本发明涉及一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，属于酶技术领域。
背景技术：
环糊精凭着内疏外亲的性质能包合许多疏水性客体分子而改变他们的理化性质，在各个领域有许多广泛的应用。目前，工业上环糊精均是通过环糊精葡萄糖基转移酶环化反应作用于淀粉底物进行合成，随着反应的进行，体系中环糊精含量逐渐升高，部分环糊精会与酶自身结合影响其活性，进而影响反应效率，造成产物抑制现象。
目前，研究者主要通过定点突变、添加有机试剂和膜分离手段来解决环糊精生产过程中的产物抑制问题。但是，使用定点突变技术一生物技术手段改造环糊精葡萄糖基转移酶虽然简单易行、重复性好，但往往引起酶其他性质(如酶活力、产物特异性、热稳定性等)的改变；使用膜分离技术虽能根据分子量大小对产物中环糊精进行有效分离从而减弱产物抑制，但淀粉极其引起膜的堵塞，效果不显著，操作繁琐，成本较高；添加有机试剂一方面会导致成本的增加，另一方面试剂的残留限制了环糊精在食品领域的应用。
同时，这三种手段中采用的酶为游离的，均不可重复使用。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，该方法不仅能有效减弱环糊精葡萄糖基转移酶的产物抑制现象，而且制备工艺简单，成本较低，制得的固定化酶稳定性和重复利用性好。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法，所述方法为将环糊精葡萄糖基转移酶进行固定化来减弱其产物抑制；所述固定化为先配制明胶溶液，将得到的明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶中并混合均匀，然后将得到的混合溶液倒入平板中，成一定厚度，将倒入平板中的溶液进行冷却吸附，得到凝胶薄膜，再将得到的凝胶薄膜切成小碎片，用戊二醛溶液浸泡交联，最后将凝胶碎片洗净，得到可减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的固定化环糊精葡萄糖基转移酶；所述产物为环糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述产物为β-环糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述明胶溶液的溶质质量百分比浓度为5％-12％。
在本发明的一种实施方式中，所述将得到的明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶中并混合均匀，要求明胶溶液预先恒温至45℃，环糊精葡萄糖基转移酶加入量为溶质质量的5％-30％。
在本发明的一种实施方式中，所述将得到的混合溶液倒入平板中，要求将得到的混合溶液立即倒入平板中，防止分层。
在本发明的一种实施方式中，所述倒入平板的厚度为2-8mm。
在本发明的一种实施方式中，所述冷却为在4℃下进行放置冷却，冷却吸附时间为30-90min。
在本发明的一种实施方式中，所述戊二醛溶液浓度为0.1％-0.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述交联温度为0-30℃，交联时间为0.5-3h。
本发明提供了上述减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法制备得到的环糊精葡萄糖基转移酶。
本发明提供了上述减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的方法在生产环糊精及其衍生物方面的应用。
有益效果：
(1)本发明得到的固定化环糊精葡萄糖基转移酶凝胶网孔较大，产物抑制程度明显减弱。
(2)本发明利用明胶包埋交联固定化环糊精葡萄糖基转移酶，制备工艺简单，价格低廉，制备条件温和且制备得到的酶可重复利用。
(3)本发明得到的固定化环糊精葡萄糖基转移酶酶相比于游离酶，稳定性明显改善。
(4)本发明提供的方法制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶具有潜在的工业应用价值。
附图说明
图1游离酶和固定化酶在不同浓度的环糊精抑制剂下生产环糊精的过程。
图2不同浓度明胶制得的固定化酶在反应12h时的产物抑制情况。
图3-55％浓度明胶固定化酶切片的显微镜图。
图6-810％浓度明胶固定化酶切片的显微镜图。
图9-1115％浓度明胶固定化酶切片的显微镜图。
图12温度对游离和固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。
图13ph对游离环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。
图14ph对固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
产物抑制情况测定方法如下：
预先用10mm磷酸缓冲液(ph6.5)配制的底物麦芽糊精(de＝5)和产物β-环糊精的混合物，其中麦芽糊精在反应体系中终浓度为5％(干基，w/v)，β-环糊精浓度为0、1和2mg/ml，往各体系中加入游离酶或制备好的固定化酶，加酶量为0.2u/g，不同时间点(0、1、3、6、9、12、18h)取样，煮沸灭酶10min后，10000r/min离心20min后，取上清液进行产物分析，以产物下降程度判断产物抑制情况。抑制率按公式(2)计算：
抑制率＝(c0-c)/c0×100％(2)
其中，c0为无抑制剂存在时环糊精的产量，c为有抑制剂存在时环糊精的产量。
固定化酶环化活力的测定方法如下：
取制备好的固定化酶2g，加入装有20ml预先用10mm磷酸缓冲液(ph6.5)配制的5％(w/v)麦芽糊精(de＝4)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，取出1ml煮沸灭酶15min。结束后加入3.5ml30mmnaoh，再加入0.5ml由5mmna2co3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液，在室温下显色20min，在550nm下测定吸光度。以未添加酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。
酶活按公式(1)计算：
式中：x—cgt酶活；a—样品与空白差值；k—标准曲线斜率；v—反应体系体积，20ml；m—为产物环糊精相对分子质量，mα-环糊精＝973g/mol、mβ-环糊精＝1135g/mol；tmin—反应时间，10min；m—固定化酶质量，2g；10-3、106—单位换算，1ml＝10-3l、1mol＝106μmol。
游离酶环化活力的测定方法同上：
将“取制备好的固定化酶2g”改成“量取20μl游离酶液”。酶活力回收率按照以下公式进行计算：
酶活回收率(％)＝固定化酶总活力/游离酶总活力×100％
环糊精含量的测定方法如下：
取得的产物用10mm磷酸缓冲液(ph6.5)稀释一定倍数后取1ml，加入3.5ml30mmnaoh，再加入0.5ml由5mmna2co3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液，在室温下显色20min，在550nm下测定吸光度。以10mm磷酸缓冲液(ph6.5)作为空白，然后计算环糊精产量。
实施例1：固定化酶对环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的影响
用水配制8％(w/w)的明胶溶液，冷却至45℃后加入环糊精葡萄糖基转移酶液10％(w/w)进行混合均匀，立即倒入平板中成3mm厚度，放置4℃进行冷却吸附2h，成凝胶薄膜后切成小碎片，用0.25％戊二醛溶液在25℃下浸泡交联1h。用水洗净，待用。将游离酶和制备好的固定化酶进行产物抑制情况分析。(图1为游离酶和固定化酶在不同浓度的环糊精抑制剂下生产环糊精的过程)
从图1中可以看出，在无环糊精抑制剂存在情况下，游离酶在不同时间点作用于麦芽糊精产生的环糊精产量均大于明胶固定化酶；在体系中加入终浓度为1mg/ml的β-环糊精时，游离酶和固定化酶的生产能力均受到抑制，生产速率下降，但固定化酶在反应后期(9-12h)所生产环糊精的量大于游离酶。同样，在加入终浓度为2mg/ml的β-环糊精时，也出现同样的趋势。说明同样浓度的抑制剂存在情况下，固定化酶在生产过程中产量下降的程度明显小于游离酶，能减弱产物抑制情况。
实施例2：明胶浓度对环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的影响
用水配制5％～15％(w/w)的明胶溶液，冷却至45℃后加入环糊精葡萄糖基转移酶液10％(w/w)进行混合均匀，立即倒入平板中成3mm厚度，放置4℃进行冷却吸附2h，成凝胶薄膜后切成小碎片，用0.25％戊二醛溶液在25℃下浸泡交联1h。用水洗净，待用。将游离酶和制备好的固定化酶进行产物抑制情况分析。(图2为不同浓度明胶制得的固定化酶在反应12h时的产物抑制情况)
从图2中可以看出，明胶浓度较低(5％-12％)时，1mg/ml或2mg/mlβ-环糊精的存在导致的抑制率均低于游离酶，而明胶浓度为15％时，在1mg/ml或2mg/mlβ-环糊精存在下，抑制率分别为35.4％和72％，明显高于游离酶(抑制率为31.6％和70％)。
从图3-11能够看出，不同明胶浓度制得固定化酶凝胶网孔大小不一，浓度越高，网孔越小越密集。明胶浓度在较低情况下，形成的凝胶网孔较大，底物和产物竞争时，底物可能处于较优地位，因此，产物抑制明显减弱；而高浓度明胶制备的固定化酶凝胶网孔较小，只允许小分子的底物和产物通过，反而加剧了抑制程度。因此，用于减弱环糊精葡萄糖基葡萄糖基转移酶的明胶浓度为5％～12％。(图3-11为5％、10％、15％浓度明胶固定化酶切片的显微镜图，a、b、c分别代表4倍、10倍、50倍显微镜下看到的视图)
实施例3：温度对固定化环糊精葡萄糖基转移酶活力的影响
用水配制8％(w/w)的明胶溶液，冷却至45℃后加入环糊精葡萄糖基转移酶液10％(w/w)进行混合均匀，立即倒入平板中成3mm厚度，放置4℃进行冷却吸附2h，成凝胶薄膜后切成小碎片，用0.25％戊二醛溶液在25℃下浸泡交联1h。用水洗净，待用。
将游离酶和制备好的明胶固定化酶分别在不同温度(30-80℃)下反应，进行环化活力的测定，将最高的环化活力定为100％，计算相对活力，以温度为横坐标，相对活力为纵坐标作曲线，以确定游离酶和固定化酶的最适温度。(图12为温度对游离和固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响)
从图12结果可以看出，游离酶和固定化酶的最适温度均为60℃，说明酶固定化后未改变酶的最适温度。但固定化酶在40-80℃下的相对活力较游离酶高，可能是酶被固定化后热稳定性好而导致的。
实施例4：ph对固定化环糊精葡萄糖基转移酶活力的影响
用水配制8％(w/w)的明胶溶液，冷却至45℃后加入环糊精葡萄糖基转移酶液10％(w/w)进行混合均匀，立即倒入平板中成3mm厚度，放置4℃进行冷却吸附2h，成凝胶薄膜后切成小碎片，用0.25％戊二醛溶液在25℃下浸泡交联1h。用水洗净，待用。
用不同ph值的缓冲液(10mm)稀释配制底物，其中，ph值采用以下3种体系：柠檬酸-柠檬酸钠(ph4-6)、na2hpo4-nah2po4(ph6-8)和甘氨酸-naoh(ph8-10)，进行环化活力的测定，其中游离酶用对应不同的ph值缓冲液进行稀释。将最高的环化活力定为100％，计算相对活力，以ph为横坐标，相对活力为纵坐标作曲线，以确定游离酶和固定化酶的最适ph。(图13-14为ph对游离和固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响)
从图13-14结果可以看出，游离酶的最适ph为6.5，且在弱酸性和中性(ph5-7)条件下环化活力较高。而固定化酶的最适ph为5.5和8.5，且在弱酸性至弱碱性(ph5-9.5)条件下环化活力较高。两者相比较，能够发现游离酶被固定化以后，其适应的ph范围变广，更有利于工业的应用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。