本发明涉及一种生殖器官及腺毛组织特异启动子ghs及其应用，具体为一种能够在植物生殖器官及腺毛组织特异表达的启动子proghs(简称ghs启动子)以及该启动子在植物遗传改良上的应用。
背景技术：
植物的发育是指植物体的构造和机能由简单到复杂的变化过程，在这个相辅相成的过程中始终受到一系列内部和外部因素的控制。在分子水平上，植物的生长发育和生命周期是植物体在多种代谢和生理过程基础上所发生的不同基因在时间上和空间上有序表达、协同作用的综合现象。基因在整个生命周期中的开关、表达模式以及表达丰度等均受到精确调控。基因表达的调控可在多个层次上进行，包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控，其中转录水平的调控是最主要和最关键的调控方式。在转录水平上，真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用进行调控，主要是通过调控转录因子与启动子的结合与否、或者结合强弱的变化等来实现。因此，分离并克隆有关表达特异的启动子可以在转录水平上有效地调节基因的表达，以实现基因在不同组织、不同器官或不同环境条件下的表达。此外，获得组织特异性启动子对于转基因作物的研究以及商业化开发都具有重大意义。
组织特异性启动子按照植物组织器官可以分为营养器官表达和生殖器官表达的特异性启动子。具体包括叶片、根、韧皮部、维管束、花器官、果实、种子特异性以及其它组织特异表达启动子等。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位累积，增加区域表达量，还可以避免植物营养的不必要浪费，作为植物工程中最富有前景的调控元件，组织特异性启动子一直是生物学领域内的研究热点，并且已经在发育生物学研究、以及植物基因工程方面得到了应用。
果实和种子是植物的生殖器官，是营养物质的主要储藏场所。利用果实或种子等器官特异性启动子来调控相应目的基因的表达，不但可以提高目的基因在这些部位的表达量，还可以降低生物能耗以避免不必要的营养浪费，有利于表达产物的分离以及提高作物的产量和品质。已有研究报导，来源于玉米的emb5基因启动子在单、双子叶植物中都具有较高的胚特异活性，成为作物遗传改良中理想的单、双子叶植物都适宜的胚高效特异启动子(于丽萍,2010)。而来源于小麦的tapr61基因启动子在禾本科作物中可以维持其种子特异表达的模式(kovafchuketal,2012)。瓜尔豆甘露糖聚合酶(mannansynthasems)基因的启动子能够在紫花苜蓿的胚乳中特异性表达(naoumkinaanddixon,2011)，通常用于指导在豆科物种胚乳-特异性转基因的表达。来自于绿豆的8s球蛋白基因8sgα启动子主要在拟南芥种子中表达，在种子生物反应器中可以用于指导外源蛋白的表达(chenmx,etal,2014)。近年来，分离与种子特异表达有关的启动子还包括：来源于西瓜的果实特异表达基因agpl1的启动子(yinetal.,2009)、番茄的e8p1基因启动子(郭淑华etal.,2007)等。此外，糊粉层特异表达基因alj启动子、胚乳特异表达基因gtl3a启动子在生物反应器上也展现了很好的应用前景(kuwanoetal,2011；heetal,2011)。
尽管科学家已经在不同的植物中克隆了上述与种子特异性表达有关的启动子，但是到目前为止，具有生殖器官特异性及棉花纤维组织特异性的启动子的研究较少，有待更深入的研究。
技术实现要素：
本发明针对上述技术缺陷，目的在于提供一种生殖器官及纤维组织特异性表达启动子ghs及其应用，即提供一种新的能够在植物生殖器官及棉花纤维组织中特异表达的启动子ghs。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了第一方面，本发明提供一种启动子ghs，序列如seqidno.1所示；该序列可以通过人工合成的方法进行合成，也可以通过生物克隆法即pcr和酶切的方法从棉花的基因组中进行克隆。
第二方面，本发明提供一组用于扩增所述启动子ghs的外侧引物对，所述外侧引物对的序列如seqidno.2、seqidno.3所示。
第三方面，本发明提供一组用于扩增所述启动子ghs的内侧引物对，所述内侧引物对的序列如seqidno.4、seqidno.5所示。
第四方面，本发明提供一种重组载体，包含所述启动子ghs，所述重组载体具体可以是如实施例1中所述的连接启动子ghs的pmd18-t载体等。
第五方面，本发明提供一种转化体，包含所述启动子ghs，所述转化体采用的宿主为大肠杆菌或农杆菌。
第六方面，本发明提供一种所述启动子ghs的用途。
优选地，所述用途具体为启动子ghs在驱动植物中目的基因在特定组织中表达的应用；所述植物包括棉花、拟南芥；所述组织包括生殖器官、纤维等。
优选地，所述启动子ghs在驱动植物中目的基因在特定组织中表达的应用具体为：用含所述转化体的悬浮液浸泡植物组织。
优选地，所述用途具体为启动子ghs在植物育种中的应用。
第七方面，本发明提供一种所述启动子ghs制备方法，包括人工合成法或生物克隆法；
优选地，所述启动子ghs的人工合成的方法具体为：
步骤一、根据启动子ghs的正链和副链序列，分别合成出长度150～200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段；
步骤二、将所述单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段分别退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段；
步骤三、混合所述双链寡核苷酸片段，经t4dna连接酶催化组装成一个完整的启动子ghs。
优选地，所述生物克隆法具体为：
步骤1、提取棉花基因组dna；
步骤2、以所述dna为模板，依次用所述外侧引物、内侧引物进行扩增；
步骤3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得启动子核苷酸ghs。
优选地，所述棉花为陆地棉。
本发明所述的启动子在拟南芥花药和柱头组织，花瓣，萼片腺毛，叶片腺毛，以及种子珠柄以及部分种子的表皮毛均特异性表达。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明首次采用分子克隆方法，从陆地棉(gossypiumhirsutum)基因组中分离获得了新的ghs启动子，并且通过转基因实验证实了它具有生殖器官及纤维组织特异性，利用该启动子可以特异驱动基因在上述组织中高水平地转录表达，从而达到了本发明目的。
本发明克隆分离组织特异表达启动子ghs，并利用该启动子在拟南芥中特异表达报告基因以提高基因在特定组织的表达水平。
本发明的ghs启动子具有如下特性：a)、在拟南芥组织中的表达情况十分明确，该启动子在棉花等植物上没有报道；b)、该启动子序列来自于棉花胚珠，其在拟南芥腺毛中的特异性表达暗示其可以特异性调控目的基因在棉花纤维中的表达；c)、结构新，在核酸水平上与已见报道的其它启动子无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。
ghs启动子可以特异性提高基因在植物生殖器官及棉花纤维上的表达，为提高纤维衣分含量提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是ghs启动子遗传转化载体的构建示意图；
其中，lb、rb分别为t-dna的左右边界序列，ghs为本发明的特异表达启动子，nos为终止子；
图2是转ghs启动子转化拟南芥的不同组织的gus染色分析图；
其中，a：未成熟花；b：成熟花；c：果荚；d：叶片；e:萼片；f：种子；
图3是rna原位杂交分析ghs基因在棉花胚珠上的表达分析图；
其中，a：反义探针杂3dpa野生型胚珠；b：图a局部放大视野；c：正义探针杂3dpa野生型胚珠；f：纤维；isc：内表皮层；osc：外表皮层；en：胚乳；bar＝200μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1种皮与纤维组织特异启动子ghs的克隆
(一)陆地棉(gossypiumhirsutum)dna提取
1)取新鲜棉花叶片装于有钢珠的离心管，液氮速冻，用样品快速研磨仪55hz处理100秒直至叶片彻底打碎，
2)加入600μl的ctab提取液(含2％β-巯基乙醇)，颠倒混匀，65℃水浴锅水浴30-60分钟。
3)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:l)，温和颠倒混匀，静置10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟；
4)转移上清至新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置30分钟以上；
5)12000rpm离心10分钟，弃上清；加入75％乙醇700μl，漂洗沉淀；
6)重复漂洗，弃上清，于通风橱吹风，待离心管干燥后将沉淀溶于50-100μl水中，-20℃储存备用。
(二)ghs启动子序列克隆
以棉花基因组dna为模板，先用外侧引物进行第一轮扩增，所述外侧引物如seqidno.2和seqidno.3所示：
seqidno.2：ttcgtcatatatgcttgtaaat，
seqidno.3：aaaacgaaaacccaagaa；
然后以稀释50倍的第一轮pcr产物为模板，用内侧引物进行第二轮扩增，所述内侧引物如seqidno.4、seqidno.5所示：
seqidno.4：ttatgcaatgtttaacaaatattatg，
seqidno.5：cttttatttgtattagatgaatattatgta；
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约2000bp的启动子序列。回收后连接pmd18-t载体，得重组载体，送交生物公司测序检测。该序列即为ghs启动子，序列见seqno.1。
实施例2：ghs启动子植物表达载体构建
选实施例1中测序正确的菌株提取质粒，用于植物表达载体的构建。将上述连接ghs启动子的pmd18-t重组载体质粒与空的pcambia1305质粒分别进行bamι和ncoι双酶切。37℃酶切15～30分钟，对酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收重组质粒酶切后的ghs启动子片段和pcambia1305酶切后的载体大片段并连接，连接体系如下：
16℃连接过夜，然后采用热激法转化至大肠杆菌dh5α，挑取克隆进行pcr检测，阳性克隆送测序验证；
构建完成的ghs-pcambia1305启动子表达载体见图1。在本图中gfp以及gus基因可以根据需要替换成其它的基因，以用于不同的实验目的。
实施例3：ghs启动子驱动gus基因在拟南芥中组织表达分析
(一)ghs-pcambia1305载体的遗传转化
1)ghs-pcambia1305载体转化农杆菌
挑选实施例2中测序正确的菌株，提取质粒用于后续农杆菌转化。所述方法与转化大肠杆菌类似。取2μl重组质粒加入100μl农杆菌gv3101感受态细胞中，轻轻混匀后冰上静置30分钟。液氮处理3分钟后立即37℃热激10分钟，随后冰浴1～3分钟。加入800μllb无抗性液体培养基，28℃摇床180转/分钟培养3～5小时。4000rpm离心1分钟后弃掉大部分上清液，将菌体悬浮后均匀涂布于固体lb卡那霉素抗性平板上，28℃培养箱，培养2～3天。
挑单克隆菌于lb卡那霉素抗性液体培养基，28℃摇床培养过夜，取2μl菌液进行pcr扩增检测。
2)浸花法转化拟南芥
将获得的阳性农杆菌克隆活化培养后，以1:100比例接种到500mllb抗性培养基中，28℃过夜培养至od600＝0.6，4000rpm离心10分钟收集菌体，用拟南芥转化缓冲液重悬后得转化液。选用五周左右生长良好花蕾较多的拟南芥植株，将花蕾浸入转化液中约30秒。将植株用保鲜膜封好，暗培养一天。揭去保鲜膜，转为正常培养条件培养，待种子成熟后收集t0代转基因种子。
(二)转基因拟南芥的阳性筛选
将t0代种子用无菌播种的方法播种于25mg/l潮霉素抗性的ms培养基上，约1周后将抗性植株移植至穴盘中培养。继续培养1～2周后提取拟南芥dna进行pcr验证，阳性植株即为t1代植株。收获t1代种子(t2代)继续播种筛选，重复至t3代获得纯系。
(三)转基因拟南芥的gus活性组织化学染色
在ms培养基上播种纯系ghs-pcambia1305转基因拟南芥，分别取不同生长时期及不同组织进行gus染色，观察启动子表达活性。
将拟南芥材料放入gus染液中，37℃避光反应2～6小时，待观察到着色现象后用100％酒精脱色3次(30min/次)，去掉浮色后将材料转移至载玻片，置于显微镜下观察。
(四)ghs启动子驱动gus基因的转基因拟南芥gus活性染色分析
gus组织化学染色后，如图2所示，在转基因拟南芥的叶片腺毛、萼片腺毛、花瓣、花药、柱头及发育中的果荚、种子中均可检测到gus报告基因的表达(显示为绿色)，并在表皮毛(包括花萼腺毛、叶片腺毛、种皮毛)中表达较强。实施例3的结果表明ghs启动子可以诱导目的基因在植物生殖器官表达，同时报告基因在腺毛上的表达强烈暗示ghs可以参与棉花纤维的发育。
实施例4：种皮及纤维特异表达启动子ghs的人工合成
根据ghs启动子的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度约150～200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经t4dna连接酶催化组装成一个完整的ghs启动子。该合成的dna片段含有seqidno:1中1～2000位的核苷酸序列。
实施例5：ghs启动子的组织定位分析
原位杂交实验选取陆地棉徐州142开花后3天的胚珠材料，在ghs基因的特异性区段设计引物，克隆特异性区段并构建于pgem-t载体上，载体经线性化后分别用sp6和t7聚合酶进行转录，所得rna经碱解后即分别得到正义与反义探针，用于后续的杂交实验。rna原位杂交实验分别利用ghs基因的正义与反义探针进行杂交，室温避光显色36小时后观察结果。比较反义探针与正义探针中ghs基因杂交信号差异发现(图3a-3c)，其差异主要集中于纤维与胚珠内外表皮层及胚乳细胞。结果显示：在3dpa胚珠的纤维以及种子外表皮层和内表皮层细胞中可观察到明显的紫色信号，而正义探针未观察到任何信号。这一结果表明ghs基因主要在胚珠内外表皮层细胞、胚乳细胞及纤维细胞中表达，暗示ghs基因在纤维发育及种子填充过程中发挥的重要功能。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110>上海交通大学
<120>一种生殖器官及腺毛组织特异启动子ghs及其应用
<130>dag35903
<160>5
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>2000
<212>dna
<213>gossypiumhirsutum
<400>1
1tcttagatttgtttatggatttattcacttgtgacgttcatagtgtggtttagctcaatc
61ctgggtaagtaactgactatgtgtatgtagcccgtatactttgatgtgttgaaagcctga
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