高分子凝集体的制造方法与流程

文档序号：15234552发布日期：2018-08-21 20:16阅读：348来源：国知局

本发明涉及高分子凝集体的制造方法。

背景技术：

蛛丝也被称为蜘蛛丝(spidersilk)，已知是以天然蛛丝作为起始物质，利用生物合成技术而产生的。已知有将蛛丝蛋白成形为各种形状的高分子凝集体。例如，在专利文献1中公开了使用蛛丝蛋白的膜。另外，在专利文献2中公开了来源于蛛丝蛋白的多肽颗粒。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2008-507260号公报

专利文献2：国际公开第2014/61043号

技术实现要素：

发明所要解决的问题

但是，蛋白质容易溶解于水或其他溶剂，即使以规定形状挤出至凝固液中也会溶解于凝固液，难以以良好的成品率得到纤维形状、膜形状等的成形物。

因此，本发明的目的在于提供能够容易地得到各种形状的高分子凝集体的高分子凝集体的制造方法。

用于解决问题的方法

本发明提供一种高分子凝集体的制造方法，其具备：使含有高分子物质和凝胶形成用阳离子的高分子溶液与含有凝胶形成用阴离子的阴离子溶液接触而在上述高分子溶液与上述阴离子溶液的界面形成凝胶的工序；和在上述凝胶的内部使上述高分子物质凝集的工序。

在本发明的制造方法中，利用凝胶形成用阳离子和凝胶形成用阴离子在高分子溶液与阴离子溶液的界面形成凝胶。由此，在所形成的凝胶的内部封入含有高分子物质的溶液。此时，凝胶像透析膜那样发挥功能，高分子溶液和阴离子溶液中的小分子(例如溶剂、盐等)经由凝胶发生移动，另一方面，高分子物质停留于凝胶内部，凝集而形成高分子凝集体。在该制造方法中，所得到的高分子凝集体的形状取决于所形成的凝胶的形状。凝胶是通过高分子溶液与阴离子溶液的接触形成的，因此能够以简便的操作成形为例如纤维、膜、中空管、珠等各种各样的形状。因此，根据本发明的制造方法，能够容易地得到各种各样形状的高分子凝集体。

上述凝胶形成用阳离子可以为选自多价阳离子或氢离子中的至少一种。另外，上述凝胶形成用阴离子可以为海藻酸根离子。

上述阴离子溶液优选进一步含有高分子物质的凝集促进剂。由此，能够以更短的时间制造高分子凝集体。

上述高分子溶液可以进一步含有高分子物质的溶解促进剂。

本发明的制造方法中，高分子物质不会经由凝胶而移动，因此能够在水系中制造高分子凝集体。因此，上述高分子溶液和阴离子溶液的溶剂可以为水。由于能够在水系中制造高分子凝集体，因此能够简化废液处理等的工序，并且没有在所得到的高分子凝集体中混入非水系溶剂的风险，因此还具有能够容易地扩大高分子凝集体的用途的优点。

本发明的制造方法基于使凝胶像透析膜那样发挥功能、在凝胶的内部使高分子物质凝集这样的作用，因此高分子物质的种类没有特别限制，典型地，高分子物质优选为蛋白质。另外，蛋白质的种类没有特别限制，例如可以为来源于蛛丝蛋白的多肽。

发明效果

根据本发明，可以提供能够容易地得到各种各样形状的高分子凝集体的、高分子凝集体的制造方法。在本发明的制造方法中，所得到的高分子凝集体的形状取决于所形成的凝胶的形状。凝胶是通过高分子溶液与阴离子溶液的接触形成的，因此能够以简便的操作成形为例如纤维、膜、中空管、珠等各种各样的形状。

附图说明

图1是示出一个实施方式的制造方法的说明图，(a)是示出将高分子溶液(胶液(ドープ液))挤出至阴离子溶液(凝固液)中的工序的说明图，(b)是示出将被凝胶包覆的高分子凝集体浸渍到水中、使其进一步凝集的工序的说明图。

图2是示出一个实施方式的制造方法的说明图。

图3是示出一个实施方式的制造方法的说明图。

图4(a)是示出一个实施方式的制造方法的说明图，图4(b)是图4(a)中由a包围的部分的放大图。

图5是示出一个实施方式的制造方法中的凝固液-凝胶-胶液的界面的示意截面图。

图6是一个实施方式的制造工序图。

图7是示出实施例1中得到的高分子凝集体(蛛丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图，(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片，(b)是示出除去凝胶后的高分子凝集体的照片，(c)是对(a)的照片进行描迹而得到的描迹图，(d)是对(b)的照片进行描迹而得到的描迹图。

图8是示出实施例2中得到的高分子凝集体(蛛丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图，(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片，(b)是示出除去凝胶后的高分子凝集体的照片，(c)是对(a)的照片进行描迹而得到的描迹图，(d)是对(b)的照片进行描迹而得到的描迹图。

图9是示出实施例3中得到的高分子凝集体(丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图，(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片，(b)是对(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。

图10是示出实施例4中得到的高分子凝集体(丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图，(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片，(b)是对(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。

图11是示出实施例6中得到的高分子凝集体(明胶蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图，(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片，(b)是对(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。

具体实施方式

以下，根据情况参考附图对本发明的优选实施方式详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施方式。需要说明的是，附图中，对相同或相当的部分标注相同标号，并适当省略重复的说明。

本发明的高分子凝集体的制造方法具备：使含有高分子物质和凝胶形成用阳离子的高分子溶液与含有凝胶形成用阴离子的阴离子溶液接触而在上述高分子溶液与上述阴离子溶液的界面形成凝胶的工序(以下也称为“凝胶形成工序”)；和在上述凝胶的内部使上述高分子物质凝集的工序(以下也称为“凝集工序”)。

(高分子溶液)

作为原料的高分子物质没有特别限制，可以使用任意的高分子物质。作为高分子物质的具体例，可以列举例如蛋白质、核酸、脂质和多糖类(例如纤维素、淀粉等)等生物体高分子、合成树脂(例如聚氯乙烯、聚乙烯、酚醛树脂等)、硅树脂(例如硅橡胶等)、合成纤维(例如尼龙、维尼纶、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等)和合成橡胶(例如丁二烯橡胶、异戊二烯橡胶等)等合成高分子。

蛋白质等生物体高分子、特别是高分子凝集体的制造工序还有改良的余地，因此，本发明的制造方法适合应用于蛋白质等生物体高分子。蛋白质的种类没有限制，可以应用于任意的蛋白质。作为原料的蛋白质可以是通过基因重组技术利用微生物等制造的蛋白质，也可以是通过合成而制造的蛋白质，另外还可以是对天然来源的蛋白质进行纯化而得到的蛋白质。

作为蛋白质，优选结构蛋白质。结构蛋白质是具有构建生物体结构的作用的蛋白质，与酶、激素、抗体等功能蛋白质不同。作为结构蛋白质，可以列举天然存在的丝心蛋白、胶原蛋白、节肢弹性蛋白、弹性蛋白和角蛋白等天然型结构蛋白质。作为天然存在的丝心蛋白，已知有昆虫和蜘蛛类产生的丝心蛋白。在本实施方式中，结构蛋白质优选包含蜘蛛丝蛋白。需要说明的是，结构蛋白质中，优选为选自来源于蛛丝蛋白的多肽(蛛丝丝心蛋白)、丝蛋白(蚕丝、蚕丝丝心蛋白等)、明胶、胶原蛋白和弹性蛋白中的至少一种。这些蛋白质容易成形为以纤维为代表的各种形状。

作为昆虫产生的丝心蛋白，可以列举例如家蚕(bombyxmori)、野桑蚕(bombyxmandarina)、天蚕(antheraeayamamai)、柞蚕(anteraeapernyi)、枫蚕(eriogynapyretorum)、蓖麻蚕(pilosamiacynthiaricini)、樗蚕(samiacynthia)、樟蚕(caligurajaponica)、印度柞蚕(antheraeamylitta)、琥珀蚕(antheraeaassama)等蚕产生的蚕丝蛋白、雀蜂(vespasimillimaxanthoptera)的幼虫吐出的蜂丝蛋白。

作为昆虫产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如蚕·丝心蛋白l链(genbank登录号m76430(碱基序列)、aaa27840.1(氨基酸序列))。

蚕丝是由作为家蚕(bombyxmori)的幼虫的蚕所形成的茧得到的纤维(茧丝)。茧丝以2根丝心蛋白被胶质(丝胶蛋白)包覆的形式而形成1根茧丝。丝心蛋白由很多原纤维构成，丝心蛋白的外侧被4层丝胶蛋白包覆，构成1根茧丝。

蚕丝丝心蛋白是以野生蚕或家蚕的茧、或者旧的或废弃的丝绸料为原料，将包覆丝心蛋白的丝胶蛋白和其他脂肪成分等除去并进行纯化而得到的。蚕丝丝心蛋白优选将纯化的丝心蛋白制成冷冻干燥粉末而得到。

蛛丝丝心蛋白是蜘蛛类产生的丝心蛋白。蜘蛛具有最多7个种类的丝腺，分别产生性质不同的丝心蛋白(蜘蛛丝蛋白)。蜘蛛丝蛋白根据其来源的器官而被命名为具有高韧性的大壶状腺蜘蛛蛋白质(majorampullatespiderprotein、masp)、具有高度伸长力的小壶状腺蜘蛛蛋白质(minorampullatespiderprotein、misp)、以及鞭状腺(flagelliform(flag))、管状腺(tubuliform)、聚状腺(aggregate)、葡萄状腺(aciniform)和梨状腺(pyriform)的各蜘蛛丝蛋白。

作为蜘蛛类产生的丝心蛋白，可以列举例如大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛和野岛园蛛(araneusnojimai)等属于园蛛属(araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛和类青新园蛛等属于新园蛛属(neoscona属)的蜘蛛、小岬蛛等属于岬蛛属(pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛和对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛和乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛和六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛和横纹金蛛等属于金蛛属(argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(acusilas属)的蜘蛛、红云斑蛛、花云斑蛛和全色云斑蛛等属于云斑蛛属(cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(poltys属)的蜘蛛、八瘤艾蛛、四突艾蛛、圆腹艾蛛和黑尾艾蛛等属于艾蛛属(cyclosa属)的蜘蛛和日本壮头蛛等属于壮头蛛属(chorizopes属)的蜘蛛所产生的蜘蛛丝蛋白、以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸和鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛和小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇和斑络新妇等属于络新妇属(nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(dyschiriognatha属)的蜘蛛、红斑寇蛛、哈氏寇蛛、几何寇蛛和间斑寇蛛等属于冠蛛属(latrodectus属)的蜘蛛、以及属于育儿网蛛属(euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蜘蛛丝蛋白。作为蜘蛛丝蛋白，可以列举例如masp(masp1和masp2)、adf(adf3和adf4)等牵引丝蛋白、misp(misp1和misp2)等。

作为蜘蛛类产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如丝心蛋白-3(adf-3)[十字园蛛(araneusdiadematus)来源](genbank登录号aac47010(氨基酸序列)、u47855(碱基序列))、丝心蛋白-4(adf-4)[十字园蛛来源](genbank登录号aac47011(氨基酸序列)、u47856(碱基序列))、牵引丝蛋白(draglinesilkprotein)蛛丝蛋白1[金纺蜘蛛(nephilaclavipes)来源](genbank登录号aac04504(氨基酸序列)、u37520(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1[黑寡妇蜘蛛(latrodectushesperus)来源](genbank登录号abr68856(氨基酸序列)、ef595246(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白2[棒络新妇(nephilaclavata)来源](genbank登录号aal32472(氨基酸序列)、af441245(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1[非洲育儿网蛛(euprosthenopsaustralis)来源](genbank登录号caj00428(氨基酸序列)、aj973155(碱基序列))和大壶状腺蛛丝蛋白2[非洲育儿网蛛](genbank登录号cam32249.1(氨基酸序列)、am490169(碱基序列))、小壶状腺丝蛋白1[金纺蜘蛛](genbank登录号aac14589.1(氨基酸序列))、小壶状腺丝蛋白2[金纺蜘蛛](genbank登录号aac14591.1(氨基酸序列))、小壶状腺蛛丝蛋白样蛋白质[nephilengyscruentata](genbank登录号abr37278.1(氨基酸序列)等。

作为天然来源的丝心蛋白的更具体的示例，可以进一步列举在ncbigenbank中登记了序列信息的丝心蛋白。例如，可以通过从ncbigenbank中登记的序列信息中包含inv作为分类码(division)的序列中提取出在定义(definition)中记载了蛛丝蛋白、壶状腺、丝心蛋白、“丝和多肽”或“丝和蛋白质”作为关键词的序列、从cds中提取出特定产物的字符串、从来源数据(source)中提取出在组织类型中(tissuetype)记载了特定字符串的序列来确认。

蛋白质也可以为来源于上述天然型蛋白质的多肽、即重组多肽。例如，重组丝心蛋白在若干异种蛋白质生产系统中产生，作为其制造方法，利用转基因山羊、转基因蚕、或者重组植物或哺乳类细胞。

重组丝心蛋白例如也可以通过下述方式得到：设计天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列、或者与相当于在天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改变相当的氨基酸序列，对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成。

大吐丝管牵引丝蛋白的重组多肽例如可以以包含式1：[(a)n基序-rep]m所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式1中，(a)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为70％以上。rep表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示5～300的整数。多个存在的(a)n基序可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。多个存在的rep可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列)的形式来表示。具体而言，可以列举包含序列号1～3和序列号8、9所示的氨基酸序列的蛋白质。

作为胶原蛋白的重组多肽，可以列举例如包含式2：[rep2]o所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式2中，o表示5～300的整数。rep2表示由gly-x-y构成的氨基酸序列，x和y表示gly以外的任意氨基酸残基。多个存在的rep2可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列)。具体而言，可以列举包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号10所示的氨基酸序列是在与由ncbi数据库获得的人iv型胶原蛋白的部分序列(ncbi的genbank登录号：caa56335.1、gi：3702452)的重复部分和基序相当的第301位残基至第540位残基的氨基酸序列的n末端附加序列号4所示的氨基酸序列而得到的氨基酸序列。

作为节肢弹性蛋白的重组多肽，可以列举例如包含式3：[rep3]p所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式3中，p表示4～300的整数。rep3表示由ser-j-j-tyr-gly-u-pro构成的氨基酸序列。j表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由asp、ser和thr组成的组中的氨基酸残基。u表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由pro、ala、thr和ser组成的组中的氨基酸残基。多个存在的rep3可以为相互相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列)。具体而言，可以列举包含序列号11所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号11所示的氨基酸序列是在节肢弹性蛋白(ncbi的genbank登录号np611157、gl：24654243)的氨基酸序列中将第87位残基的thr置换为ser、且将第95位残基的asn置换为asp的序列的从第19位残基至第321位残基的氨基酸序列的n末端附加序列号4所示的氨基酸序列而得到的氨基酸序列。

作为弹性蛋白的重组多肽，可以列举例如具有ncbi的genbank登录号aac98395(人)、i47076(绵羊)、np786966(牛)等的氨基酸序列的蛋白质。具体而言，可以列举包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质。序列号12所示的氨基酸序列是在ncbi的genbank登录号aac98395的氨基酸序列的第121位残基至第390位残基的氨基酸序列的n末端附加序列号4所示的氨基酸序列而得到的氨基酸序列。

作为角蛋白的重组多肽，可以列举例如山羊(caprahircus)的i型角蛋白等。具体而言，可以列举包含序列号13所示的氨基酸序列(ncbi的genbank登录号acy30466的氨基酸序列)的蛋白质。

重组多肽也可以为包含与上述丝心蛋白的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的重组丝心蛋白。

上述重组丝心蛋白可以在n末端和c末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。由此，能够进行重组丝心蛋白的分离、固定化、检测和可视化等。

作为标签序列，可以列举例如利用与其他分子的特异性亲和性(结合性、affinity)的亲和性标签。作为亲和性标签的具体例，可以列举组氨酸标签(his标签)。his标签是4至10个左右的组氨酸残基排列而成的短肽，具有与镍等金属离子特异性结合的性质，因此能够用于基于金属螯合层析(chelatingmetalchromatography)的重组丝心蛋白的分离。作为标签序列的具体例，可以列举例如序列号4所示的氨基酸序列。

另外，也可以利用与谷胱甘肽特异性结合的谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、与麦芽糖特异性结合的麦芽糖结合蛋白(mbp)等标签序列。

此外，也可以使用利用抗原抗体反应的“表位标签”。通过附加显示抗原性的肽(表位)作为标签序列，能够使针对该表位的抗体进行结合。作为表位标签，可以列举ha(流感病毒的血凝素的肽序列)标签、myc标签、flag标签等。通过利用表位标签，能够以高特异性容易地对重组丝心蛋白进行纯化。

也可以使用进一步利用特定的蛋白酶切去标签序列后的重组丝心蛋白。也可以通过对藉由该标签序列吸附的蛋白质进行蛋白酶处理而将切去标签序列后的重组丝心蛋白回收。

以下对利用基因重组技术制造蛋白质的方法进行详述。该蛋白质例如可以通过利用具有编码该蛋白质的核酸序列和与该核酸序列以可工作的方式连接的一个或多个调节序列的表达载体对宿主进行转化，利用转化后的宿主对该核酸进行表达来生产。

编码蛋白质的基因的制造方法没有特别限制。例如，可以通过利用编码天然结构蛋白质的基因、使用聚合酶链式反应(pcr)等进行扩增并进行克隆的方法或者通过化学合成来制造基因。基因的化学合成方法也没有特别限制，例如可以基于由ncbi的网络数据库等获得的结构蛋白质的氨基酸序列信息，通过利用pcr等将利用aktaoligopilotplus10/100(gehealthjapan株式会社)等自动合成的寡核苷酸连接的方法来化学合成基因。此时，为了易于进行蛋白质的纯化和确认，可以合成编码由在上述氨基酸序列的n末端附加有由起始密码子和his10标签构成的氨基酸序列的氨基酸序列构成的蛋白质的基因。

调节序列是对宿主中的重组蛋白质的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。作为启动子，可以使用在宿主细胞中发挥功能、能够诱导目标蛋白质表达的诱导型启动子。诱导型启动子是可以通过存在诱导物质(表达诱导剂)、不存在阻抑分子、或者温度、渗透压或ph值的上升或降低等物理因素来调控转录的启动子。

表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人造染色体载体等。作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够并入到宿主的染色体中、且在能够对编码目标蛋白质的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。

作为宿主，可以适当使用原核生物以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物中的任意一种。

作为原核生物的优选例，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的细菌。

作为导入编码蛋白质的核酸的载体，可以列举例如pbtrp2(勃林格殷格翰公司制造)、pgex(pharmacia公司制造)、puc18、pbluescriptii、psupex、pet22b、pcold、pub110、pnco2(日本特开2002-238569号公报)等。

作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母和丝状真菌(霉菌等)。

作为酵母，可以列举例如属于酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属等的酵母。作为丝状真菌，可以列举例如属于曲霉属、青霉属、木霉(trichoderma)属等的丝状真菌。

作为载体，可以列举例如yep13(atcc37115)、yep24(atcc37051)等。

作为向上述宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向上述宿主细胞中导入dna的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[proc.natl.acad.sci.usa,69,2110(1972)]、电穿孔法、原生质球法、原生质体法、醋酸锂法、感受态细胞法等。

作为基于利用表达载体进行了转化的宿主的核酸的表达方法，除了直接表达以外，还可以依据分子克隆第二版中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白质表达等。

蛋白质例如可以通过将利用表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养，使该蛋白质在培养用培养基中生成蓄积、并从该培养用培养基中收集来制造。将宿主在培养用培养基中进行培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法来进行。

在宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为宿主的培养用培养基，只要是含有宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。

作为碳源，只要是宿主可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。

作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。

作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。

大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的ph优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的ph的调整可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。

另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导型启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙醇-β-硫代吡喃半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。

蛋白质的分离、纯化可以利用通常使用的方法来进行。例如，在蛋白质以溶解状态在细胞内表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、manton-gaulin匀浆器和戴诺研磨机(dyno-mill)等将宿主细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过离心分离该无细胞提取液而得到的上清中，单独或组合使用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(deae)-琼脂糖、diaionhpa-75(三菱化成公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用s-琼脂糖ff(pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。

另外，在蛋白质在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，同样地回收宿主细胞后将其破碎并进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收改造丝心蛋白的不溶体。回收的改造丝心蛋白的不溶体可以利用蛋白质变性剂进行可溶化。该操作后，通过与上述同样的分离纯化法能够得到改造丝心蛋白的纯化制备品。

在蛋白质被分泌至细胞外的情况下，可以从培养上清中回收该蛋白质。即，通过利用离心分离等方法对培养物进行处理而取得培养上清，通过使用与上述同样的分离纯化法，能够从该培养上清中得到纯化制备品。

凝胶形成用阳离子是与凝胶形成用阴离子结合而形成凝胶的阳离子。凝胶形成用阳离子典型地为多价阳离子和氢离子(质子)。多价阳离子是具有2价以上的正电荷的化合物，可以列举例如2价以上的金属阳离子、在1分子中具有2个以上阳离子性基团的化合物。作为在1分子中具有2个以上阳离子性基团的化合物，可以列举例如在1分子中具有2个以上氨基的多胺的离子。作为2价以上的金属阳离子，可以列举例如ca²⁺、mg²⁺等碱土金属离子、mn²⁺、fe²⁺、fe³⁺、co²⁺、cu²⁺等过渡金属离子、zn²⁺、al³⁺。

凝胶形成用阴离子是与凝胶形成用阳离子结合而形成凝胶的阴离子。作为凝胶形成用阴离子，可以列举例如卡拉胶、果胶(例如lm果胶等)、阿拉伯胶、黄原胶、结冷胶、大豆多糖类和海藻酸(例如海藻酸钠)等具有阴离子性基团的多糖类的离子、聚乳酸、多聚磷酸等酸的离子。

凝胶形成用阳离子和凝胶形成用阴离子可以任意组合使用，但从凝胶形成效率优良的观点出发，优选凝胶形成用阳离子为2价以上的金属阳离子、且凝胶形成用阴离子为海藻酸根离子，更优选凝胶形成用阳离子为ca²⁺、且凝胶形成用阴离子为海藻酸根离子。

高分子溶液(胶液)例如可以通过在溶解有凝胶形成用阳离子的溶剂中添加高分子物质并利用搅拌、加热和电场施加等公知的方法使其溶解而得到。

凝胶形成用阳离子可以以在溶解于溶剂中时生成该凝胶形成用阳离子的化合物(多价阳离子化合物)的形式添加至溶剂中。作为多价阳离子化合物的具体例，可以列举例如金属卤化物(例如cacl2、mgcl2)、金属硝酸盐(例如ca(no3)2、mg(no3)2)、金属硫氰酸盐(例如ca(scn)2,mg(scn)2)、二胺化合物(例如乙二胺、对苯二胺)和多价络盐(例如[co4(oh)6·en6](no3)6)。

高分子溶液的溶剂可以为水和缓冲液等水系溶剂，也可以为二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、六氟异丙醇(hfip)和六氟丙酮(hfac)等有机溶剂。高分子溶液的溶剂也可以为将两种以上的溶剂混合而得到的混合溶剂。混合溶剂也包含水系溶剂与有机溶剂的混合溶剂。

高分子溶液可以进一步含有促进高分子物质溶解的溶解促进剂。由此，高分子溶液的制备变得容易。作为溶解促进剂的具体例，例如在高分子物质为蛋白质的情况下，可以列举例如由以下所示的路易斯酸和路易斯碱构成的无机盐。作为路易斯碱，可以列举例如含氧酸根离子(硝酸根离子、高氯酸根离子等)、金属含氧酸根离子(高锰酸根离子等)、卤化物离子、硫氰酸根离子、氰酸根离子等。作为路易斯酸，可以列举例如碱金属离子、碱土金属离子等金属离子、铵根离子等多原子离子、络离子等。作为由路易斯酸和路易斯碱构成的无机盐的具体例，可以列举氯化锂、溴化锂、碘化锂、硝酸锂、高氯酸锂和硫氰酸锂等锂盐、氯化钙、溴化钙、碘化钙、硝酸钙、高氯酸钙和硫氰酸钙等钙盐、氯化铁、溴化铁、碘化铁、硝酸铁、高氯酸铁和硫氰酸铁等铁盐、氯化铝、溴化铝、碘化铝、硝酸铝、高氯酸铝和硫氰酸铝等铝盐、氯化钾、溴化钾、碘化钾、硝酸钾、高氯酸钾和硫氰酸钾等钾盐、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硝酸钠、高氯酸钠和硫氰酸钠等钠盐、氯化锌、溴化锌、碘化锌、硝酸锌、高氯酸锌和硫氰酸锌等锌盐、氯化镁、溴化镁、碘化镁、硝酸镁、高氯酸镁和硫氰酸镁等镁盐、氯化钡、溴化钡、碘化钡、硝酸钡、高氯酸钡和硫氰酸钡等钡盐、以及氯化锶、溴化锶、碘化锶、硝酸锶、高氯酸锶和硫氰酸锶等锶盐。在高分子物质为硫化橡胶的情况下，作为溶解促进剂的具体例，可以列举硫醇和胺。在高分子物质为纤维素的情况下，作为溶解促进剂的具体例，可以列举二硫化碳和氢氧化钠。在高分子物质为合成树脂、例如丙烯酸类树脂的情况下，作为溶解促进剂的具体例，可以列举硫氰酸钠，在聚酰胺和聚对苯二甲酰对苯二胺的情况下，作为溶解促进剂的具体例，可以列举硫酸，在聚氯乙烯的情况下，作为溶解促进剂的具体例，可以列举丙酮和环己烷。需要说明的是，根据高分子物质与凝胶形成用阳离子的组合，凝胶形成用阳离子有时也会作为促进高分子物质溶解的溶解促进剂起作用。

高分子溶液中的凝胶形成用阳离子的含量根据高分子物质、凝胶形成用阳离子、凝胶形成用阴离子、溶剂和其他添加物的种类等而适当设定。例如，在高分子物质为蛋白质、凝胶形成用阳离子为ca²⁺、且凝胶形成用阴离子为海藻酸根离子的情况下，凝胶形成用阳离子的含量优选为0.1～5.0摩尔/l的浓度范围，更优选为0.4～3.0摩尔/l的浓度范围。

高分子溶液中的高分子物质的含量根据高分子物质的种类等适当设定。例如，在高分子物质为蛋白质的情况下，以高分子溶液总量为基准，高分子物质的含量优选为10～50质量％，更优选为15～30质量％。

高分子溶液的粘度没有特别限制，例如，从容易成形的观点出发，在25℃下优选为50～20000cp、更优选为200～8000cp。高分子溶液的粘度例如利用ems粘度计进行测定。

(阴离子溶液)

阴离子溶液(凝固液)例如可以通过将上述的凝胶形成用阴离子添加至溶剂中并利用搅拌、加热和电场施加等公知的方法使其溶解而得到。

凝胶形成用阴离子可以以在溶解于溶剂中时生成该凝胶形成用阴离子的化合物(阴离子化合物)的形式添加至溶剂中。作为阴离子化合物的具体例，可以列举例如具有阴离子性基团的多糖类及其盐。作为具有阴离子性基团的多糖类及其盐的优选的具体例，可以列举海藻酸钠。海藻酸钠以(nac6h7o6)n(n为1～5000)表示，有时简记为na-alg。

阴离子溶液的溶剂可以为水和缓冲液等水系溶剂，也可以为二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、六氟异丙醇(hfip)和六氟丙酮(hfac)等有机溶剂。阴离子溶液的溶剂也可以为将两种以上的溶剂混合而得到的混合溶剂。混合溶剂也包含水系溶剂与有机溶剂的混合溶剂。

阴离子溶液的溶剂可以与高分子溶液的溶剂相同。另外，两溶剂可以均为水系溶剂。通过使高分子溶液(胶液)和阴离子溶液(凝固液)均为水系溶剂，能够将高分子凝集体在水系中进行成形。由此，所得到的高分子凝集体能够应用于生物体，例如除了能够替代目前作为手术缝线使用的丝线来使用以外，还能够应用于人造血管、人造皮肤、人造骨等。

阴离子溶液可以进一步含有高分子物质的凝集促进剂。由此，能够提高高分子凝集体的制造效率。作为高分子物质的凝集促进剂的具体例，例如，在高分子物质为蛋白质的情况下，可以列举na⁺、li⁺、k⁺等碱金属离子。在高分子物质为纤维素的情况下，作为高分子物质的凝集促进剂的具体例，可以列举乙醇。在高分子物质为未硫化橡胶的情况下，作为高分子物质的凝集促进剂的具体例，可以列举二硫醚化合物。

阴离子溶液中的凝胶形成用阴离子的含量根据高分子物质、凝胶形成用阳离子、凝胶形成用阴离子、溶剂和其他添加物的种类等而适当设定。例如，在高分子物质为蛋白质、凝胶形成用阳离子为ca²⁺、且凝胶形成用阴离子为海藻酸根离子的情况下，凝胶形成用阴离子的含量优选为0.1～6.0重量％的浓度范围，更优选为1.0～2.0重量％的浓度范围。

(凝胶形成工序)

在凝胶形成工序中，使高分子溶液与阴离子溶液接触，在高分子溶液与阴离子溶液的界面形成凝胶。使高分子溶液与阴离子溶液接触时，通过控制接触面的形状，能够形成纤维形状、膜形状、中空管形状和珠形状等任意形状的凝胶。

在纤维形状的情况下，例如可以通过将高分子溶液从纺丝喷嘴连续地挤出到阴离子溶液中来进行成形。在膜形状的情况下，例如可以通过将高分子溶液从狭缝孔连续地挤出到阴离子溶液中来进行成形。在中空管形状的情况下，例如可以通过将高分子溶液从中空狭缝孔或者通过双层管连续地挤出到阴离子溶液中、同时向高分子溶液的内部也注入高分子溶液来进行成形。在珠形状的情况下，例如可以通过将高分子溶液从喷嘴间歇地挤出到阴离子溶液中来进行成形。

(凝集工序)

在凝集工序中，在凝胶的内部使高分子物质凝集。在凝集工序中，凝胶像透析膜那样发挥功能，例如高分子溶液中含有的剩余的凝胶形成用阳离子或溶解促进剂经由凝胶溶出到阴离子溶液中，由此促进高分子物质的凝集。另外，例如阴离子溶液中含有的凝集促进剂经由凝胶侵入到高分子溶液中，由此促进高分子物质的凝集。在凝集工序中，例如可以对阴离子溶液进行搅拌。由此，经由凝胶的物质移动的效率提高，因此制造效率提高。

实施凝集工序的时间根据高分子物质、凝胶形成用阳离子、凝胶形成用阴离子、溶剂和其他添加物的种类等、高分子凝集体的形状和用途等适当设定即可，通常为3分钟～3小时，优选为3分钟～2小时。

通过实施凝集工序，得到凝胶结合为鞘状的高分子凝集体。

(凝集工序2)

本实施方式的制造方法可以在凝集工序后进一步具备将凝胶结合为鞘状的高分子凝集体浸渍于水等溶剂中的工序(也称为“凝集工序2”)。由此，能够促进凝胶形成用阳离子或溶解促进剂从凝胶内部向溶剂中的移动，使高分子凝集体进一步凝集。

实施凝集工序2的时间根据高分子物质、凝胶形成用阳离子、凝胶形成用阴离子、溶剂和其他添加物的种类等、高分子凝集体的形状和用途等适当设定即可，通常为3分钟～3小时，优选为3分钟～2小时，更优选为3分钟～1小时。

(凝胶除去工序)

本实施方式的制造方法可以在凝集工序或凝集工序2后进一步具备从高分子凝集体中除去凝胶的工序(也称为“凝胶除去工序”)。高分子凝集体可以根据用途而直接以凝胶结合为鞘状的高分子凝集体的形式提供，在不需要凝胶的情况下，也可以以通过凝胶除去工序除去凝胶后的高分子凝集体的形式提供。作为除去凝胶的方法，可以列举例如利用辊将凝胶压碎等使用机械手段的除去方法、浸渍于高分子凝集体不溶解而仅溶解凝胶的溶液中等化学方法、或者利用超声波或热将凝胶除去的方法。

参考图1～图6进一步对本实施方式的制造方法进行说明。

图1是示出一个实施方式的制造方法的说明图。在图1所示的制造方法中，得到纤维形状的高分子凝集体。图1(a)是示出将高分子溶液(胶液)挤出到阴离子溶液(凝固液)中的工序的说明图。在注射器9a中装入胶液1，将胶液1从喷嘴中连续地挤出到凝固液4中。胶液1是在包含凝胶形成用阳离子(例如ca²⁺)的水溶液中溶解高分子物质(例如来源于蛛丝蛋白的多肽)而成的溶液。凝固液4是包含凝胶形成用阴离子(例如海藻酸根离子)的水溶液。凝固液4被装入至容器3中，并被缓慢地搅拌。被挤出的胶液2在凝固液4中在界面处形成凝胶5。在凝胶5的内部，高分子物质(例如来源于蛛丝蛋白的多肽)凝集，形成高分子凝集体8。通过挤出，形成纤维形状的凝胶5，因此，所得到的高分子凝集体8也成为纤维形状。

图1(b)是示出将被凝胶包覆的高分子凝集体浸渍于水中、使其进一步凝集的工序的说明图。水7被装入至容器6中，并被缓慢地搅拌。将被凝胶5包覆的高分子凝集体8连同凝胶5一起浸渍于水7中。由此，高分子凝集体8进一步凝集。对其进行干燥，由此形成强度高的丝。

图2是示出另一实施方式的制造方法的说明图。在图2所示的制造方法中，得到粒子形状(珠形状)的高分子凝集体。在注射器9a中装入胶液1，将胶液1从喷嘴间歇地挤出到凝固液4中。被挤出的胶液2在凝固液4中在界面处形成凝胶5。在凝胶5的内部，高分子物质凝集，形成高分子凝集体8。通过间歇的挤出，形成粒子形状的凝胶5，因此，所得到的高分子凝集体8也成为粒子形状。

图3是示出另一实施方式的制造方法的说明图。在图3所示的制造方法中，得到膜形状的高分子凝集体。将胶液1从狭缝孔9b连续地挤出到凝固液4中。被挤出的胶液2在凝固液4中形成凝胶5。在凝胶5的内部，高分子物质凝集，形成高分子凝集体8。通过挤出，形成膜形状的凝胶5，因此，所得到的高分子凝集体8也成为膜形状。

图4(a)是示出另一实施方式的制造方法的说明图。图4(b)是图4(a)中由a包围的部分的放大图。在图4(a)所示的制造方法中，得到中空管形状或管形状的高分子凝集体。将胶液1从注射器9a中通过设置在喷嘴前端的环状的狭缝孔9b，以呈管状的方式连续地挤出到凝固液4中。被挤出的胶液2在凝固液4中形成管状的凝胶5。在凝胶5的内部，高分子物质凝集，形成高分子凝集体8。通过挤出，形成管形状的凝胶5，因此，所得到的高分子凝集体8也成为细径的中空管形状或管形状。

图5是示出一个实施方式的制造方法中的凝固液-凝胶-胶液的界面的示意截面图。使用图5所示的示出凝固液-凝胶-胶液的界面的示意截面图10，对通过本发明的制造方法形成高分子凝集体的机理进行说明。在图5中，使用包含ca(scn)2和丝心蛋白的高分子溶液作为胶液，使用包含海藻酸钠的阴离子溶液作为凝固液。凝胶层12由胶液中含有的ca²⁺(凝胶形成用阳离子)和凝固液中含有的海藻酸根离子(alg^n-：凝胶形成用阴离子)形成。即，在胶液层11的ca²⁺-丝心蛋白与凝固液层13的海藻酸钠(na⁺-alg^n-)之间发生离子交换反应，生成ca²⁺-alg^n-，由此进行凝胶化，形成凝胶层12。认为凝胶层12像透析膜那样发挥功能。其结果是，低分子量的scn^-、h2o和na⁺经由凝胶层12发生移动，另一方面，作为高分子的丝心蛋白停留在凝胶内部。另外认为，由于经由凝胶层12的scn^-的流出而使丝心蛋白在凝胶内部的溶解度降低，从而促进凝集。

图6是一个实施方式的制造工序图。从挤出机21的喷嘴23沿p方向挤出胶液22，被挤出的胶液24浸渍于凝固槽25的凝固液26中，将生成的凝胶27剥落，将凝集的丝心蛋白28浸渍于水槽29的纯水30中使其进一步凝集，接着，从干燥机31中通过而进行固化，制成卷丝32。通过这样一系列的工序，能够制造丝心蛋白丝。丝心蛋白丝即使在未拉伸丝的状态下也具有足以实用的强度，但也可以进一步进行拉伸。

实施例

以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。

[实施例1]

1.来源于蛛丝蛋白的多肽的制备

<基因合成>

(1)adf3kai的基因的合成

从ncbi网络数据库获取作为十字园蛛的两种主要牵引丝蛋白之一的adf3(gi编号：1263287)的部分氨基酸序列，委托genscript公司合成编码在该序列的n末端附加有由起始密码子、his10标签和hrv3c蛋白酶(人鼻病毒3c蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号4)的氨基酸序列(序列号2)的基因。其结果，获得了导入有由序列号5所示的碱基序列构成的adf3kai的基因的puc57载体(具有紧挨在基因的5’末端上游的ndei位点和紧挨在5’末端下游的xbai位点)。然后，用ndei和ecori对该基因进行限制酶处理，重组至pet22b(+)表达载体中。

(2)adf3kai-large的基因的合成

以adf3kai为模板，使用t7启动子引物(序列号14)和repxbai引物(序列号15)进行pcr反应，对adf3kai的基因序列中的5’侧一半的序列(以下记为序列a)进行扩增，使用mighty克隆试剂盒(宝生物株式会社制造)，将该片段重组至预先用ndei和xbai进行了限制酶处理的puc118载体中。同样地，以adf3kai为模板，使用xbairep引物(序列号16)和t7终止子引物(序列号17)进行pcr反应，对adf3kai的基因序列中的3’侧一半的序列(以下记为序列b)进行扩增，使用mighty克隆试剂盒(宝生物株式会社制造)，将该片段重组至预先用xbai、ecori进行了限制酶处理的puc118载体中。将导入有序列a的puc118载体用ndei、xbai进行限制酶处理，将导入有序列b的puc118载体用xbai、ecori进行限制酶处理，切出凝胶，由此对序列a和序列b的目标dna片段进行纯化。使dna片段a、b和预先用ndei和ecori进行了限制酶处理的pet22b(+)进行连接反应，转化至大肠杆菌dh5α中。通过使用t7启动子引物和t7终止子引物的菌落pcr，确认到目标dna片段的插入后，从得到目标大小(3.6kbp)的条带的菌落中提取质粒，通过使用3130xl基因分析仪(appliedbiosystems)的测序反应确认全部碱基序列。其结果，确认到序列号6所示的adf3kai-large的基因的构建。需要说明的是，adf3kai-large的氨基酸序列如序列号3所示。

(3)adf3kai-large-nrsh1的基因的合成

以上述中得到的导入有adf3kai-large的基因的pet22b(+)载体为模板，通过使用primestar诱变基础试剂盒(宝生物株式会社制造)的定点诱变，使adf3kai-large的氨基酸序列(序列号3)中的第1155位的氨基酸残基甘氨酸(gly)所对应的密码子ggc突变为终止密码子taa，在pet22b(+)上构建序列号7所示的adf3kai-large-nrsh1的基因。关于突变的导入的准确性，通过使用3130xl基因分析仪(appliedbiosystems)的测序反应进行确认。需要说明的是，adf3kai-large-nrsh1(以下也仅称为“nrsh1”)的氨基酸序列如序列号1所示。

<蛋白质的表达>

将上述中得到的包含nrsh1的基因序列的pet22b(+)表达载体转化至大肠杆菌rosetta(de3)中。将所得到的单菌落在含有氨苄青霉素的2ml的lb培养基中培养15小时后，将该培养液1.4ml添加至含有氨苄青霉素的140ml的lb培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养至培养液的od600达到3.5为止。接着，将od600为3.5的培养液与50％葡萄糖140ml一同添加至含有苄青霉素的7l的2×yt培养基中，进一步培养至od600达到4.0为止。然后，向所得到的od600为4.0的培养液中添加异丙醇-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，以使终浓度达到0.5mm，诱导蛋白质表达。在iptg添加后经过2小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。将由iptg添加前和iptg添加后的培养液制备的蛋白质溶液在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，结果依赖于iptg添加地观察到目标大小(约101.1kda)的条带，确认到目标蛋白质进行了表达。

<多肽的制备>

(i)在离心管(50ml)中添加表达nrsh1的蛋白质的大肠杆菌的菌体约4.5g和缓冲液ai(20mmtris-hcl、ph7.4)30ml，利用混合器(ge公司制造“si-0286”、级别10)使菌体分散后，利用离心分离机(tomyseiko制造的“mx-305”)进行离心分离(10000rpm、10分钟、室温)，弃去上清。

(ii)在通过离心分离得到的沉淀物(菌体)中添加缓冲液ai30ml和0.1m的pmsf(用异丙醇溶解)0.3ml，利用上述ge公司制造的混合器(级别10)分散3分钟。然后，使用超声波破碎机(sonic&materials、inc制造“vcx500”)将菌体破碎，进行离心分离(10000rpm、10分钟、室温)。

(iii)在通过离心分离得到的沉淀物中加入缓冲液ai30ml，利用混合器(ika公司制造的“t18基础型ultra-turrax”、级别2)分散3分钟后，利用上述tomyseiko制造的离心分离机进行离心分离(10000rpm、10分钟、室温)，除去上清。

(iv)在弃去上清后的离心管中加入7.5m的尿素缓冲液i(7.5m尿素、10mm磷酸二氢钠、20mmnacl、1mmtris-hcl、ph7.0)，利用超声波破碎机(sonic&materials、inc制造的“vcx500”)(级别7)使沉淀充分分散。然后，利用振荡器(tietech公司制造的“br-43fl/mr”)(200rpm、60℃)溶解120分钟。将溶解后的蛋白质溶液利用上述tomyseiko制造的离心分离机进行离心分离(11000×g、10分钟、室温)，将上清使用透析管(三光纯药株式会社、纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离回收透析后得到的白色凝集蛋白质，利用冷冻干燥机除去水分，回收冷冻干燥粉末。所得到的冷冻干燥粉末中的目标蛋白质nrsh1(约101.1kda)的纯化度通过使用totallab(nonlineardynamicsltd.)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳(cbb染色)的结果进行图像分析来确认。其结果，nrsh1的纯化度为约85％。

2.高分子溶液(胶液)的制备

在1mca(scn)2的纯水溶液中添加蛛丝蛋白(nrsh1)使浓度为20质量％，使用振荡器溶解3小时。然后，除去灰尘和气泡，制成胶液。胶液的溶液粘度在25℃下为2088cp(厘泊)。

3.阴离子溶液(凝固液)的制备

将含有1.0质量％海藻酸钠(na-alg)的纯水作为凝固液。

4.高分子凝集体的制造

如图1(a)所示，使用注射器将胶液挤出到凝固液中。挤出喷嘴的直径为0.5mm、挤出速度为50ml/小时。挤出后，将胶液在凝固液中浸渍90分钟(凝胶化浴浸渍时间)，得到形成在凝胶内的高分子凝集体。然后，将包覆高分子凝集体的凝胶，得到丝条的丝心蛋白。

将制造条件和结果示于表1和图7。图7是示出实施例1中得到的高分子凝集体(蛛丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图。图7(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片。图7(b)是示出除去凝胶后的高分子凝集体的照片。图7(c)是对图7(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。图7(d)是对图7(b)的照片进行描迹而得到的描迹图。

[实施例2]

在1mcacl2的dmso溶液中添加蛛丝蛋白(nrsh1)使浓度为20质量％而制备胶液，并且将凝胶化浴浸渍时间变更为30分钟，除此以外，与实施例1同样地制造高分子凝集体。

将制造条件和结果示于表1和图8。图8是示出实施例2中得到的高分子凝集体(蛛丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图。图8(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片。图8(b)是示出除去凝胶后的高分子凝集体的照片。图8(c)是对图8(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。图8(d)是对图8(b)的照片进行描迹而得到的描迹图。

[实施例3]

代替蛛丝蛋白(nrsh1)而使用蚕丝(未除去丝胶蛋白)，使胶液中含有的ca(scn)2的浓度为5m，将凝胶化浴浸渍时间变更为180分钟，并且在凝固液中浸渍后在ro水中浸渍60分钟(ro水浸渍时间)，除此以外，与实施例1同样地制造高分子凝集体。

蚕丝(未除去丝胶蛋白)使用从茧中取出蚕蛹并将茧壳裁断后得到的蚕丝。

将制造条件和结果示于表1和图9。图9是示出实施例3中得到的高分子凝集体(丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图。图9(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片。图9(b)是对图9(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。需要说明的是，实施例3的高分子凝集体与凝胶一体化。

[实施例4]

代替蚕丝(未除去丝胶蛋白)而使用从蚕丝中除去丝胶蛋白后的丝状丝心蛋白，将凝固液中的海藻酸钠浓度变更为2.0质量％，将凝胶化浴浸渍时间变更为30分钟，并且将ro水浸渍时间变更为30分钟，除此以外，与实施例3同样地制造高分子凝集体。

从蚕丝中除去丝胶蛋白后的丝状丝心蛋白如下制备。

(1)在沸腾的0.5质量％马赛皂水(使用利用刨刀切细的马赛皂)中加入蚕丝以使浴比为1:100，在不时地搅拌的同时煮30分钟。

(2)弃去皂水，先用温水冲洗。

(3)在沸腾的热水中加入(2)中用温水冲洗后的蚕丝以使浴比为1:100，煮。

(4)弃去热水。

(5)将步骤(1)～(4)进一步重复2次(总计3次)。

(6)最后脱水，在60℃以下干燥。

将制造条件和结果示于表1和图10。图10是示出实施例4中得到的高分子凝集体(丝蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图。图10(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片。图10(b)是对图10(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。需要说明的是，实施例4的高分子凝集体与凝胶一体化。

[实施例5]

代替从蚕丝中除去丝胶蛋白后的丝状丝心蛋白，使用再生蚕丝，除此以外，与实施例4同样地制造高分子凝集体。

再生蚕丝如下制备。

(1)将蚕丝在沸腾的0.5质量％马赛皂水(使用利用刨刀切细的马赛皂)中煮30分钟。

(2)然后，在沸腾的热水中煮30分钟。

(3)将步骤(1)和(2)进一步重复2次(总计3次)。

(4)最后在沸腾的热水中煮30分钟。

(5)在温度37℃的环境中干燥一晩。

(6)测量干燥后的蚕丝的重量，加入其10倍量的9m溴化锂水溶液，在40℃的环境中使其溶解。

(7)将(6)中得到的溶解液装入纤维素透析膜(viskaseselescoap制造的无缝纤维素管、36/32)中，在纯水中透析3～4天。

(8)将透析后的回收液用过滤器(孔径197μm和560μm)进行过滤，除去灰尘。

(9)利用bca法测定蛋白质浓度，用milliq稀释至蛋白质浓度达到2质量％以下。

(10)将再生蚕丝溶液在-80℃的环境中冷冻干燥。厚度为1～2cm。

(11)冷冻干燥后在4℃下保存。

将制造条件和结果示于表1。需要说明的是，实施例5的高分子凝集体与凝胶一体化。

[实施例6]

代替蛛丝蛋白(nrsh1)，使用市售的明胶(biorad公司制造的目录号170-6537)，并且将凝胶化浴浸渍时间变更为30分钟，除此以外，与实施例1同样地制造高分子凝集体。

将制造条件和结果示于表1和图11。图11是示出实施例6中得到的高分子凝集体(明胶蛋白凝集而成为纤维状的凝集体)的照片和对该照片进行描迹而得到的描迹图。图11(a)是示出形成在凝胶内的高分子凝集体的照片。图11(b)是对图11(a)的照片进行描迹而得到的描迹图。需要说明的是，实施例6的高分子凝集体与凝胶一体化。

[表1]

如表1和图7～11所示，无论蛋白质的种类如何，在凝胶的内部都得到蛋白质的凝集体。另外，几乎未确认到蛋白质向凝固液中的溶出，能够以良好的成品率得到凝集体。

标号说明

1…高分子溶液(胶液)、2…被挤出的胶液、3、6…容器、4…阴离子溶液(凝固液)、5…凝胶、7…水、8…高分子凝集体、9a…注射器、9b…狭缝孔、10…示出凝固液-凝胶-胶液的界面的示意截面图、11…胶液层、12…凝胶层、13…凝固液层、21…挤出机、22…胶液、23…喷嘴、24…被挤出的胶液、25…凝固槽、26…凝固液、27…凝胶、28…凝集的丝心蛋白、29…水槽、30…纯水、31…干燥机、32…卷丝。

序列表

<110>丝芭博株式会社（spiberinc.）

小岛冲压工业株式会社（kojimaindustriescorporation）

<120>高分子凝集体的制造方法（amethodforproducingmacromoleculeaggregate）

<130>15ps007wo1

<150>jp2015-254210

<151>2015-12-25

<160>17

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1154

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>adf3kai-large-nrsh1

<400>1

methishishishishishishishishishisserserglyserser

151015

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