Leu Lys
340
<210> 17
<211> 1629
<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 17
Met Arg Tyr Gln Leu Phe Arg Trp Leu Tyr Gly Leu Ile Ala Thr Val
1 5 10 15
Asp Asn Glu Pro Leu Pro Leu Gln Ile Lys Ser Glu Glu Glu Ala Phe
20 25 30
Gly Glu Asn Lys Lys Lys Lys Gln Leu Ala Ser Leu Glu Asn Ala Ile
35 40 45
Ser Pro Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Ile Arg Thr Val Pro Ser Ala
50 55 60
Asn Ala Asn Ala Met Gly Asn Ala Gly Ser Ala Glu Ile Val Ser Asn
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Val Leu Ala Lys Leu Leu Gly Pro Leu Asp Thr Trp Glu Pro Lys
245 250 255
Leu Arg Val Ala Lys Glu Ala Gly Tyr Asn Val Ile His Phe Thr Pro
260 265 270
Ile Gln Glu Leu Gly Gly Ser Arg Ser Cys Tyr Ser Leu Arg Asp Gln
275 280 285
Leu Lys Val Asn Ser His Phe Ala Pro Gln Lys Gly Gly Lys Ile Ser
290 295 300
Phe Glu Asp Val Glu Lys Val Ile Lys Lys Cys Arg Gln Glu Trp Gly
305 310 315 320
Val Ala Ser Ile Cys Asp Ile Val Leu Asn His Thr Ala Asn Glu Ser
325 330 335
Asp Trp Leu Leu Gln His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Cys Ala Thr Cys
340 345 350
Pro Tyr Leu Arg Pro Ala Phe Leu Leu Asp Ala Thr Phe Ala Gln Cys
355 360 365
Gly Ala Asp Ile Ala Glu Gly Ser Leu Glu His Val Gly Val Pro Ala
370 375 380
Val Ile Glu Gln Glu Cys His Leu Glu Ala Leu Lys Tyr Gln Leu His
385 390 395 400
Thr Ser Tyr Met Ser Lys Val Asn Ile His Glu Leu Tyr Gln Cys Asp
405 410 415
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
Ala Ile Asp Asn Val Leu Ala Gly Val Arg Tyr Glu Arg Val Gln Gly
515 520 525
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565 570 575
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625 630 635 640
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675 680 685
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Gly Ser Ala Val Glu Leu Val Gly Leu Gln Tyr Ala Val Leu Arg Phe
1380 1385 1390
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1540 1545 1550
Arg Leu Ile Phe Ala Lys Lys Cys Gly His Leu Asp Glu Thr Ile Ala
1555 1560 1565
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1570 1575 1580
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Gly Asp Ser Cys Arg Thr Gln Ala Trp Ser Val Ala Ala Ile Leu Glu
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1620 1625
<210> 18
<211> 1542
<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 18
Met Ser Thr Met Gly Lys Glu Thr Glu Ser His Ser Ile Pro Ile Ser
1 5 10 15
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Val Glu Leu Asn Met Ser Gly Thr Tyr His Phe Tyr Phe Arg Tyr Leu
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Gly Pro Leu Asp Thr Trp Glu Pro Lys Leu Arg Val Ala Lys Glu Ala
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Gly Tyr Asn Val Ile His Phe Thr Pro Ile Gln Glu Leu Gly Gly Ser
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Leu Leu Asp Ala Thr Phe Ala Gln Cys Gly Ala Asp Ile Ala Glu Gly
275 280 285
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Leu Glu Ala Leu Lys Tyr Gln Leu His Thr Ser Tyr Met Ser Lys Val
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Asn Ile His Glu Leu Tyr Gln Cys Asp Val Met Lys Tyr Val Asn Glu
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Asn Cys His Ser Thr Pro Leu His Val Ala Glu Tyr Leu Leu Asp Ala
565 570 575
Ala Arg Lys Ile Asn Pro Glu Leu Tyr Val Val Ala Glu Leu Phe Thr
580 585 590
Asn Ser Asp Tyr Thr Asp Asn Val Phe Val Asn Arg Leu Gly Ile Thr
595 600 605
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610 615 620
Arg Leu Val Tyr Arg Tyr Gly Gly Val Pro Val Gly Gly Phe Gln Ala
625 630 635 640
Asn Ser Ser Arg His Glu Ala Thr Ser Val Ala His Ala Leu Phe Leu
645 650 655
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675 680 685
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755 760 765
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820 825 830
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835 840 845
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885 890 895
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
Asn Asn Leu Arg Asp Gly Asn Trp Met Met Asp Tyr Ile Ser Asp Arg
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Leu Gly Ala Asp Val Ala
1540
<210> 19
<211> 1546
<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 19
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Leu Leu Asp Ala Ala Arg Lys Ile Asn Pro Glu Leu Tyr Val Val Ala
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Glu Leu Phe Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Asp Asn Val Phe Val Asn Arg
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Leu Gly Ile Thr Ser Leu Ile Arg Glu Ala Leu Ser Ala Trp Asp Ser
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Gly Phe Gln Ala Asn Ser Ser Arg His Glu Ala Thr Ser Val Ala His
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Ala Leu Phe Leu Asp Leu Thr His Asp Asn Pro Ser Pro Val Glu Lys
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Arg Ser Val Tyr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Ala Leu Val Ser Met Ala
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<211> 1542
<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 21
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1250 1255 1260
Cys Gly Thr Trp Met Asp Lys Met Gly Ser Ser Gln Lys Ala Gly Asn
1265 1270 1275 1280
Lys Gly Arg Pro Ser Thr Pro Arg Asp Gly Ser Ala Val Glu Leu Val
1285 1290 1295
Gly Leu Gln Tyr Ala Val Leu Arg Phe Met Gln Ser Leu Ala Glu Lys
1300 1305 1310
Glu Val Ile Pro Tyr Thr Gly Val Glu Arg Lys Gly Pro Ser Gly Glu
1315 1320 1325
Val Thr Lys Trp Ser Tyr Lys Glu Trp Ala Asp Arg Ile Lys Asn Asn
1330 1335 1340
Phe Asp Lys Tyr Phe Phe Val Ser Glu Ser Glu Thr Cys Ser Val Ala
1345 1350 1355 1360
Asn Lys Lys Leu Ile Tyr Lys Asp Ser Tyr Gly Ala Thr Gln Ser Trp
1365 1370 1375
Thr Asp Tyr Gln Leu Arg Cys Asn Phe Pro Ile Thr Leu Thr Val Ala
1380 1385 1390
Pro Asp Leu Cys Asn Pro Gln Asn Ala Trp Arg Ala Leu Glu Arg Ala
1395 1400 1405
Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Pro Leu Gly Met Lys Thr Met Asp Pro Glu
1410 1415 1420
Asp Trp Asn Tyr Arg Ala Asn Tyr Asp Asn Ser Asn Asp Ser Thr Asp
1425 1430 1435 1440
Cys Thr Val Ala His Gly Ala Asn Tyr His Gln Gly Pro Glu Trp Val
1445 1450 1455
Trp Pro Ile Gly Phe Tyr Leu Arg Ala Arg Leu Ile Phe Ala Lys Lys
1460 1465 1470
Cys Gly His Leu Asp Glu Thr Ile Ala Glu Thr Trp Ala Ile Leu Arg
1475 1480 1485
Ala His Leu Arg Glu Leu Gln Thr Ser His Trp Arg Gly Leu Pro Glu
1490 1495 1500
Leu Thr Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Cys Gly Asp Ser Cys Arg Thr Gln
1505 1510 1515 1520
Ala Trp Ser Val Ala Ala Ile Leu Glu Val Leu Tyr Asp Leu His Ser
1525 1530 1535
Leu Gly Ala Asp Val Ala
1540
<210> 22
<211> 1542
<212> PRT
<213> 果蝇种(Drosophila sp.)
<400> 22
Met Ser Thr Met Gly Lys Glu Thr Glu Ser His Ser Ile Pro Ile Ser
1 5 10 15
Glu Gly Gln Asp Ala Glu His Ile Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Gly Ser
20 25 30
Lys Leu Ser Val His Pro Asp Ala Ser Leu Leu Gly Arg Lys Ile Val
35 40 45
Leu Tyr Thr Asn Tyr Pro Ala Glu Gly Gln Lys Phe Val Arg Thr Glu
50 55 60
Tyr Arg Val Leu Gly Trp Gln Leu Ser Asn Gly Lys Gln Ile Thr Ser
65 70 75 80
Val Met His Pro Glu Ala His Val Val Asp Thr Asp Ile Arg Ser Gln
85 90 95
Val Glu Leu Asn Met Ser Gly Thr Tyr His Phe Tyr Phe Arg Tyr Leu
100 105 110
Glu Arg Pro Asp Thr Gly Cys Ser Gly Ala Asp Gly Ala Leu Tyr Val
115 120 125
Gln Val Glu Pro Thr Leu His Val Gly Pro Pro Gly Ala Gln Lys Thr
130 135 140
Ile Pro Leu Asp Ser Val Arg Cys Gln Thr Val Leu Ala Lys Leu Leu
145 150 155 160
Gly Pro Leu Asp Thr Trp Glu Pro Lys Leu Arg Val Ala Lys Glu Ala
165 170 175
Gly Tyr Asn Val Ile His Phe Thr Pro Ile Gln Glu Leu Gly Gly Ser
180 185 190
Arg Ser Cys Tyr Ser Leu Arg Asp Gln Leu Lys Val Asn Ser His Phe
195 200 205
Ala Pro Gln Lys Gly Gly Lys Ile Ser Phe Glu Asp Val Glu Lys Val
210 215 220
Ile Lys Lys Cys Arg Gln Glu Trp Gly Val Ala Ser Ile Cys Asp Ile
225 230 235 240
Val Leu Asn His Thr Ala Asn Glu Ser Asp Trp Leu Leu Gln His Pro
245 250 255
Asp Ala Thr Tyr Ser Cys Ala Thr Cys Pro Tyr Leu Arg Pro Ala Phe
260 265 270
Leu Leu Asp Ala Thr Phe Ala Gln Cys Gly Ala Asp Ile Ala Glu Gly
275 280 285
Ser Leu Glu His Val Gly Val Pro Ala Val Ile Glu Gln Glu Cys His
290 295 300
Leu Glu Ala Leu Lys Tyr Gln Leu His Thr Ser Tyr Met Ser Lys Val
305 310 315 320
Asn Ile His Glu Leu Tyr Gln Cys Asp Val Met Lys Tyr Val Asn Glu
325 330 335
Phe Met Ser Gln Val Arg Thr Arg Glu Pro Pro Lys Asn Val Ala Asn
340 345 350
Glu Cys Arg Phe Gln Glu Ile Gln Leu Ile Gln Asp Pro Gln Tyr Arg
355 360 365
Arg Leu Ala Ser Thr Ile Asn Phe Glu Leu Ala Leu Glu Ile Phe Asn
370 375 380
Ala Phe His Gly Asp Cys Phe Asp Glu Glu Ser Arg Phe Arg Lys Cys
385 390 395 400
Ala Glu Thr Leu Arg Arg His Leu Asp Ala Leu Asn Asp Arg Val Arg
405 410 415
Cys Glu Val Gln Gly Tyr Ile Asn Tyr Ala Ile Asp Asn Val Leu Ala
420 425 430
Gly Val Arg Tyr Glu Arg Val Gln Gly Asp Gly Pro Arg Val Lys Glu
435 440 445
Ile Ser Glu Lys His Ser Val Phe Met Val Tyr Phe Thr His Thr Gly
450 455 460
Thr Gln Gly Lys Ser Leu Thr Glu Ile Glu Ala Asp Met Tyr Thr Lys
465 470 475 480
Ala Gly Glu Phe Phe Met Ala His Asn Gly Trp Val Met Gly Tyr Ser
485 490 495
Asp Pro Leu Arg Asp Phe Ala Glu Glu Gln Pro Gly Arg Ala Asn Val
500 505 510
Tyr Leu Lys Arg Glu Leu Ile Ser Trp Gly Asp Ser Val Lys Leu Arg
515 520 525
Phe Gly Arg Arg Pro Glu Asp Ser Pro Tyr Leu Trp Gln His Met Thr
530 535 540
Glu Tyr Val Gln Thr Thr Ala Arg Ile Phe Asp Gly Val Arg Leu Asp
545 550 555 560
Asn Cys His Ser Thr Pro Leu His Val Ala Glu Tyr Leu Leu Asp Ala
565 570 575
Ala Arg Lys Ile Asn Pro Glu Leu Tyr Val Val Ala Glu Leu Phe Thr
580 585 590
Asn Ser Asp Tyr Thr Asp Asn Val Phe Val Asn Arg Leu Gly Ile Thr
595 600 605
Ser Leu Ile Arg Glu Ala Leu Ser Ala Trp Asp Ser His Glu Gln Gly
610 615 620
Arg Leu Val Tyr Arg Tyr Gly Gly Val Pro Val Gly Gly Phe Gln Ala
625 630 635 640
Asn Ser Ser Arg His Glu Ala Thr Ser Val Ala His Ala Leu Phe Leu
645 650 655
Asp Leu Thr His Asp Asn Pro Ser Pro Val Glu Lys Arg Ser Val Tyr
660 665 670
Asp Leu Leu Pro Ser Ala Ala Leu Val Ser Met Ala Cys Cys Ala Thr
675 680 685
Gly Ser Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Leu Val Pro His His Ile His Val
690 695 700
Val Asp Glu Glu Arg Thr Tyr Gln Glu Trp Gly Lys Gly Val Asp Ser
705 710 715 720
Lys Ser Gly Ile Met Gly Ala Lys Arg Ala Leu Asn Leu Leu His Gly
725 730 735
Gln Leu Ala Glu Glu Gly Phe Ser Gln Val Tyr Val Asp Gln Met Asp
740 745 750
Pro Asn Val Val Ala Val Thr Arg His Ser Pro Ile Thr His Gln Ser
755 760 765
Val Ile Leu Val Ala His Thr Ala Phe Gly Tyr Pro Ser Pro Asn Ala
770 775 780
Gly Pro Thr Gly Ile Arg Pro Leu Arg Phe Glu Gly Val Leu Asp Glu
785 790 795 800
Ile Ile Leu Glu Ala Ser Leu Thr Met Gln Ser Asp Lys Pro Phe Asp
805 810 815
Arg Pro Ala Pro Phe Lys Lys Asp Pro Asn Val Ile Asn Gly Phe Thr
820 825 830
Gln Phe Gln Leu Asn Leu Gln Glu His Ile Pro Leu Ala Lys Ser Thr
835 840 845
Val Phe Gln Thr Gln Ala Tyr Ser Asp Gly Asn Asn Thr Glu Leu Asn
850 855 860
Phe Ala Asn Leu Arg Pro Gly Thr Val Val Ala Ile Arg Val Ser Met
865 870 875 880
His Pro Gly Pro Arg Thr Ser Phe Asp Lys Leu Gln Lys Ile Ser Ala
885 890 895
Ala Leu Arg Ile Gly Ser Gly Glu Glu Tyr Ser Gln Leu Gln Ala Ile
900 905 910
Val Ser Lys Leu Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Ala Leu Phe Ser Cys
915 920 925
Asp Asp Glu Glu Arg Asp Leu Gly Lys Gly Gly Thr Ala Tyr Asp Ile
930 935 940
Pro Asn Phe Gly Lys Ile Val Tyr Cys Gly Leu Gln Gly Phe Ile Ser
945 950 955 960
Leu Leu Thr Glu Ile Ser Pro Lys Asn Asp Leu Gly His Pro Leu Cys
965 970 975
Asn Asn Leu Arg Asp Gly Asn Trp Met Met Asp Tyr Ile Ser Asp Arg
980 985 990
Leu Thr Ser Tyr Glu Asp Leu Lys Pro Leu Ser Ala Trp Phe Lys Ala
995 1000 1005
Thr Phe Glu Pro Leu Lys Asn Ile Pro Arg Tyr Leu Ile Pro Cys Tyr
1010 1015 1020
Phe Asp Ala Ile Val Ser Gly Val Tyr Asn Val Leu Ile Asn Gln Val
1025 1030 1035 1040
Asn Glu Leu Met Pro Asp Phe Ile Lys Asn Gly His Ser Phe Pro Gln
1045 1050 1055
Ser Leu Ala Leu Ser Thr Leu Gln Phe Leu Ser Val Cys Lys Ser Ala
1060 1065 1070
Asn Leu Pro Gly Phe Ser Pro Ala Leu Ser Pro Pro Lys Pro Pro Lys
1075 1080 1085
Gln Cys Val Thr Leu Ser Ala Gly Leu Pro His Phe Ser Thr Gly Tyr
1090 1095 1100
Met Arg Cys Trp Gly Arg Asp Thr Phe Ile Ala Leu Arg Gly Ser Met
1105 1110 1115 1120
Phe Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Phe Ile Ile Ile Gly Phe
1125 1130 1135
Gly Gln Thr Leu Arg His Gly Leu Ile Pro Asn Leu Leu Asp Ser Gly
1140 1145 1150
Ser Lys Pro Arg Phe Asn Cys Arg Asp Ala Ile Trp Trp Trp Met Tyr
1155 1160 1165
Cys Ile Lys Gln Tyr Val Glu Asp Ala Pro Lys Gly Ala Glu Ile Leu
1170 1175 1180
Lys Asp Lys Val Ser Arg Ile Phe Pro Tyr Asp Asp Ala Asp Ala His
1185 1190 1195 1200
Ala Pro Gly Ala Phe Asp Gln Leu Leu Phe Asp Val Met Gln Glu Ala
1205 1210 1215
Leu Gln Val His Phe Gln Gly Leu Gln Tyr Arg Glu Arg Asn Ala Gly
1220 1225 1230
Tyr Glu Ile Asp Ala His Met Val Asp Gln Gly Phe Asn Asn Gln Ile
1235 1240 1245
Gly Ile His Pro Glu Thr Gly Phe Val Phe Gly Gly Asn Asn Phe Asn
1250 1255 1260
Cys Gly Thr Trp Met Asp Lys Met Gly Ser Ser Gln Lys Ala Gly Asn
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Lys Gly Arg Pro Ser Thr Pro Arg Asp Gly Ser Ala Val Glu Leu Val
1285 1290 1295
Gly Leu Gln Tyr Ala Val Leu Arg Phe Met Gln Ser Leu Ala Glu Lys
1300 1305 1310
Glu Val Ile Pro Tyr Thr Gly Val Glu Arg Lys Gly Pro Ser Gly Glu
1315 1320 1325
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1330 1335 1340
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1365 1370 1375
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1395 1400 1405
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1540