本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及封闭cd47并激发抗肿瘤免疫的重组溶瘤腺病毒及其用途。
背景技术：
恶性肿瘤已成为严重威胁人类生命健康的一大类疾病，传统的抗肿瘤治疗手段包括手术治疗、化疗和放疗等，虽取得一些疗效，但因各自治疗的局限性始终无法达到预期的效果，研究表明癌症发病率及死亡率均呈明显上升趋势。近几年，随着对肿瘤发生发展机理研究的不断深入，包括基因治疗在内的生物治疗已经成为肿瘤临床中不可或缺的一部分。腺病毒因其致病性弱、基因携带能力强、与宿主细胞基因组整合风险低及基因组较易修饰并可大规模生产等优点，是基因治疗中最常用的病毒载体。据jgenemed统计，截至2016年2月，全球共有2356项基因治疗进入临床试验，其中使用腺病毒作为载体的数量最多，达499项，占总数的21.2％。
经过基因改造的溶瘤腺病毒能相对特异地在肿瘤细胞内复制增殖，裂解肿瘤细胞，而释放的子代病毒又可以感染周围肿瘤细胞，通过级联放大作用，高效杀伤肿瘤细胞，清除肿瘤病灶。在我国，溶瘤腺病毒药物h101联合化疗在多种类型恶性肿瘤的临床治疗或临床实验中显示了部分疗效(currentcancerdrugtargets，2007，7(2):141-8)。近年来，溶瘤腺病毒在增强免疫方面的功能逐渐被认知与重视(viruses，2015，7(11):5780-91；natrevdrugdiscov.，2015，14(9):642-62)。溶瘤腺病毒在裂解肿瘤细胞时，可促使肿瘤细胞免疫性死亡，包括免疫性细胞凋亡、坏死、自噬性细胞死亡等，上调钙网蛋白、热休克蛋白在细胞膜上的含量，释放atp、高迁移率族蛋白b1(high-mobilitygroupbox1，hmgb1)、尿酸等损伤相关因子、病原相关分子、危险信号分子以及肿瘤相关抗原，从而进一步激活树突状细胞(dc)功能，提升抗肿瘤免疫反应(frontoncol.，2014apr10，4:74.)。研究证实，腺病毒可作为tlr9(toll-likereceptor)的激动剂，促进dc细胞成熟，并增强i型ifn的免疫反应(jvirol.，2012，86(11):6279-85)。另外，腺病毒还被证明可诱导肿瘤细胞下调免疫相关信号通路，并通过增强ifnγ反应，诱导肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，tam)向m1型巨噬细胞转变，从而重塑肿瘤微环境，发挥治疗作用(oncotarget，2016，7(2):1500-15)。
cd47是一种细胞表面分子，是免疫球蛋白(ig)超家族的一员。cd47的受体为信号调节蛋白α(signalregulataryproteinα，sirpα)，sirpα主要表达于巨噬细胞、dc和中性粒细胞等髓系细胞和神经细胞等。研究表明，cd47可以与巨噬细胞表面的sirpα结合，作为“别吃我”信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用(jbiochem.，2014，155(6):335-44)。表达于正常细胞的cd47分子可作为“自我”的标志，保护自己避免被误吞噬；衰老细胞和损伤细胞因cd47缺失可被自体巨噬细胞有效吞噬并清除；而肿瘤细胞可通过cd47-sirpα通路逃避巨噬细胞的吞噬作用，引起免疫逃逸。cd47最早被认为是一种肿瘤抗原，cd47被发现在多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞表面异常高表达(jbiochem.，2014，155(6):335-44；immunotherapy，2014，6(3):290-308；hepatology，2014，60(1):179-91)，因此通过抗体阻断cd47-sirpα通路，可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，是较为理想的实体瘤免疫治疗靶点。weiskopfk等通过酵母细胞表面展示技术，将sirpα负责结合cd47的区段进行点突变改造，使其与cd47的亲和力提高了约50000倍，达到pm数量级，能高效阻断cd47-sirpα之间的结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，与其它肿瘤抗体联用，还可增强抗体介导的吞噬效应(science，2013，341(6141):88-91)。另有研究表明，cd47是机体固有免疫与获得性免疫的重要连接节点。通过阻断cd47信号，不仅可以通过巨噬细胞的交叉提呈作用，还可直接通过dc的抗原提呈作用，增强t细胞功能(procnatlacadsciusa，2013，110(27):11103-8；natmed.，2015，21(10):1209-15)。另外，抗cd47抗体可通过fc依赖性途径如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)和补体依赖性细胞毒作用(cdc)杀伤肿瘤细胞(curropinimmunol.，2012april，24(2):225–232)。并通过与一些细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)等联合治疗增强抗肿瘤活性。
应用cd47抗体阻断cd47-sirpα通路，通过竞争性抑制作用解放巨噬细胞表面的sirpα分子，释放巨噬细胞发挥免疫杀伤肿瘤细胞功能，已在多种类型恶性肿瘤(例如白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌或头颈部肿瘤等)中得到证实，可以参见cell2010，142(5):699-713；curropinimmunol.2012，24(2):225–232。因而，如能通过溶瘤病毒携带cd47抗体基因，通过溶瘤病毒对肿瘤细胞的裂解作用，释放肿瘤抗原，募集dc、t细胞、巨噬细胞，增强免疫功能；同时，高效表达cd47抗体，封闭肿瘤细胞的cd47表面分子，增强dc的抗原提呈能力与巨噬细胞的吞噬能力，协同发挥溶瘤病毒与cd47抗体的抗肿瘤活性。然而，作为一种自我保护机制，病毒在感染宿主细胞后，通常可诱使细胞上调cd47分子的表达，避免免疫细胞对感染病毒宿主细胞的攻击，使子代病毒能安全的在宿主细胞内完成复制增殖(jimmunol.2006，177(3):1817-24；autoimmunity.2011，44(7):532-42.)。因而，一旦腺病毒表达cd47抗体，可能对病毒的增殖造成不利影响，影响溶瘤病毒发挥治疗作用，同时影响cd47抗体的表达。据此分析，平衡cd47抗体对溶瘤病毒免疫增强功能与病毒增殖活性的正负向作用，是携带cd47抗体基因的溶瘤病毒发挥抗癌功能的关键。
技术实现要素：
本发明利用腺病毒平台携带可封闭cd47分子的sirpα-fc融合基因，该腺病毒e1a由人端粒酶逆转录酶启动子控制；e1b区19kda与55kda蛋白编码序列缺失，作为外源基因表达框的插入位点；e1a与外源基因表达框之间插入一段绝缘子序列，避免两个表达框的互相干扰。同时，为提高腺病毒对肿瘤细胞的感染效率，利用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒，成功构建出携带sirpα-fc融合基因的重组腺病毒sg635-sf。
本发明人惊奇的发现，本发明携带sirpα-fc融合蛋白基因的溶瘤腺病毒可在肿瘤细胞内特异性快速复制增殖，裂解肿瘤细胞；同时表达sirpα-fc融合蛋白，封闭肿瘤细胞表面cd47分子，增强巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬效应。同时，本发明病毒载体与表达元件的整体设计有效平衡了cd47抗体对溶瘤病毒免疫增强功能与病毒增殖活性的双向作用，保证了改造后的溶瘤腺病毒在体内环境下高效增殖，持续表达sirpα-fc融合蛋白。
因此，本发明的一个方面涉及一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：
与人igg1fc段基因融合的sirpαcv1结合区或其简并序列。
在一个或多个实施方案中，sirpαcv1基因和人igg1fc段基因在同一个表达框内。
在一个或多个实施方案中，sirpαcv1基因和人igg1fc段基因能够以融合蛋白的形式高效表达。
在一个或多个实施方案中，所述sirpαcv1基因和人igg1fc段基因组成融合基因sirpα-fc或其简并序列。
在一个或多个实施方案中，所述重组溶瘤腺病毒载体可操作地插入或者包含依次连接的下述外源片段：
组成型强启动子、sirpα-fc基因或其简并序列、sv40polya和第一绝缘子序列。
在一个或多个实施方案中，所述sirpα突变株cv1的结合区序列如seqidno：4所示。
在一个或多个实施方案中，所述人igg1fc段基因的序列如seqidno：5所示。
在一个或多个实施方案中，所述sirpα突变株cv1的结合区序列和人igg1fc段基因经由编码接头序列的核苷酸序列连接。
在一个或多个实施方案中，所述接头序列含有一个或多个甘氨酸，优选为ggc。
在一个或多个实施方案中，sirpα突变株cv1的结合区序列和人igg1fc段基因(sirpα-fc基因)的序列如seqidno：6所示。
在一个或多个实施方案中，所述组成型强启动子为ccau、cmv、cag、cag、sv40、ef-1α、ubc或pgk启动子；优选为ccau或cmv启动子。
在一个或多个实施方案中，所述ccau启动子的核苷酸序列如seqidno：2所示。
在一个或多个实施方案中，所述cmv启动子的核苷酸序列如seqidno：3所示。
在一个或多个实施方案中，所述第一绝缘子序列如seqidno：1所示。
在一个或多个实施方案中，所述外源基因可操作地连接或插入在腺病毒e1b区。
在一个或多个实施方案中，腺病毒e1b区19kda与55kda蛋白编码序列缺失。
在一个或多个实施方案中，腺病毒e1a的启动子为人端粒酶逆转录酶启动子、癌胚抗原启动子、甲胎蛋白启动子、前列腺素特异性抗原的启动子或缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件启动子；优选为人端粒酶逆转录酶启动子。
在一个或多个实施方案中，所述人端粒酶逆转录酶启动子如seqidno：7所示。
在一个或多个实施方案中，腺病毒e1a表达框与外源基因所在表达框的方向相反。
在一个或多个实施方案中，人端粒酶启动子前包含第二绝缘子序列，所述第二绝缘子序列与第一绝缘子序列相同或者不同。
在一个或多个实施方案中，所述第二绝缘子序列如seqidno：8所示。
在一个或多个实施方案中，所述腺病毒为c亚属。
在一个或多个实施方案中，所述腺病毒为利用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒的纤毛蛋白构建而成的嵌合型腺病毒载体。
本发明的另一方面涉及一种重组腺溶瘤病毒，该重组腺溶瘤病毒含有外源基因，其中，该外源基因为与人类igg1的fc段基因融合的sirpα突变株cv1的结合区的基因，即sirpα-fc基因。
本发明还涉及一种重组腺溶瘤病毒，其含有本发明中所述的重组溶瘤腺病毒载体。
在一个或多个实施方案中，本发明的重组腺溶瘤病毒由本发明中所述的重组溶瘤腺病毒载体在hek293细胞中重组得到。
在一个或多个实施方案中，本发明的重组溶瘤腺病毒是保藏编号为cctccno:v201637的重组腺溶瘤病毒。
本发明的再一方面涉及本发明重组溶瘤腺病毒载体或者重组溶瘤腺病毒在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者肿瘤的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌或头颈癌。
本发明的再一方面涉及本发明重组溶瘤腺病毒载体或者重组溶瘤腺病毒在制备杀伤肿瘤细胞(特别是肿瘤干细胞)的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤细胞为选自下列肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌或头颈癌。
附图说明
图1：病毒sg635-sf穿梭载体p74-tp-ccau-sf的载体图谱。
图2：卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3中cd47的表达情况图。a，卵巢癌细胞株ho8910中cd47的表达情况图；b，卵巢癌细胞株sk-ov-3中cd47的表达情况图。
图3：病毒sg635及sg635-sf分别感染卵巢癌细胞株sk-ov-3和ho8910后表达融合蛋白sirpα-fc的westernblotting检测图。m，marker；泳道1为sg635-sf感染sk-ov-3后sirpα-fc表达；泳道2为sg635感染sk-ov-3后sirpα-fc表达；泳道3为sg635-sf感染ho8910后sirpα-fc表达；泳道4为sg635感染ho8910后sirpα-fc表达。
图4：病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3后表达融合蛋白sirpα-fc的elisa检测图。a，标准曲线；b，病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3后表达融合蛋白sirpα-fc的elisa定量检测。
图5：病毒sg635及sg635-sf分别感染卵巢癌细胞株sk-ov-3(a)和ho8910(b)后的病毒增殖情况检测图。
图6：病毒sg635及sg635-sf对卵巢癌细胞株sk-ov-3(a)和ho8910(b)的体外杀伤活性图。
图7：病毒sg635及sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910后cd47的表达情况流式检测图。a，病毒sg635感染ho8910后cd47的表达检测；b，病毒sg635-sf感染ho8910后cd47的表达检测。
图8：病毒sg635及sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910后sirpα-fc的表达情况免疫荧光检测图。
图9：病毒sg635及sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910后sirpα-fc封闭cd47表达效果检测图。
图10：病毒sg635及sg635-sf分别感染卵巢癌细胞株sk-ov-3和ho8910后对细胞凋亡的检测图。a，病毒sg635及sg635-sf感染sk-ov-3后对细胞凋亡的检测；b，病毒sg635及sg635-sf感染ho8910后对细胞凋亡的检测。
图11：病毒sg635-sf抑制卵巢癌细胞移植瘤体内生长的曲线图。a，ho8910移植瘤体内生长的曲线图；b，sk-ov-3移植瘤体内生长的曲线图。
图12：sk-ov-3移植瘤模型体内血液中sirpα-fc表达量检测。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种重组基因-溶瘤腺病毒。具体地，该腺病毒e1a由人端粒酶逆转录酶启动子控制；e1b区19kda与55kda蛋白编码序列缺失，作为外源基因表达框的插入位点；e1a与外源基因表达框之间插入绝缘子序列，避免两个表达框的互相干扰。外源基因为将具有高亲和力的sirpα突变株cv1的结合区的基因与人类igg1的fc段基因融合，组成融合基因sirpα-fc，sirpα-fc基因由组成型强启动子(如ccau启动子)控制。
本发明人惊奇地发现，该腺病毒通过肿瘤特异性启动子(如人端粒酶逆转录酶启动子)对其增殖必需基因(腺病毒e1a)进行的有效控制及相关片段缺失(e1b区19kda与55kda)而具有在肿瘤细胞内选择性增殖能力，特异裂解肿瘤细胞，促进肿瘤细胞凋亡，阻滞细胞周期；并且该腺病毒能在肿瘤细胞内高效表达外源基因sirpα-fc，sirpα-fc能特异性与肿瘤细胞表面cd47结合，阻断cd47-sirpα的负调节作用，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，并能同时引发adcc效应和cdc效应，激发机体抗肿瘤免疫，增强抗肿瘤效能，协同发挥抗肿瘤作用。本发明提供的重组溶瘤腺病毒可以多种类型恶性肿瘤的治疗。
本发明中，“外源基因”指野生型腺病毒中不存在的基因。
术语“sirpα”又称为shps-1，ncbi基因库的官方id号为bc075849，是cd47的一种重要的表面受体。sirpα具有负调节作用，多种生长因子和反应可激活sirpα酪氨酸磷酸化，磷酸化后的酪氨酸结合并激活shp-1和shp-2，引发下游抑制信号。cd47-sirpα具有调节巨噬细胞活性的功能，表达于正常细胞或肿瘤细胞的cd47分子可作为“自我”的标志，与sirpα反应释放“别吃我”信号，产生负调节信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用。
不拘于理论的限制，在本发明的一个实施方案中，sirpα采用高亲和力突变株cv1的结合区(science.2013；341(6141):88-91)，此突变株通过酵母细胞表面展示技术，将sirpα负责结合cd47的区段进行点突变改造，使其与cd47的亲和力提高了约50000倍，达到pm数量级，能高效阻断cd47-sirpα之间的结合，增强巨噬细胞的吞噬作用。在某些实施方案中，该突变株cv1的结合区序列如seqidno：4所示。
术语“igg1fc段”，ncbi基因库的官方id号为jq666008。igg1fc段能与nk细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等所表达的iggfc受体结合，引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒(adcc)作用；能诱导补体因子直接杀伤异常细胞激活补体依赖性细胞毒(cdc)作用，增强抗肿瘤效能。在某些实施方案中，所述人igg1fc段基因的序列如seqidno：5所示。
本发明所述sirpα-fc基因为具有高亲和力的sirpα突变株cv1的结合区基因与人类igg1的fc段基因融合，在转录翻译后能高效表达融合蛋白sirpα-fc，且不引入其它无效蛋白序列。在某些实施方案中，所述sirpα突变株cv1的结合区序列和人igg1fc段基因经由编码接头序列的核苷酸序列连接。接头序列可含有一个或多个甘氨酸，优选的接头序列为ggc、ggt和/或gga。在某些实施方案中，所述接头序列为(ggtgga)nggt，其中，n为1到5的整数。在某些实施方案中，sirpα突变株cv1的结合区序列和人igg1fc段基因(sirpα-fc基因)的序列如seqidno：6所示。
本发明中，绝缘子序列的作用是使两个表达框互不干扰。通常，在e1a表达框与外源基因表达框之间插入第一绝缘子序列。在某些实施方案中，在人端粒酶启动子前还插入第二绝缘子序列。第二绝缘子序列与第一绝缘子序列可相同，也可不同。在某些实施方案中，绝缘子序列如seqidno：1或8所示。在某些实施方案中，第一绝缘子序列如seqidno：1所示，第二绝缘子序列如seqidno：8所示。
不拘于理论的限制，本发明所述sirpα-fc基因受组成型强启动子(如ccau、cmv、sv40、ef-1α、ubc、pgk、嵌合启动子cag)的控制，该顺式作用元件插入抗肿瘤基因序列的转录起始位点与翻译起始位点之间，保证该基因蛋白在病毒感染的肿瘤内部高效表达，发挥生物学活性。加尾序列插入基因核苷酸序列的翻译终止密码子之后，该顺式作用元件可保证转录后的rna能准确加polya，形成成熟mrna。作为示范性的例子，在某些实施方案中，适用于本发明的ccau启动子的核苷酸序列如seqidno：2所示，适用于本发明的cmv启动子的核苷酸序列如seqidno：3所示。
本发明所述腺病毒增殖必需基因e1a受一种肿瘤特异性启动子—人端粒酶逆转录酶启动子控制，保证e1a在肿瘤细胞内特异表达，控制病毒在肿瘤细胞内特异增殖。术语“e1a”是腺病毒感染细胞后最早表达的基因，能激活其他早期基因(e1b、e2a、e2b、e3和e4)的转录，启动病毒的复制。同时，ela可以通过抑制her-2/neu基因的转录、阻断nf-κb的活性、提高免疫细胞的杀伤效应、增强转移抑制基因nm23的表达等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。在某些实施方案中，人端粒酶逆转录酶启动子的序列如seqidno：7所示。除人端粒酶逆转录酶启动子外，还可用于本发明以控制e1a表达的启动子还包括癌胚抗原启动子、甲胎蛋白启动子、前列腺素特异性抗原的启动子或缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件启动子。
本发明所述腺病毒elb-55kda、elb-19kda基因全缺失。术语“elb-55kda”是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中复制时的非必需的蛋白，elb-55kda编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。术语“elb-19kda”与凋亡抑制基因bcl-2同源，编码的elb-19kda蛋白能够结合bax或/和bak，启动下游的凋亡抑制程序；elb-19kda还可以破坏fas介导的凋亡过程，保护感染的细胞免受tnf-α介导的杀伤作用。因而，elb-19kda蛋白功能的丧失，不但能够促进肿瘤细胞凋亡通路的恢复，而且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使该溶瘤腺病毒治疗肿瘤的特异性更好，效能更强。
腺病毒e1b19kda与55kda蛋白及其编码序列可详见2型腺病毒全基因组序列的注释(登录号ac_000007.1)。
不拘于理论的限制，在病毒载体方面，腺病毒基因组具有高度集约的特点，一段dna序列往往发挥多种功能，如作为多顺反子编码多种蛋白(例如，腺病毒e1a基因同时编码e1a9s，12s，13s，6kda，26kda，32kda)，既编码蛋白又作为顺式元件(如启动子)等等形式，引入一段或多段基因组序列的改造(如删除/突变/增加)可能破坏病毒基因组的完整性，使病毒失去活力；其次，病毒的生命周期受严格调控，相关基因需顺次表达，如腺病毒进入细胞后，首先表达e1a蛋白，e1a随后激活其他早期基因(e1b、e2a、e2b、e3和e4)的转录，启动病毒的复制，两个区段基因组的同时改造，可能引起病毒复制过程中相关元件的调控紊乱，出现病毒颗粒无活力，或外源基因无法有效表达的现象。因而，为保证获得具有正常活力的病毒颗粒，且外源基因能有效表达，需根据外源基因的不同，通过实验对外源表达框的核心元件(如启动子、polya加尾信号序列等)进行优化组合；与此同时，通过实验筛选合适的外源基因表达框插入位点。
不拘于理论的限制，在腺病毒血清型选择方面，人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(a-f)，它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史各不相同。基因治疗常用的人的2型(ad2)及5型(ad5)腺病毒在血清学分类上均属c亚群，在dna序列上有95％的同源性。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。c亚群腺病毒主要与柯萨奇b病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体(coxsackie/adenovirusreceptor，car)。但是，在某些肿瘤细胞(如膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤等)表面，car是低表达甚至不表达的。由于以腺病毒为载体的基因治疗中car介导的腺病毒进入靶细胞是基因转移中的限速步骤，并且转染效率与细胞表面car表达水平有关，低水平表达的car无疑是制约腺病毒转导效率的主要原因，即表现出细胞对c亚群腺病毒载体的抗性作用(jvirol.2002；76:1892；cancerres.2001；61:2953；clincancerres.2001；7:120；genetherapy.2001；8:969；prostate.2005；64:401；genether.2005；12:1696)。然而，由于c亚群腺病毒载体已被成功应用于临床治疗，广泛进入临床试验，其安全性已在人体中经过广泛测试，作为载体安全性最高。而其它亚群腺病毒，虽然能提高对car低表达细胞的感染效率，但其安全性并未在人体中被广泛测试，具有潜在的安全性风险。因而，最佳状态是在保留c亚型腺病毒外壳纤毛的前提下，通过其它方式提高病毒对肿瘤细胞的感染效率。为实现该目的，需引入其它策略，并通过实验验证效果。
本发明的病毒为利用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒纤毛蛋白所构建而成的嵌合型腺病毒载体，实验结果表明该嵌合型腺病毒对肿瘤细胞的感染效率显著提高，并且具有更低的免疫原性。
本发明的病毒能够在肿瘤细胞内复制。
不拘于理论的限制，另外，如果采用复制缺陷型腺病毒，病毒感染肿瘤细胞后，只能瞬时表达外源基因，外源dna拷贝数不会随着病毒的复制而扩增，表达强度不够。并且因为病毒不会复制，无法直接裂解肿瘤细胞，不能有效释放肿瘤细胞的抗原，从而激活机体免疫反应。
而本发明人构建的病毒感染细胞后sirpα-fc的表达量可达到10ug/ml甚至20ug/ml以上(高效表达)。
本发明所述重组溶瘤腺病毒可高效感染并杀伤癌细胞或肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞。术语“肿瘤干细胞”为肿瘤组织中能无限自我更新，并分化为异质性肿瘤细胞群体的一部分肿瘤细胞亚群，是恶性肿瘤起始、耐药、转移等生物行为的根源。本文中，癌细胞或肿瘤细胞可以是肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌或头颈癌的细胞。
本发明的重组溶瘤腺病毒能在肿瘤细胞内特异增殖，使治疗基因随病毒的复制增殖dna拷贝数显著增加，显著提高sirpα-fc融合基因的表达量，通过溶瘤病毒与治疗基因的双重作用，促进肿瘤细胞的死亡；释放后的子代病毒又可以高效感染周围肿瘤细胞(包括肿瘤干细胞)，通过级联放大效应，大量杀伤肿瘤细胞；与此同时，sirpα能特异性与肿瘤细胞表面cd47结合，阻断cd47-sirpα的负调节作用，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用；igg1fc能引发adcc效应和cdc效应，增强抗肿瘤效能进一步提高治疗作用。本发明的溶瘤腺病毒药物适应于人类绝大多数类型恶性肿瘤的治疗、预防或辅助治疗，包括但不限于肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌或头颈癌。
本发明中，“辅助治疗”指本发明重组腺溶瘤病毒作为其它癌症治疗方式(例如其它化学、放疗、手术切除)的辅助疗法。
具体地，本发明：
1)利用条件增殖型腺病毒同时高效表达人类sirpα-fc融合基因(sirpα对巨噬细胞的调节机制的治疗作用已在多种类型恶性肿瘤被证实)，sirpα能特异性与肿瘤细胞表面cd47结合，阻断cd47-sirpα的负调节作用，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用；并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用；
2)利用具有高亲和力的sirpα突变株cv1的结合区基因与人类igg1的fc段基因融合的sirpα-fc基因，保证能高效表达，并在翻译后以融合蛋白形式表达，且不引入其它无效蛋白序列；
3)利用人端粒酶逆转录酶启动子控制e1a的表达，缺失e1b19kda与55kda基因，保证病毒在肿瘤细胞内特异增殖，并增加病毒的包装容量；
4)腺病毒e1a表达框与外源插入的sirpα-fc表达框方向相反，并在两者中间加入一段绝缘子序列，减少两个表达框的相互干扰，提高病毒进入细胞后的增殖效率(与e1a表达框相关)与外源基因的表达效率(与sirpα-fc表达框相关)；
5)利用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒纤毛构建嵌合型腺病毒载体，提高腺病毒对肿瘤细胞(肿瘤干细胞)的感染效率，并且降低病毒免疫原性。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明中，如果没有特别说明，sirpα-fc基因是指sirpα-fc融合基因读码框。具体地，所述sirpα-fc基因是具有高亲和力的sirpα突变株cv1的结合区基因与人类igg1的fc段基因融合。
实施例1：重组腺病毒sg635、sg635-sf的构建
1.根据ccau启动子序列(seqidno：2所示)及人sirpα-fc融合基因(seqidno：6所示)合成ccau-sirpα-fc基因(简称ccau-sf)，两端引入酶切位点(xbai+sali)，委托上海捷瑞生物公司全基因合成，装入pca16载体(参见cn201310460980.9)中，构建成功载体，命名为pca16-ccau-sf。
2.质粒pca16-ccau-sf经(bglii)酶切后，回收ccau-sf-sv40polya-绝缘子表达框片段，将整个表达框装入经同样酶切后的载体片段p74-tp(bglii)(参见cn201310460980.9)中，选择反向连接的阳性克隆子，构建成功载体，分别命名为p74-tp-ccau-sf(载体图谱如图1所示)。
3.将纯化获得的p74-tp及p74-tp-ccau-sf分别与含有腺病毒基因组右臂的骨架质粒ppe3-f35(chinesesciencebulletin.2008；53(12):1777-83)，通过lipofectamine(购于invitrogen公司)共转染至hek293细胞(购于美国标准生物品收藏中心，atcc)内重组，获得重组溶瘤腺病毒sg635、sg635-sf。
对于该重组人腺病毒sg635-sf，申请人已于2016年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:v201637，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，430072。
实施例2：卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3中cd47的表达情况检测
卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3(购于美国标准生物品收藏中心，atcc)按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，48小时后收集细胞，轻轻吹打数次，使细胞分散成单个细胞，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，加入按照1:1000比例稀释的fitc抗人cd47抗体(购于bd公司)，室温避光孵育30分钟，guava流式细胞仪检测两个细胞株cd47的表达量。结果发现，ho8910和sk-ov-3细胞中cd47的表达量均较高，其中ho8910细胞中cd47的表达量为32.93％，sk-ov-3细胞中cd47的表达量为38.90％，具体如图2所示。
实施例3：重组腺病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3后融合蛋白sirpα-fc的westernblotting检测
实施例2所述的ho8910和sk-ov-3细胞按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝5分别加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635与sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，培养48小时，待细胞大部分脱落后收集细胞上清，westernblotting实验检测sirpα-fc融合蛋白的表达。结果发现，重组溶瘤腺病毒sg635-sf在ho8910和sk-ov-3细胞中均能表达大小约为41.87kda的sirpα-fc融合蛋白，具体如图3所示。
实施例4：重组腺病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3后融合蛋白sirpα-fc的elisa检测
实施例2所述的ho8910和sk-ov-3细胞按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝5分别加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，培养48小时，待细胞大部分脱落后收集细胞上清，elisa实验定量检测sirpα-fc融合蛋白的表达。包被液将抗原兔抗人igg(购于abcam公司)稀释到0.1μg/ml，100μl每孔包被酶标反应板，4℃过夜；用pbst(pbs溶液加上tween-20)，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加封闭液2％bsa，100μl/孔，37℃孵育60min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加入样品(病毒sg635-sf感染ho8910和sk-ov-3细胞后收集的上清)及标准品西妥昔(购于merck公司)，用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释，设复孔和对照孔，37℃孵育60min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；用封闭液以1:1000稀释抗体羊抗人igg(购于abcam公司)，100μl/孔，37℃孵育45min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加入二抗鼠抗羊(购于abcam公司)1：10000，100μl/孔，37℃孵育60min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加入底物液tmb,100μl/孔，37℃避光显色15min；每孔加50μl终止液终止反应，酶标仪a450nm的od值；绘制标准曲线，计算sirpα-fc融合蛋白的表达量。结果发现，重组溶瘤腺病毒sg635-sf在ho8910和sk-ov-3细胞中均能表达sirpα-fc蛋白，并且表达量较高，具体如图4所示。
实施例5：重组溶瘤腺病毒sg635-sf在体外培养的肿瘤细胞内增殖实验
实施例2所述的ho8910和sk-ov-3细胞分别按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝5分别加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635与sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时、48小时、96小时收集，冻融三次，用tcid50法来检测病毒滴度(方法参见美国qbiogene公司的adeasytm操作手册)。以0小时病毒滴度为参照，算出病毒在48小时、96小时的增殖倍数。结果发现sg635-sf在肿瘤细胞中随着时间呈几何倍数增殖，具有良好的增殖能力，具体如图5所示。
实施例6：重组溶瘤腺病毒sg635-sf在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验
实施例2所述的卵巢癌细胞株ho8910和sk-ov-3分别按1×104细胞/孔铺在96孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天按不同moi值梯度加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635及sg635-sf，每个moi值设置3个重复，培养7天后，应用mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，购于sigma公司)法检测细胞生长曲线。结果发现，sg635-sf对卵巢癌细胞具有良好的杀伤能力，具体如图6所示。
实施例7：重组溶瘤腺病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910后cd47的表达检测
实施例2所述的ho8910细胞按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝5分别加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635及sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，48小时后收集细胞，轻轻吹打数次，使细胞分散成单个细胞，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，加入按照1:1000比例稀释的fitc抗人cd47抗体(购于bd公司)，室温避光孵育30分钟，guava流式细胞仪检测ho8910细胞cd47的表达量。结果发现，相较于对照病毒sg635，ho8910细胞感染了病毒sg635-sf后cd47的表达量显著下降，具体如图7所示。
实施例8：重组溶瘤腺病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910后sirpα-fc的表达检测(免疫荧光)
实施例2所述的ho8910细胞按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝5分别加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635及sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养。48小时后，吸去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)轻轻洗3次，吸去pbs，每孔加入4％多聚甲醛固定液100μl，室温孵育30min；用pbs洗3次，每孔加入2％bsa100μl，室温避光孵育30min；用pbs洗3次，加入1×dapi50μl/孔，室温避光孵育10min；pbs洗3次，加入按1：200比例稀释的fitc抗人igg1(h+l)抗体(购于bd公司)50μl/孔，阴性对照加入2％bsa50μl/孔，室温避光孵育1小时；用pbs洗3次，加入2％bsa50μl/孔，荧光显微镜下观察实验结果。结果发现，病毒sg635-sf感染ho8910细胞后能表达sirpα-fc基因，可观察到绿色荧光，具体如图8所示。
实施例9：重组溶瘤腺病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株ho8910后sirpα-fc封闭cd47表达效果检测
实施例2所述的ho8910细胞按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝5分别加入实施例1获得的重组溶瘤腺病毒sg635及sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养。48小时后，吸去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)轻轻洗3次，吸去pbs，每孔加入4％多聚甲醛固定液100μl，室温孵育30min；用pbs洗3次，每孔加入2％bsa100μl，室温避光孵育30min；用pbs洗3次，加入1×dapi50μl/孔，室温避光孵育10min；pbs洗3次，加入按1：200比例稀释的fitc抗人cd47抗体(购于bd公司)50μl/孔，阴性对照加入2％bsa50μl/孔，室温避光孵育1小时；用pbs洗3次，加入2％bsa50μl/孔，荧光显微镜下观察实验结果。结果发现，病毒sg635-sf感染ho8910细胞后表达的sirpα-fc基因能够与ho8910细胞表面的cd47分子特异性结合，使cd47表达量下降，具体如图9所示。
实施例10：重组溶瘤腺病毒sg635-sf感染卵巢癌细胞株sk-ov-3和ho8910后对细胞凋亡的检测
根据cmv启动子(seqidno：3所示)及sirpα-fc基因(seqidno：6所示)cmv-sirpα-fc，两端引入酶切位点(ecori+sali)，委托上海捷瑞生物公司全基因合成，装入载体片段pdc311(购于加拿大microbixbiosystemsinc)中，构建成功载体，分别命名为pdc311-sf。将纯化获得的pdc311-sf，分别与含有腺病毒基因组右臂的骨架质粒ppe3-f35(chinesesciencebulletin.2008；53(12):1777-83)，通过lipofectamine(购于invitrogen公司)共转染至hek293细胞(购于美国标准生物品收藏中心，atcc)内重组，获得重组腺病毒ad-sf。
实施例2所述的sk-ov-3和ho8910细胞按5×105细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按moi＝10分别加入病毒ad-blank、ad-sf、sg635及sg635-sf，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养。培养24小时后收集细胞并消化成单个，用细胞凋亡试剂盒(购于bd公司)处理收集好的细胞，guava流式细胞仪检测感染病毒后sk-ov-3和ho8910细胞的凋亡情况。结果发现，相较于对照病毒ad-blank、ad-sf及sg635，感染了病毒sg635-sf的sk-ov-3和ho8910细胞凋亡情况明显，具体如图10所示。
实施例11：重组溶瘤腺病毒sg635-sf动物实验
第一部分：移植瘤模型建立及肿瘤生长曲线绘制
第一步：4～6周龄balb/c裸鼠90只，平均重量22～27g，由上海中科院实验动物培育中心提供，清洁级动物实验室饲养。
第二步：体外培育人卵巢癌细胞ho8910及sk-ov-3，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用pbs液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用pbs液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
第三步：分别于裸鼠右肋背部皮下接种ho8910及sk-ov-3细胞，0.1ml/只。接种三周左右后，可见接种部位皮下长出米粒大小硬结，移植瘤模型建成。待瘤体直径生长至7-9mm时开始治疗。挑选30只皮下肿瘤生长至7-9mm的ho8910移植瘤及50只sk-ov-3移植瘤分别进行治疗，将ho8910裸鼠随机分为3组，sk-ov-3裸鼠随机分为5组。给药途径为直接瘤内多点注射。
第四步：每日观察小鼠的生活状态并定期测量肿瘤的体积，定期测量一次肿瘤的最长径(a)及其垂直径(b)，按公式(a×b2)/2计算肿瘤的体积，观察不同剂量组的疗效。
ho8910移植瘤实验设置对照组pbs组、sg635组及治疗组sg635-sf组；sk-ov-3移植瘤实验设置对照组pbs组、ad-blank组、ad-sf组、sg635组及治疗组sg635-sf组。结果发现，对于2种移植瘤模型，sg635-sf治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有显著统计学差异(p<0.05)，说明基因-溶瘤腺病毒sg635-sf对卵巢癌动物模型有很强的抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展，具体如图11所示。
第二部分：
sk-ov-3移植瘤治疗完成后每周每个实验组抽取2只裸鼠进行眼眶采血，采血量为100ul/只，elisa实验定量检测治疗后裸鼠血液中sirpα-fc融合蛋白的表达。包被液将抗原兔抗人igg(购于abcam公司)稀释到0.1μg/ml，100μl每孔包被酶标反应板，4℃过夜；用pbst(pbs溶液加上tween-20)，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加封闭液2％bsa，100μl/孔，37℃孵育60min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加入样品(采集的每个实验组的血液)及标准品西妥昔(购于merck公司)，用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释，设复孔和对照孔，37℃孵育60min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；用封闭液以1:1000稀释抗体羊抗人igg(购于abcam公司)，100μl/孔，37℃孵育45min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加入二抗鼠抗羊(购于abcam公司)1：10000，100μl/孔，37℃孵育60min；用pbst，200μl/孔洗4次，每次浸泡5min，拍干；加入底物液tmb,100μl/孔，37℃避光显色15min；每孔加50μl终止液终止反应，酶标仪a450nm的od值；绘制标准曲线，计算sirpα-fc融合蛋白的表达量。结果发现，相较于对照组，治疗组sg635-sf能在sk-ov-3移植瘤裸鼠体内持续稳定表达sirpα-fc蛋白，并且表达量较高，具体如图12所示。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110>上海白泽生物科技有限公司
<120>封闭cd47并激发抗肿瘤免疫的重组溶瘤腺病毒及其用途
<130>167624
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