本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种高活性s-氰醇裂解酶及其应用。
背景技术：
氰醇裂解酶是一种在化工生产中非常有用的工业用酶，其天然活性是催化氰醇的裂解并释放出氢氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反应，即hcn与醛酮的加成，得到具有光学活性的α-氰醇产物。间苯氧基苯甲醛(m-pbald)的s-型氰醇(scmb)是菊酯类农药的关键中间体。传统的化学法存在立体选择性不高的问题，而s氰醇裂解酶催化的scmb生产工艺具有选择性。
天然的s-氰醇裂解酶存在于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织中，丰度低，纯化难度大。1995年，wajant采用五步纯化法从木薯中分离得到了木薯氰醇裂解酶mehnl(plantsci.,1995,108,1)；white等人采用三步法从木薯叶中提取了mehnl，采用盐析和透析的方式得到了酶液，但是应用于化学催化的立体选择性不高(plantphysiol1998,116,1219)。来源于木薯(manihotesculenta)的氰醇裂解酶(mehnl)是一种s-氰醇裂解酶，已有文献报道将mehnl用于催化s-型手性氰醇的化学合成，ee值>99％，具有重要的应用价值，但是酶活仍然不够高，难以达到实际应用的要求。
因此，本领域技术人员致力于开发具有更高活性的s-氰醇裂解酶，以降低应用成本。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高活性s-氰醇裂解酶及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种突变的s-氰醇裂解酶，所述突变的s-氰醇裂解酶的第128位氨基酸残基发生突变，并且突变后的第128位氨基酸残基为n、l、v、g或y，其中，氨基酸残基编号采用seqidno.1所示的编号。
在另一优选例中，所述突变后的第128位氨基酸残基为n。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶的催化活性与野生型s-氰醇裂解酶的催化活性相比提高了30％以上；优选地提高了50％以上；更优选地提高了80％以上。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶的催化活性是野生型s-氰醇裂解酶的至少2倍；优选地至少3倍；更优选地至少5倍。
在另一优选例中，所述野生型s-氰醇裂解酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶的氨基选序列与seqidno.1相比具有至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶的突变位点还包括第103位氨基酸残基；优选地，第103位氨基酸残基由h突变为l、i、v、m或c。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶中突变位点的数量为1-3个，优选为2个。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶选自表2中的各具体突变体酶。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶包括表2中的各具体突变体酶的突变位点。
在另一优选例中，所述突变的s-氰醇裂解酶包括选自下组的突变位点：
本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本发明第一方面所述的突变的s-氰醇裂解酶。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第一方面所述的载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。
在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。
本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的突变的s-氰醇裂解酶的方法，包括步骤：
(i)在适合的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的突变的氰醇裂解酶；和
(ii)分离所述的突变的氰醇裂解酶。
在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为20℃-40℃；优选为25℃-37℃，如35℃。
本发明的第六方面，提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的突变的s-氰醇裂解酶。
本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的突变的s-氰醇裂解酶、本发明第六方面所述的酶制剂的用途，用于制备具有光学活性的s-氰醇产物。
在另一优选例中，所述用途还包括催化hcn与醛酮的加成反应。
本发明的第八方面，提供了一种制备s-氰醇的方法，包括步骤：
(1)将本发明第一方面所述的突变的s-氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成所述s-氰醇；
(2)分离并纯化所述s-氰醇产物。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应底物包括间苯氧基苯甲醛、hcn(或氰化钠/氰化钾)，和/或丙酮氰醇。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，催化反应的温度为0-20℃。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现，对野生型s-氰醇裂解酶的128位氨基酸残基进行突变能够显著提高突变酶的催化活性，并且可以显著提高在大肠杆菌中的表达，而且诱导表达时不需要降低温度，因而显著地降低了酶的制备成本；进一步地对第103位位点进行突变获得了催化活性进一步提高的s-氰醇裂解酶，实验结果表明，该类突变的s-氰醇裂解酶在催化间-苯氧基苯甲醛(m-pbald)和hcn的加成反应的催化活性与野生型相比提高了30％以上，在此基础上完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
氰醇裂解酶
氰醇裂解酶(hydroxynitrilelyase)主要来源于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织。主要包括：木薯氰醇裂解酶(mehnl)、漆树氰醇裂解酶(hbhnl)、杏仁氰醇裂解酶(pahnl)。
在本发明优选的实施方式中，所述氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶。
在本发明优选的实施方式中，优选地木薯氰醇裂解酶野生型序列如下：
野生型编码基因序列如下：
atggttactgcacacttcgttctgattcacaccatttgtcacggcgcatggatttggcacaaactgaaaccggccctggaacgtgctggccacaaagttactgcactggacatggcagccagtggcattgacccgcgtcaaattgaacagatcaactctttcgatgaatactctgaaccgctgctgactttcctggaaaaactgccgcaaggcgaaaaggttatcattgttggtgaaagctgtgcaggcctgaacattgctattgctgctgatcgttacgttgacaaaattgcagctggcgttttccacaactccctgctgccggacaccgttcacagcccgtcttacactgttgaaaagctgctggaatcgttcccggactggcgtgacacagaatatttcacgttcaccaacatcactggcgaaaccatcactaccatgaaactgggtttcgttctgctgcgtgaaaacctgttcaccaaatgcactgatggcgaatatgaactggcaaaaatggttatgcgcaagggctctctgttccaaaacgttctggctcagcgtccgaagttcactgaaaaaggctacggctctatcaagaaagtttatatttggaccgatcaagacaaaatattcctgccggacttccaacgctggcaaattgcaaactacaaaccggacaaggtttatcaggttcaaggcggcgatcacaagctgcagctgacaaaaactgaagaagtagctcacattctgcaagaagttgctgatgcatacgcttaa(seqidno.2)
突变的高活性氰醇裂解酶
本发明根据已报道的源于木薯的s-氰醇裂解酶mehnl开发了特异性的高通量筛选方法，并据此进行了定向进化。通过进一步筛选得到了具有更高酶活的氰醇裂解酶序列。通过大肠杆菌的高密度发酵大量制备了突变体酶，并对其催化性能和立体选择性进行了测定，发现这些突变体酶具有极高的应用价值，其中最高的突变体酶对m-pbald的比酶活达到野生型的10倍以上，同时ee值高达约99％，高于所有已报道的s氰醇裂解酶。酶催化反应如下式所示：
优选地，催化反应条件如下：
酶活测定：1u的酶活定义为，每分钟催化生成1μmol醚醛所需的酶量。
酶活测定参考selmar报道的方法(analyticalbiochemistry166(1987)，208-211)，间苯氧基苯甲氰醇10mm，甲醇20ul，20mm柠檬酸缓冲液(ph5.0)，酶液10ul。上述反应液于25度温育，在1-5min内测定od310nm的吸光度变化。做时间(min)与吸光度变化的曲线，实验组曲线斜率设为△k，对照组斜率为零。相同条件下，不加酶液的情况下，25℃条件，记录310nm波长吸光度的变化，作为对照组，对照组不应有吸光度的变化。
间氧基苯甲醛浓度标准曲线斜率为k。按照公式计算酶活：
载体和宿主细胞
本发明还提供了一种包含本发明的优化的氰醇裂解酶基因的载体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的一个优选例中，所述述载体具有在大肠杆菌(更佳地在大肠杆菌bl21(de3)菌株)中表达的能力。
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的优化的氰醇裂解酶基因序列，例如全人工合成或pcr法合成。一种优选的合成法为不对称pcr法。不对称pcr法是用不等量的一对引物，pcr扩增后产生大量的单链dna(ssdna)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在pcr反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链dna，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的pcr就会产生大量的单链dna。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组dna技术，表达或生产目的蛋白，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地大肠杆菌细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pet28。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
本发明还提供的重组载体，其包含本发明的经过优化的mehnldna序列。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。
在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。
本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。
本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的rna或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用cacl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。
工程菌的培养和目的蛋白发酵生产
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：
(a)就温度而言，氰醇裂解酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；
(b)就诱导期的ph值而言，诱导期ph控制在3-9；
(c)就溶氧(do)而言，do控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；
(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；
(e)就诱导期iptg浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常iptg浓度控制在0.1-1.5mm；
(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。
本发明的目的蛋白氰醇裂解酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：
1.阴离子交换层析：
阴离子交换层析介质包括(但不限于)：q-sepharose、deae-sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或ph的梯度洗脱。
2.疏水层析：
疏水层析介质包括(但不限于)：phenyl-sepharose、butyl-sepharose、octyle-sepharose。样品通过添加nacl、(nh4)2so4等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3.凝胶过滤层析
疏水层析介质包括(但不限于)：sephacryl、superdex、sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
4.亲和层析
亲和层析介质包括(但不限于)：hitraptmheparinhpcolumns。
5.膜过滤
超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。
制备酶制剂组合物
本发明还提供了一种酶制剂组合物，该酶制剂组合物中包含本发明的氰醇裂解酶。
本发明的酶制剂组合物还可以包含：柠檬酸、酒石酸、和/或硼酸。
s-氰醇的制备方法
本发明还提供了一种s-氰醇的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)将本发明的突变的氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成所述s-氰醇；
(2)分离并纯化所述s-氰醇产物。
在本发明优选地实施方式中，所述步骤(1)中，所述反应底物为间苯氧基苯甲醛、和丙酮氰醇(或，氰氢酸(或氰化钠/氰化钾)。
在本发明优选地实施方式中，所述步骤(1)中，催化反应的温度为0-20℃。
本发明的主要优点在于：
(1)根据本发明的突变的s氰醇裂解酶，其催化活性与野生型相比显著提高；
(2)根据本发明的突变的s氰醇裂解酶能够在工程化的大肠杆菌中大量表达，因而制备成本较低。
(3)根据本发明的突变的s氰醇裂解酶均能够在高温(约25-37℃)下表达，极大的降低了生产成本并简化了发酵工艺，而野生型及某些突变体在高温下表达无活性或活性极低。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：突变体文库的构建
以h103位点突变为例，突变体文库的构建步骤如下：
定点饱和突变h103位点，设计引物
h103-f：5’-gcagctggcgttttcnnnaactccctgctgccg-3’(seqidno.3)
h103-r：5’-cggcagcagggagttnnngaaaacgccagctgc-3’(seqidno.4)
以质粒pet21a-mehnl为模板，pcr扩增目的条带，程序如下：
对pcr产物进行dpni消化，37℃，2hr。反应完成转化感受态细胞e.colibl21(de3)，涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜，得到突变体文库。
采用上述一样的方法，对其它位点进行突变体文库构建。针对其它位点突变体文库构建所设计的引物序列如下表所示：
表1
其中，本申请序列中n代表a、t、g或c。
实施例2：高通量筛选
按照如下实验步骤进行筛选：
1.选克隆子接种96孔板1(每孔500μltb培养基)，30℃过夜培养；
2.转新96孔板2(每孔800μltb培养基,0.15mmiptg)，从96孔板1接种100μl至96孔板2，30℃过夜诱导培养。
3.收菌96孔板2，加bugbusterproteinextractionreagent(novagen)100μl，处理30min，离心取上清。
4.将酶液稀释至合理倍数。
5.制备酶标板，反应体系200μl，其中50mm柠檬酸缓冲液150μl(含15％甲醇)，底物scmb(0.05g/ml溶于甲醇)5μl，酶液5μl反应2min，立即加入10μl溶液i(100mmn-氯代琥珀酰亚胺)反应2min，再加入30μl溶液ii(65mm异烟酸，125mm巴比妥酸，溶于0.2mnaoh)，20min后在600nm波长处读数。
6.以野生型为参照系，选择600nm吸光度最强的最为阳性克隆子，分析其酶活和比酶活。
酶活测定：1u的酶活定义为，每分钟催化生成1μmol醚醛所需的酶量。
酶活测定参考selmar报道的方法(analyticalbiochemistry166(1987)，208-211)，间苯氧基苯甲氰醇10mm，甲醇20ul，20mm柠檬酸缓冲液(ph5.0)，酶液10ul。上述反应液于25度温育，在1-5min内测定od310nm的吸光度变化。做时间(min)与吸光度变化的曲线，实验组曲线斜率设为△k，对照组斜率为零。相同条件下，不加酶液的情况下，25℃条件，记录310nm波长吸光度的变化，作为对照组，对照组不应有吸光度的变化。
间氧基苯甲醛浓度标准曲线斜率为k。按照公式计算酶活：
蛋白浓度的测定：按照nanodrop2000的标准流程测定od280的吸收，进而得出裂解液中蛋白的浓度c(mg/ml)；
比酶活的计算：比酶活(u/mg)＝酶活/蛋白浓度。
实施例3：高密度发酵
合成编码突变体酶的脱氧核糖核酸序列，连接到pet28a载体(购自novagen公司)的ndei和xhoi位点，得到含有t7启动子的大肠杆菌质粒pet28-mehnl6。将质粒转化大肠杆菌bl21(de3)(购自invitrogene公司)，在kana抗性平板上得到相应的菌种，接种到lb培养基中，37℃过夜培养，用20％甘油保存菌种。
将菌种接种于装有200mllb培养基的1l摇瓶中，于37℃，180-220rpm培养10-16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3l上罐发酵培养基(m9)中(葡萄糖4g/l，磷酸氢二钠12.8g/l，磷酸二氢钾3g/l，氯化铵1g/l，硫酸钠0.5g/l，氯化钙0.0152g/l，六水氯化镁0.41g/l。)，在25-35℃，300-800rpm，空气流量2-6l/min的条件下培养。培养6-10h后，加iptg诱导10-12h,同时以5-20ml/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至od600达到80-100时，放罐，5000rpm离心收集菌体。菌体裂解后测定酶活。凝胶电泳检测与预期相符。
针对野生型及部分突变体的发酵制备
实验发现，在高温发酵(约25-37℃)条件下，工程菌表达的野生型(seqidno.1)和部分突变体(如突变体2)的活性极低，野生型基本没有活性。
因此，针对野生型和部分突变体(如突变体2)的发酵方法基本同上，不同在于：发酵过程中温度一直维持在低温(约12－16℃)水平。
实施例4：酶的纯化
可采用本领域常规的方法对发酵获得的酶进行纯化。也可以采用一下例举的方法对发酵获得的酶进行纯化，例如：
将含有野生型序列1l发酵液离心收菌体(4000rpm)，得到50g菌体；用20mm磷酸钠缓冲液(ph5.5)重悬菌体，比例为每g菌体4ml缓冲液。用高压均质机破碎(压力800-1000bar)，加入聚丙烯酰胺进行絮凝(1-2‰)，4000rpm离心收集上清液。将清液用超滤膜进行浓缩8倍(蛋白浓度93mg/ml)，酶的活力为198u/ml。
将含有突变体12序列1l发酵液离心收菌体(4000rpm)，得到50g菌体；用20mm柠檬酸钾缓冲液(ph5.5)重悬菌体，比例为每g菌体4ml缓冲液。用高压均质机破碎(压力800-1000bar)，加入聚丙烯酰胺进行絮凝(1-2‰)，4000rpm离心收集上清液。将清液用超滤膜进行浓缩8倍(蛋白浓度89mg/ml)，酶的活力为405u/ml。
将含有突变体23序列1l发酵液离心收菌体(4000rpm)，得到50g菌体；用20mm磷酸钾缓冲液(ph5.5)重悬菌体，比例为每g菌体4ml缓冲液。用高压均质机破碎(压力800-1000bar)，加入聚丙烯酰胺进行絮凝(1-2‰)，4000rpm离心收集上清液。将清液用超滤膜进行浓缩6倍(蛋白浓度56mg/ml)，酶的活力为680u/ml。
本发明对野生型的121位，122位，125位，127位，129位，147位，199位，216位分别进行了饱和突变，但是酶活较之野生型都没有提高，因而不再一一列出具体酶活结果，现将其他突变体酶的酶活检测结果列出，如下表2所示。
表2
注备：*代表比酶活在0-3.0u/mg之间；**代表比酶活在3.0-10.0u/mg之间；***代表比酶活在10.0-18.0u/mg之间。
实施例5：生物催化转化s-氰醇及检测方法
生物催化转化s-氰醇的方法为，100ml反应瓶中，加入20ml氰醇裂解酶，10ml醛m-pbald，20ml甲基叔丁基醚，3ghcn，15℃搅拌反应。
检测方法如下：
采用高效液相色谱(hplc)法监测反应：以水和乙腈(45:55)为流动相，色谱柱为ods-18反相柱，岛津lc-15c高效液相色谱，210nm下检测紫外吸收；反应体系用水和乙腈(45:55)进行稀释，离心并用尼龙膜过滤后进样检测。在本发明优选地反应体系中，hplc检测反应进程：反应1小时后，检测，17.3min为间苯氧基苯甲醛，17.5min为s-构型氰醇.
手性纯度采用agilent1260液相色谱进行分析，检测条件为：chiralpakad-h柱，正己烷:乙醇(0.1％dea)＝90:10，0.8ml/min，检测波长为220nm。经过比对本发明制得的s-构型的产物与目标物质标准品(购自江西科苑生物药业有限公司)一致。
本发明中涉及的典型的催化反应及检测结果例举如下：
1.野生型
100ml反应瓶中，加入20ml氰醇裂解酶(50mg/ml，野生型seqidno.1)，10ml醛m-pbald，20ml甲基叔丁基醚，3ghcn，15℃搅拌反应2小时，每30分钟取样检测反应进程,ee值95.9％。
2.突变体12
100ml反应瓶中，加入20ml氰醇裂解酶浓缩液(50mg/ml)，10ml醛m-pbald，20ml甲基叔丁基醚，3ghcn，15℃搅拌反应2小时，每30分钟取样检测反应进程,ee值98.6％。
3.突变体23
100ml反应瓶中，加入20ml氰醇裂解酶浓缩液(50mg/ml)，10ml醛m-pbald，20ml甲基叔丁基醚，3ghcn，15℃搅拌反应2小时，每30分钟取样检测反应进程,ee值99.1％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120>高活性s-氰醇裂解酶及其应用
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