本发明属于生物
技术领域：
，具体的说是涉及一种萌发初期的羊草种子rna提取方法。
背景技术：
：rna是生物体内的重要遗传物质，随着分子生物学技术的快速发展，rna成为分子克隆最重要的模板材料，rna的提取质量对于分子生物学领域的研究显得极为重要。rna提取的完整性和纯度是衡量rna质量的两个关键指标。高纯度和完整性好的高质量rna对于分子克隆、cdna文库构建和高通量测序等后续研究和分析的客观性和准确性极为重要。尽管目前rna提取的技术已经很成熟，提取的方法多种多样，但在不同的物种之间由于物种组织结构和内含物质的特异性，rna的提取质量差异很大。究其原因主要是提取方法的适宜性、试剂耗材的处理、人的操作、组织材料的选择和保存等因素。其中提取方法的适宜性和组织材料关系密切。不同的组织材料含有的多糖、脂质、色素类物质、淀粉、蛋白质和酚类物质等不同。在植物种子中，淀粉、多糖、蛋白质、脂质和酚类等次生物质丰富，这些物质对于rna的提取有不利影响。因此，简单的选择一种市面上常用的提取试剂盒难以达到预期的实验目的，而且众多的rna提取试剂盒也不同程度的存在一些缺陷，对于一些特殊的组织材料提取效率低，提取的总rna质量较差。为此，针对特定的组织材料需要制定适宜的提取方法。羊草又称碱草(leymuschinensis)，是禾本科赖草属多年生根茎型禾草，是我国草甸草原和典型草原的优势种之一，素有“牧草中的细粮”之称。在当前发展草地畜牧业、改善西部生态环境等方面具有重要地位。然而羊草有性繁殖能力低，种子休眠严重，发芽率低，当年采集的种子发芽率仅为10％～20％，严重影响了羊草栽培草地的建设和退化草原的补播恢复。为了培育高产、优质、适应性好的羊草新品种，利用分子生物学手段研究和改良羊草种质资源有着重要意义。然而，羊草的干种子在萌发的初期(萌发3天)所含的淀粉、脂质、蛋白质、多糖和种皮色素等物质较多，严重影响了rna的提取。采用常规的植物rna提取试剂盒trizol等方法难以提取出高质量的羊草萌发初期种子rna。相对于水稻、小麦等禾本科植物，羊草种子较小、种皮较厚、单位质量粒数多，因此，用类似现有技术中的水稻(申请号201410379838)、小麦种子或种胚rna的提取方法，难以满足羊草种子高通量转录组测序的要求。在高通量转录组分析中，单位质量的粒数越多，个体间差异的特异性稀释的越小，一些重要的差异基因在分析中可能筛出而丢失重要的信息，此外个体小、粒数多会积累大量的表皮色素物质，对于rna后续的检测和纯化影响较大。因此，尽可能提高rna提取的效率，减少rna的损失有助于羊草种子rna的分子生物学实验。在羊草种子中，现有技术中通常采用的rna提取方法常常难以达到实验要求，常见的问题是提取纯度低、质量少，小量种子提取更加困难。在提取过程中影响提取质量的主要原因是干种子中游离的rna较少；种子中淀粉含量和蛋白含量很高，大部分rna产物被淀粉和蛋白结合，在洗涤、纯化过程中流失；色素影响rna的质量。技术实现要素：本发明为了克服现有技术存在的不足，我们发明了一种高效、优质的提取羊草萌发初期种子rna的方法，以期为羊草分子生物学的研究奠定重要的工作基础，并为羊草种子rna的提取和下游实验提供条件。本发明是通过以下技术方案实现的：一种萌发初期的羊草种子rna提取方法，该方法选用提取缓冲液a将含有多聚聚乙烯比咯烷酮pvpp的羊草种子冻干粉溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮pvp、乙基苯基聚乙二醇np-40和蛋白酶k，经水饱和酚+氯仿+异戊醇抽提，用trizol提取方法再次抽提，最终得到高质量、高纯度的羊草种子rna。本发明萌发初期的羊草种子rna提取方法的具体操作步骤如下：(1)取0.5g萌发三天时的羊草种子放入加有液氮的研钵中，加入0.05gpvpp，迅速研磨成粉；(2)将含有pvpp的冻干粉末混匀，加入到2ml干净的离心管至0.5ml处，加入500μl提取缓冲液a，旋涡振荡混匀30s，加入2％的pvp、10μlnp-40和50μl质量浓度20mg/ml的蛋白酶k，旋涡振荡2min，置于42℃摇床中以150r/min的速度摇动30min；(3)加入0.5ml预冷的水饱和酚；氯仿；异戊醇＝49∶49∶2，颠倒振荡3～5min，使两项充分混合，在室温下静置5min，4℃、12000g离心5min；(4)取0.5ml上清液至2ml新的干净离心管中，加入1ml的trizol提取液b，加入质量浓度为1％的β-巯基乙醇，旋涡振荡1min，加入0.2ml的氯仿，颠倒振荡3min，4℃、12000g离心5min；(5)取1ml的上清液至新的干净离心管中，加入1ml预冷的异丙醇，在室温条件下放置15min，4℃、12000g离心15min；(6)小心弃去上清液，加入1ml预冷的质量浓度为75％的乙醇，轻轻颠倒摇动以悬浮洗涤沉淀，冰上放置2min，4℃、10000g离心5min；(7)重复上述(6)步骤；将空管4℃、10000g离心2min，小心的吸干余液，在室温条件下干燥3～5min，加入50ulrnase-freeddh2o溶解沉淀即得羊草种子rna。本发明步骤(2)中的提取缓冲液a的配制，如配制10ml提取缓冲液a：包括7mlrnase-freeddh2o、0.5ml摩尔浓度为1mol/l、ph＝9的tris、1ml摩尔浓度为2mol/l的nacl、1ml质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠sds、0.4ml摩尔浓度为0.5mol/l的乙二胺四乙酸edta、1ml摩尔浓度为1mol/l的二硫苏糖dtt。本发明步骤(4)中trizol提取液b的配制体系，如配制100ml的trizol提取液b：包括47.27g摩尔浓度为4mol/l的异硫氰酸胍、0.681g摩尔浓度为0.05mol/l的naac·3h2o、5.83g摩尔浓度为1mol/l的nacl、0.5g质量浓度为5％的sds、0.745g摩尔浓度为0.02mol/l的edta·2h2o，由rnase-freeddh2o溶解后，加入等体积的水饱和酚，用冰醋酸调节ph值在4.2～4.3之间。步骤(6)中质量浓度为75％的乙醇由无水乙醇和rnase-freeddh2o配制，rnase-freeddh2o是经过焦碳酸二乙醇depc处理的高温高压灭菌的超纯水。本发明的有益效果是：本发明羊草种子rna提取方法步骤(1)和(2)中不溶性的pvpp和可溶性的pvp有很强的结合多酚类化合物的能力，dtt和np-40可以有效的阻止二硫键的形成，从而有效的抑制核糖核酸酶的活性，蛋白酶k可以酶解去除核糖核酸酶。步骤(2)和(3)可以较好的去除羊草种子中淀粉和蛋白质的影响，使后续的trizol法提取能够更好的分层。本发明trizol提取液b中高浓度的na+有利于多糖物质的去除，β-巯基乙醇抑制rna酶活性，防止酚类物质氧化。本发明的目的是提供一种萌发初期的羊草种子rna的提取方法，其与现有技术中的提取方法相比较具有以下优点：1、本发明较好的去除了淀粉和蛋白质对rna提取的干扰，使得试管中的溶液分层清晰明显，提取过程方便，蛋白酶k尽可能减少核糖核酸酶对rna影响。2、dtt、pvpp、pvp和β-巯基乙醇以及trizol提取液b中的高浓度na+有利于去除多糖物质和酚类物质对rna的干扰，减少抽提的次数，减少了rna在操作过程中的损失。3、本发明具有高效率、高质量、低成本和周期短等优点，提取的rna可以直接用于分子克隆和高通量测序等分子生物学研究。附图说明图1是本发明提取的rna琼脂糖凝胶电泳图；图1中泳道1、2为萌发3天时没有露白的羊草种子rna，泳道3、4为萌发3天时露白的羊草种子rna；图2是aglienttechnologies2100bioanalyzer文库质检图。具体实施方式以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例中所用实验用品处理及试剂配制说明：rna提取过程中需要使用的枪头及枪头盒、离心管等塑料器皿用质量浓度为0.1％的depc水浸泡过夜，121℃高压灭菌1h，烘干存放。研钵、玻璃器皿、药勺等器皿在180℃烘箱中干热灭菌6h，所有试剂配制中所使用的超纯水均为经过depc处理的rnase-freeddh2o。实施例：一种萌发初期的羊草种子总rna提取方法，具体提取步骤如下：(1)萌发处理3天的羊草种子分别挑选出露白和未露白两种，分别设置2个重复，共4个样本，每个样本取0.5g，放入加有液氮的研钵中，加入0.05gpvpp，迅速研磨成粉；(2)将研磨好的冻干粉和pvpp混匀，加入到2ml干净的离心管至0.5ml刻度处，加入500μl提取缓冲液a，旋涡振荡30s，加入2％的pvp、10μlnp-40和50μl蛋白酶k(20mg/ml)，旋涡振荡2min，置于42℃摇床150r/min摇动30min；(3)加入500μl预冷的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(49∶49∶2)，颠倒振荡3～5min，使两项充分混合，室温静置5min；(4)4℃、12000g离心5min，取0.5ml上清液至2ml新的干净离心管中，加入1mltrizol提取液b，加入1％β-巯基乙醇，旋涡振荡1min，加入0.2ml氯仿，颠倒振荡3min；(5)4℃、12000g离心5min，取1ml的上清液至新的干净离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，室温静置15min；(6)4℃、12000g离心15min，小心弃上清液，加入1ml预冷的75％乙醇，轻轻颠倒摇动以悬浮洗涤沉淀，冰上静置2min，4℃、10000g离心5min；(7)重复一次(6)步骤，将空管4℃、12000g离心2min，小心吸干余液，室温下放置3～5min，立即加入50ulrnase-freeddh2o，轻轻吹打数次，使沉淀溶解。(8)溶解的rna放置在冰上，立即测定od值，跑电泳，进行质量检测。10ml的提取缓冲液a包括7mlrnase-freeddh2o、0.5ml摩尔浓度为1mol/l、ph＝9的tris、1ml摩尔浓度为2mol/l的nacl、1ml质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠sds、0.4ml摩尔浓度为0.5mol/l的乙二胺四乙酸edta、1ml摩尔浓度为1mol/l的二硫苏糖dtt。100ml的trizol提取液b包括47.27g摩尔浓度为4mol/l的异硫氰酸胍、0.681g摩尔浓度为0.05mol/l的naac·3h2o、5.83g摩尔浓度为1mol/l的nacl、0.5g质量浓度为5％的sds、0.745g摩尔浓度为0.02mol/l的edta·2h2o，由rnase-freeddh2o溶解后，加入等体积的水饱和酚，用冰醋酸调节ph值在4.2～4.3之间。羊草种子rna的质量检测：(1)取上述制得的羊草种子rna样品，以rnase-freeddh2o为空对照，利用nanodrop2000超微量分光光度计测230nm、260nm和280nm波长处的od值，获得a260/280和a260/230的比值。具体羊草种子rna得率检测结果如下：序号rna得率(ng/μl)od260/od280od260/od230114802.011.88215172.001.97315921.971.80418981.961.92(2)专用的电泳槽和电泳板以及梳子用0.5mol/l的naoh浸泡半小时，用depc水冲干净，制胶所需的器皿试剂均为专用，1×tbe缓冲液由depc处理水配制。(3)上述制得的羊草种子rna样品取1μl稀释10倍，取2μl稀释后的样品与rnaloadingbuffer按照2∶1体积混合上样。(4)用1×tbe缓冲液配制1.2％的琼脂糖凝胶，220v电泳16min。检测结果显示提取的18s、28s条带清晰，5s条带不明显，说明rna完整性好，如图1所示。(5)所得上述羊草种子rna送公司进行高通量转录组测序，在进行文库构建之前对所得rna样品进行纯化后质量检测aglienttechnologies2100bioanalyzer，所得样品均符合高通量测序要求，如图2所示。试验结果显示本发明的提取方法能够有效提取质量好的萌发初期的羊草种子rna。最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12