本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种生物工程培育眼全层角膜的方法。
背景技术：
角膜疾病是目前世界上发病率高，由于治疗手段有限，因此是致盲的主要原因之一。目前治疗角膜疾病的主要方法是全角膜或板层角膜移植。由于受到角膜合格供体来源缺乏的限制，绝大部分因角膜疾病失明或部分丧失视力的患者得不到有效的治疗。
近十年来，生物组织工程技术的发展为体外构建生物角膜提供了技术可能，生物反应器更好的模拟了人体内的生存环境，利用种子细胞和支架材料的方式可以体外制备组织工程角膜；同时，很多技术在动物异种角膜脱细胞处理后可以给临床提供其他的选择。
目前国内形成产业化的就是角膜基质层的生产，如猪眼角膜基质层脱细胞处理。但是，这只是角膜中部的一个层，也是生物组织工程技术最成熟的部分。大部分病人需要角膜内皮层或角膜前深部板层(角膜表皮层和角膜基质层)，因此全角膜或角膜内皮层，角膜前深部板层(角膜表皮层和角膜基质层)的生物工程培养是治疗因角膜疾患失明患者的重要一环，特别是角膜内皮层的培养，构建。
其他组织工程技术以异类或异体细胞为种子细胞，在支架上培植全层生物角膜，这不仅提高了感染转染病的风险，也存在潜在的组织免疫排斥反应的危险，导致手术失败。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种眼角膜各层以及全眼角膜的制备方法以及制得的各层和全眼角膜，为角膜的治疗提供良好的基础。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种胶原蛋白培养基的制备方法，胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后加入edc溶液和nhs溶液，调节ph为5.4-5.6后，固化，然后采用10±2mmpbs洗脱得到；
其中，edc、nhs和胶原蛋白的3-胺基团的摩尔量比例为3：2.8-3.5：2.8-3.5。
本发明提供的胶原蛋白培养基的制备方法，制得固体胶原蛋白培养基，为眼角膜表皮层和全角膜的培养提供良好的基础。
其中，edc、nhs和胶原蛋白的3-胺基团的摩尔量比例可以为3：2.8：2.8、3：3：3、3：3.5：3.5、3：3.2：3.5等等。
本发明中，edc为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的缩写；nhs为n-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
进一步地，所述胶原蛋白溶液的浓度为13.7w/w％±0.5w/w％，所述缓冲液为mes缓冲液。
优选地，胶原蛋白溶液为无泡的人重组iii型胶原蛋白溶液。
优选地，所述mes缓冲液的浓度为0.625±0.05m。
进一步地，所述mes缓冲液与所述胶原蛋白溶液的体积为1:0.8-1.5。如两者的体积比可以为1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5等等。
胶原蛋白溶液与mes缓冲液在冰水环境下进行充分混合，如可以在注射器混合系统混合。
优选地，所述edc溶液和nhs溶液为edc和nhs的混合液，所述混合液中，edc的浓度为200±5mg/ml，nhs的浓度为120±5mg/ml，所述混合液的溶剂为0.625±0.05m的mes缓冲液。
适当浓度的溶液，更利于各成分之间的成分混合均一，并且，利于各成分的相互交联反应，为后续的固化提供良好的基础。
进一步地，调节ph采用碱液调节。
进一步地，调节ph采用2n氢氧化钠溶液调节。
进一步地，所述固化前还包括：混合液放入模具，然后置于95％-100％湿度的室温下放置15-18h。其中，室温是指15-25℃。
通过放入模具，然后在一定湿度的条件下放置，使得后续混合液固化时表面不干燥。
进一步地，所述固化的温度为37±2℃。
进一步地，固化的时间为4.5-5.5h。
固化在培养箱中进行即可。
固化后，浸泡入10±2mmpbs，以利于脱模，得到水凝胶样培养基，然后放入10±2mmpbs洗脱，每5-10h更换一次液体，直到使用。
进一步地，所述洗脱后得到的水凝胶样培养基浸入含有青霉素和链霉素以及1％±0.1％氯仿的10±1mmpbs中，2-10℃保存。
进一步地，本发明还提供了上述的制备方法制得的胶原蛋白培养基。
进一步地，所述胶原蛋白培养基的表面铺上羊膜，然后在所述羊膜的表面涂覆n-异丙基聚合物。得到的胶原蛋白培养基即可使用。
本发明还提供了一种眼角膜表皮层的培养方法，包括以下步骤：
口腔粘膜组织制得口腔粘膜上皮细胞的单细胞悬浮液；
所述单细胞悬浮液接入上述的胶原蛋白培养基上，并在接种的单细胞的外围放入t3t饲养细胞和丝裂霉素c，用以分泌生长激素和细胞因子；
培养得到角膜上皮层。
本发明提供的眼角膜表皮层的培养方法，是采用口腔黏膜上皮细胞经诱导分化制成。
进一步地，所述口腔粘膜组织采用分散酶ii处理，去除上皮层后，收集得到上皮细胞，用消化液处理，得到所述口腔粘膜上皮细胞的单细胞悬浮液。
进一步地，所述分散酶ii的浓度为2.8-3.5mg/ml，采用所述分散酶ii于37±2℃下处理50-70min。
如分散酶ii的浓度为2.8mg/ml、3.0mg/ml、3.2mg/ml、3.5mg/ml等等。
消化液处理的目的是将上皮细胞进行分解，以得到单细胞的上皮细胞。
进一步地，所述消化液为质量浓度为0.2％-0.3％的胰蛋白酶与质量浓度为0.005％-0.015％的edta的混合溶液，所述消化液处理的时间为12-18min。
优选地，所述培养的温度为37±2℃，所述培养的时间为12-15天。
进一步地，温度降至20℃，30分钟后即可以取下给患者做角膜上皮层移植或和与间质层胶合，继续培养。
温度感应的特性使得n-异丙基聚合物在30℃以上时，可逆的改变其水合性，产生不同的特性。在30℃以上时，可以化学的固定在细胞培养表面的羊膜，促进细胞粘附和正常生长。培养温度降低到30℃以下会使该表面水合并迅速膨胀，促使贴壁细胞完全分离，而不需要使用典型的蛋白水解酶或用胰蛋白酶edta处理。
本发明还提供了一种眼角膜间质层的培养方法，包括以下步骤：
将大腿皮肤的真皮层，制得成纤维细胞单细胞；
所述纤维细胞单细胞种植在不同的透明丝素蛋白膜，所述透明丝素蛋白酶均浸泡在含青霉素和链霉素的高糖dmem培养液中，进行二维培养；
不同的透明丝素蛋白膜重叠在一起，进行三维培养，得到角膜间质层。
本发明提供的眼角膜间质层的培养方法，是采用大腿皮肤的真皮层制得纤维细胞单细胞，再进行二维和三维培养，得到角膜间质层。
进一步地，所述大腿皮肤为大腿内侧皮肤。
优选地，所述大腿皮肤先进行预处理，所述预处理为清洗后去除血污并剪除结缔组织。
进一步地，所述预处理后，进行消化处理，清洗后，去除表皮，将真皮切碎，胶原酶处理，孵育，经吹打后过滤，得到成纤维细胞单细胞。
进一步地，所述消化处理为：皮肤浸泡在含有青霉素、链霉素和消化液的混合液，其中，青霉素的浓度为18-25u/ml，链霉素的浓度为18-25μg/ml，所述消化液中含有质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.01％的edta，所述消化液的体积比占所述混合液的8％-15％，保持温度2-10℃，放置8-14h。
进一步地，所述清洗为：用含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲生理盐水反复冲洗3-5次。
进一步地，所述胶原酶处理为：含有青霉素、链霉素和胶原酶的混合液在37℃下孵育4-8h，其中，所述胶原酶的浓度为0.8-1.5mg/ml。
进一步地，加入pbs混合，反复吹打，过滤，离心后重悬于含10％胎牛血清的dmem培养液得到成纤维细胞单细胞悬浮液。
进一步地，所述成纤维细胞单细胞悬浮液按3500-4500个/cm2接种于含青霉素和链霉素的高糖dmem培养液中，在37±2℃和5％±0.2％co2下培养细胞，24-48h后第一次更换培养液，以后每2-3天更换一次。
进一步地，所述纤维细胞单细胞接种在透明丝素蛋白膜的密度为4×104-6×104cells/cm2，培养条件为：在37±2℃和5％±0.2％co2，培养的时间优选为40-55h。
进一步地，所述三维培养是将5-10个透明丝素蛋白膜重叠在一起。如可以为5个、6个、7个、8个、9个或10个透明丝素蛋白膜重叠在一起。
进一步地，培养条件为：在37±2℃和5％±0.2％co2。
进一步地，所述三维培养所用的培养液为含青霉素和链霉素的高糖dmem培养液，每2-3天更换一次培养液。
进一步地，所述三维培养的时间为55-70天。如三维培养的时间可以为55天、58天、60天、62天、65天、68天、70天等等。
本发明还提供了一种角膜内皮细胞的培养方法，包括以下步骤：
将眼角膜清洗，去除血污后，剥离descemet膜和内皮层；
所述内皮层进一步处理，得到单个的角膜内皮层细胞；
所述角膜内皮层细胞培养，得到更多的角膜内皮细胞。
本发明提供的一种角膜内皮细胞的培养方法，是以眼角膜为原料，经分离和培养得到角膜内皮细胞，得到的角膜内皮细胞可进一步传代或扩大培养，得到大量的角膜内皮细胞。
进一步地，所述眼角膜离体后十天内使用。
进一步地，所述清洗采用含有100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的磷酸盐缓冲生理盐水，清洗2-5次，每次10-18min。
进一步地，剥离的内皮层采用胶原酶处理，优选采用浓度为0.8-1.51mg/ml的胶原酶处理，得到聚集成簇的内皮细胞，然后再用trypleexpress对内皮细胞簇进行处理，得到更小的团块或单个细胞，分离的内皮细胞在表面覆盖fnc混合物的mem新培养基进行原代培养，得到二代细胞；
所述fnc混合物为纤连蛋白和胶原蛋白的混合液，其中含有纤连蛋白10μg/ml和胶原蛋白35μg/ml，溶剂为胎牛血清；
所述mem新培养基为：在mem培养基基础上，还含有以下成分：胎牛血清8％±0.2％，神经生长因子20±1ng/ml，表皮细胞生长因子5±0.2ng/ml，抗坏血酸20±1mg/ml，氯化钙200±2mg/l，脑垂体提取物100±2μg/ml，庆大霉素50±2μg/ml，青霉素100±2u/ml，链霉素100±2μg/ml，硫酸软骨素0.08w/w％±0.01w/w％。
进一步地，fnc混合物在所述mem新培养基表面的添加量为0.15-0.25ml/cm2。
进一步地，所述二代细胞经胰酶消化后进行传代培养。
优选地，所述传代培养的密度为4000-6000个细胞/cm2。
本发明还提供了一种全角膜的制备方法，包括以下步骤：将上述的培养方法得到的眼角膜间质层置于上述的胶原蛋白培养基上；
上述的培养方法得到的眼角膜表皮层贴合在所述眼角膜间质层表面，所述角膜内皮细胞注入所述眼角膜间质层与虹膜之间形成单层的角膜内皮细胞层，得到所述全角膜。
为了防止排异反应，本发明中的眼角膜间质层和眼角膜表皮层的原料均是取自自体，角膜内皮细胞由捐献者提供，然后经培养可获得大量的角膜内皮细胞，这样，不同患者的眼角膜间质层和眼角膜表皮层之间注入角膜内皮细胞即可得到全角膜，因此，这就有效避免了排异反应以及捐赠者数量的有限的问题。
进一步地，所述眼角膜间质层与所述眼角膜表皮层均来自自体细胞.
进一步地，所述眼角膜表皮层贴合在所述间质层表面于37±2℃和5％co2下培养3-5h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)现有的角膜技术是先做间质层支架，然后上皮层内皮层间质层一块培养；本发明分别提供了角膜各层的培养方法，得到角膜的各层，角膜各层分别培养的优点还在于当病人不需要全角膜移植时，只需要培养患者需要的角膜层即可。
(2)排斥反应导致手术失败的发生率在全角膜移植术术后两年大约为13％，板层角膜移植术术后两年为7.5％，本发明角膜表皮层和间质层的种子细胞是自体细胞，非异种或异体细胞，在前深部板层角膜移植术的情况下，避免了组织排斥反应。
(3)本发明中提供的全角膜的制备方法，角膜表皮层和间质层的种子细胞是自体细胞，并且角膜内皮细胞来自捐赠者，可通过培养得到大量的内皮细胞，避免了捐赠者来源的有限性。
(4)本发明以胶原蛋白培养基作为表皮层和间质层的胶合介质，可以促进人生物工程角膜的神经内生长。
(5)本发明提供的全角膜或部分角膜，均具有良好的光学特性，手术后，患者全部恢复视力；并且角膜具有稳定的生化特性，无晚期角膜溶解，良好的生物相容性，无排斥反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1提供的本发明提供的方法培养的角膜表皮层与正常角膜表皮层的电镜观察图；
图2为本发明实施例2提供的本发明提供的方法培养的角膜间质层的平面图；
图3为本发明实施例2提供的本发明提供的方法培养的角膜间质层的横断面图；
图4为本发明实施例2提供的本发明提供的方法培养的角膜间质层与其他产品进行的透明度比较的曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
胶原蛋白培养基：将0.3ml的13.7％w/w无泡人重组iii型胶原蛋白溶液与0.3mlmes缓冲液在注射器混合系统在冰水泡下充分搅拌；搅拌后，注入57μl的edc/nhs溶液，该溶液中，edc的浓度为200±5mg/ml，nhs的浓度为120±5mg/ml，该溶液的溶剂为0.625±0.05m的mes缓冲液。
使得摩尔当量比edc：nhs(胶原的3-胺基团的数量)是3：3：3。用2n氢氧化钠将ph值调节至5.5，然后，将混合物注入弯曲的塑料模具中(厚度500mm，直径12mm)。模具置于100％湿度的室温下16小时，然后转移到培养箱中在37±2℃下后固化5小时。固化后，将模具浸入10±1mmpbs中30分钟左右，然后小心地从模具中取出水凝胶。
将得到的弯曲的水凝胶在pbs中洗脱，每8h更换一次。然后将水凝胶浸入含有双抗及1％氯仿的pbs中，4℃条件保存。
在胶原蛋白培养基的表面铺上羊膜，然后在羊膜的表面涂覆n-异丙基聚合物，即可用于细胞的培养应用。
实施例1
眼角膜表皮层培养
患者利多卡因局部麻醉，患者口腔局部聚维酮碘消毒，从内部颊粘膜上皮取患者口腔粘膜组织约3×3mm大小。
用5ml分散酶ii(3mg/ml，罗氏)在37℃下处理口腔粘膜组织1小时左右去除所有上皮层后，收集到口腔粘膜上皮细胞，然后置于消化液中15分钟，以形成单细胞悬液。
分离得到的细胞放入胶原蛋白培养基，培养基表面为羊膜，羊膜上涂覆n-异丙基聚合物。
同时在外围放入t3t饲养细胞和丝裂霉素c，用以分泌生长激素和细胞因子。
37℃下，培养2周左右时间，即可得到肉眼可见的具有活性的3-5层的表皮细胞层，经苏木精-伊红染色，显微镜观察，培养得到的角膜上皮层的光学特性和结构与正常的角膜上皮层无区别。结果如图1所示，图1中，a为本发明培养得到的角膜表皮层，b为正常角膜表皮层。
温度降至20℃，30分钟后即可以取下给患者做角膜上皮层移植或和与间质层胶合，继续培养。
实施例2
角膜间质层培养
1.自体皮肤成纤维细胞分离
无菌条件下，取下肢大腿内侧部分皮肤组织3×2mm大小，置于含有100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)中清洗3-5次，去除血污并剪除结缔组织。
皮肤浸泡在10ml含有2ml双抗剂(100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)和1ml消化液的混合液，保持温度4℃，放置过夜。
次日继续使用含有青霉素和链霉素(双抗)的磷酸盐缓冲生理盐水反复冲洗3-5次，然后分离真皮和表皮，使用新的无菌手术刀将真皮切成很小的碎片，将碎片转移到含有0.5ml双抗剂和5ml胶原酶(1mg/ml)的50ml离心管中。
在37℃下孵育4-8小时，适当摇动。
加入2mlpbs，反复吹打，然后通过70μm细胞过滤器，获得成纤维细胞单细胞悬液。
单细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清液，重悬于2ml含10％胎牛血清的dmem培养液。
细胞计数，并以4000/cm2接种于含双抗及高糖的dmem培养液的(10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)培养皿中，在37℃和5％±0.2％co2下培养细胞，24-48小时后第一次培养基更换，然后每2-3天更换一次。
2.单层二维成纤维细胞培养
得到的人成纤维细胞，在37℃和5％±0.2％co2下种植在单层透明丝素蛋白膜(12×12mm)上，密度为5×104cells/cm2，培养在含双抗及高糖的dmem培养液中(10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)。同时做类似培养植片7个。
3.三维角膜间质层培养
48小时后，把7个种有人成纤维细胞的丝素蛋白膜植片，重叠在一起，做三维培养。
更新培养液，保持37℃和5％±0.2％co2，然后每3天换1次含双抗及高糖的dmem培养液(10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。培养大约60天，即可得到透明的角膜间质层。
得到的角膜间质层的平面图如图2所示。角膜间质层的横断面经苏木精-伊红染色后如图3所示。
得到的角膜间质层与其他产品进行透明度比较，结果如图4所示。
实施例3
角膜内皮细胞的培养
角膜内皮细胞的培养种子细胞是由其他捐赠人(年龄越小越好)的眼角膜获得，在捐赠后10天内使用。
角膜置于含有100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的磷酸盐缓冲生理盐水中清洗2-5次，每次10-18min，去除血污后，借助于真空抽吸器小心的剥离后弹力膜(descemet膜)和内皮层，剥离的后弹力膜和内皮层会自动沿内皮层卷起。
使用胶原酶(1mg/ml)处理收集到的后弹力膜和内皮层，2小时后，可看到角膜内皮层部分分离。角膜内皮细胞的完全分离，需要在胶原酶处理大约6小时(根据捐赠者不同，时间区别很大)后，内皮细胞会聚集成簇。
使用
中度离心(800g，5分钟)分离后的内皮细胞当天在fnc覆盖(0.2mlnfc/cm2)的mem新培养基做原代培养。fnc混合物为纤连蛋白和胶原蛋白的混合液，其中含有纤连蛋白10μg/ml和胶原蛋白35μg/ml，溶剂为胎牛血清。mem新培养基为：在mem培养基基础上，还含有以下成分：胎牛血清8％，神经生长因子20ng/ml，表皮细胞生长因子5ng/ml，抗坏血酸20mg/ml，氯化钙200mg/l，脑垂体提取物100μg/ml，庆大霉素50μg/ml，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml，硫酸软骨素0.08w/w％。
2周后，可以看到第二代培养细胞。融合细胞用
实施例4
全角膜等效物的构建
保持在37℃和5％±0.2％co2下，将培养好的间质层放入胶原蛋白培养基，培养基表面为羊膜，羊膜上涂覆n-异丙基聚合物，将生物组织工程培养的眼角膜表皮层贴合在间质层表面，4小时就可以取出使用。
培养的角膜内皮细胞在手术过程中注入间质层和虹膜之间即可形成单层的角膜内皮细胞层。
本发明以胶原蛋白培养基作为表皮层和间质层的胶合介质，可以促进人生物工程角膜的神经内生长。
经大量实验验证，不同的角膜层和制得的全角膜均成功治疗眼角膜相应的疾病。本发明提供的全角膜或部分角膜，均具有良好的光学特性，手术后，患者全部恢复视力；并且角膜具有稳定的生化特性，无晚期角膜溶解，良好的生物相容性，无排斥反应。
本发明实施例中，所用的消化液为质量浓度为0.2％-0.3％的胰蛋白酶与质量浓度为0.005％-0.015％的edta的混合溶液。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。