本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法。
背景技术：
人造血干祖细胞(hspc)是所有成体干细胞中研究最为透彻，应用最广泛的干细胞。人造血干祖细胞能不断进行自我更新，和分化成不同的血细胞和免疫细胞，成人骨髓每天可产生大约1万亿的细胞。同种异体的人造血干祖细胞移植是目前治疗大量恶性血液病的唯一治疗方案。人造血干祖细胞的获得可以从健康人粒细胞-集落刺激因子动员的外周血中提取，但数量有限，如何大量获得人造血干祖细胞一直限制着它的应用。体外扩增培养是一个增加细胞数量的办法，但人造血干祖细胞在体外培养时，很容易进行分化，无法保持其作为干细胞的干性，而一旦分化便失去了移植的价值，所以如何在体外培养时，即可以维持人造血干祖细胞的干性，同时又能够使其进行扩增，是两个研究的方向。
近年来，利用小分子化合物来控制细胞命运决定成为了研究的热点。小分子化合物作用优势明显，进出细胞更为便捷，浓度和组合方便可控，无免疫原性，也更为经济。2010年，科学家发现苯酚受体拮抗剂(sr1)能够促进人造血干祖细胞的体外扩增；随后的研究进一步揭示rna连接蛋白(msi2)削弱苯酚受体的信号通路促进人造血干祖细胞体外扩增的机制；另一方面，sr1诱导扩增的人造血干祖细胞也进入了阶段ⅰ/ⅱ的临床测试。2014年，研究者们又发现嘧啶吲哚衍生物(um171)能够独立于苯酚受体的信号通路，促进人造血干祖细胞的体外增殖。chir99021能通过激活wnt信号通路在体外刺激人造血干祖细胞的扩增，但同时也激活mtor信号，研究者就通过组合chir99021和mtor抑制剂rapamycin从而达到小分子化合物作用互补的效果，实现人造血干祖细胞体外的有效增殖。pge2是一种脂质信号分子，能调节造血系统的功能，也有利于人造血干祖细胞的体外增殖与移植归巢。此外，重编程基因oct4的激活剂，细胞周期蛋白p18的抑制剂，p38的抑制剂，以及能够模拟细胞低氧环境的小分子化合物，皆能促进人造血干祖细胞的体外扩增。综上所述，大量筛选实验已经找到具有增殖人造血干能力的单个小分子，小分子组合的尝试严重缺乏。
事实证明，利用小分子组合来控制细胞命运，潜力巨大。北大邓宏魁团队利用小分子化合物组合替代了所有的外援基因表达，并成功将小鼠成纤维细胞重编成为多能干细胞。这一突破性的进展打开了细胞命运控制的黑匣子。利用极为相似的小分子化合物组合，人们先后实现了成纤维向神经和心肌、小肠上皮向内胚层的转分化。有趣的是，类似的小分子组合，能同时诱导生成来自三个胚层的不同祖细胞，更能建立小鼠肝脏前体细胞的功能性培养条件。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法，本发明通过研究筛选获得了一种小分子组合，加入培养基中用于培养人造血干祖细胞，能够很好地维持人造血干祖细胞干性。
在系统分析了186种小分子对造血干祖细胞体外维持其干性的基础上，发现了其中有些小分子具有较好的效果，将这些有效的小分子称为维持小分子。
一种体外维持造血干祖细胞干性的培养基，包含基础培养基和维持小分子组合，所述维持小分子组合为cfo，其中c为chir99021、f为forskolin、o为oac1。
所述维持小分子组合中各小分子的使用浓度为：
c5～20μm，
f10～40μm，
o2.5～10μm。
所述维持小分子组合中各小分子的使用浓度为：
c10μm，
f20μm，
o5μm。
诱导小分子组合中，各组分的浓度是在参考各种文献报道的基础上，再经实验验证得到的较为合适的浓度。
所述基础培养基包括imdm和血清替代物。
本发明还提供了一种非疾病治疗为目的的体外维持造血干祖细胞的方法，使用所述的培养基对造血干祖细胞进行体外培养。
所述造血干祖细胞来源于人或其他哺乳动物。
所述造血干祖细胞来源于健康人粒细胞-集落刺激因子动员的外周血。
体外培养时间为6～8天。
本发明维持培养基能够在体外维持造血干祖细胞的干性，体外培养后的造血干祖细胞具有未培养的造血干祖细胞特异性分子标签，并且可通过体外克隆形成实验和流式分析以及小鼠体内移植实验来验证培养后造血干祖细胞的干性，单细胞转录组分析也揭露了小分子化合物组合维持造血干祖细胞的分子机制。后续，在体外维持造血干祖细胞的干性的同时，可以研究如何使造血干祖细胞获得增殖的方法，从而能够在体外获得大量造血干祖细胞，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。
附图说明
图1为维持小分子化合物组合筛选的实验设计流程图。
图2为186个单独小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养7天后，获得的人造血干祖细胞的actb和cd34相对表达量的散点图。
图3为小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养后的细胞形态图，其中图a为对照，图b为只加小分子c，图c为只加小分子f，图d为只加小分子o，图f为加小分子组合cfo。
图4为小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养后的细胞数目统计图。
图5为3个小分子化合物cfo与人造血干祖细胞体外培养获得的人造血干祖细胞cd34相对表达量统计结果图。
图6为3个小分子化合物的最佳浓度调整结果图。
图7为3个小分子化合物cfo单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合与人造血干祖细胞体外培养7天后的体外克隆形成统计图。
图8为3个小分子化合物cfo单独处理，两两组合，以及3个小分子化合物组合与人造血干祖细胞体外培养7天后的表面蛋白cd34表达的流式分析图。
图9为3个小分子化合物cfo组合与人造血干祖细胞体外培养7天后cd34表达的细胞比例比较结果图。
图10为小分子化合物组合cfo与人造血干祖细胞体外培养7天后，随机挑取的96个单个人造血干祖细胞的造血相关基因表达热图。
图11为小分子化合物组合cfo，以及造血生长因子(hgf)与人造血干祖细胞体外培养7天后移植入免疫缺陷小鼠(nsg)后，流式分析检测人血细胞的重构比例结果图。
图12为小分子化合物组合cfo，以及造血生长因子(hgf)与人造血干祖细胞体外培养7天后移植入免疫缺陷小鼠(nsg)后，流式分析检测人血细胞的重构比例统计结果图。
图13为未培养的人造血干祖细胞，小分子化合物组合cfo，以及造血生长因子(hgf)与人造血干祖细胞体外培养7天后的单细胞t-sne分析图，其中a为未培养组，b为对照组，c为cfo组，d为hgf组，e为cfo+hgf组。
图14为未培养的人造血干祖细胞，小分子化合物组合cfo，以及造血生长因子(hgf)与人造血干祖细胞体外培养7天后的各个亚群的相关造血基因表达。
具体实施方式
基础培养基：imdm(iscove'smodifieddulbecco'smedium)、20％血清替代物(bit9500serumsubstitute，购自stemcelltechnologies公司，货号#09500，为添加有bsa(牛血清白蛋白)、胰岛素(insulin)和转铁蛋白(transferrin(bit)的imdm))、100μg/ml链霉素和100u/ml青霉素。
维持培养基：为在基础培养基的基础上添加186个小分子化合物，具体索引见表1，2个造血生长因子为100ng/ml干细胞因子(scf)和50ng/ml血小板生成素(tpo)。
实施例1
人造血干祖细胞的采样及cd34+分选步骤如下，cd34+分选使用试剂盒easyseptmhumancd34positiveselectionkit(stemcelltechnologies公司，货号#18056)：
1)从浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植科室获得人g-csf(粒细胞-集落刺激因子)动员的外周血置于流式管中；
2)低速离心，吸弃上清，悬浮于recommendedmedium(dpbs+2％fbs+1mmedta)中；
3)加入cd34+selectioncocktail100μl，混合，室温孵育15min；
4)加入磁珠(magneticnanoparticles)后用枪吹打混匀5次，加入50μl，混合，室温孵育10min；
5)加入recommendedmedium总体积至2.5ml，混合，轻缓枪吹打混匀3次，放入磁极，孵育5min；
6)一次性颠倒磁极和流式管，废弃液体，停留2-3s；
7)把流式管从磁极中拿出，加入2.5mlrecommendedmedium混合，轻缓枪吹打混匀3次，放入磁极5min；
8)重复上述步骤6)和7)3遍(共5次分离)，拿出流式管，加入培养基计数，制备获得人造血干祖细胞，以适当密度进行后续实验或冻存处理。
实施例2
人造血干祖细胞与186个小分子化合物相互作用的体外培养步骤：为了探索小分子化合物在维持人造血干祖细胞命运上的潜在作用，对与造血相关的186种小分子化合物进行了系统的分析和筛选。
实验流程如图1所示，调整人造血干祖细胞密度为100000cells/ml，即2000cells/20μl，接种细胞于u型96孔版中，每孔细胞中再加入20μl小分子化合物，96孔板于37℃培养箱中培养7天，隔天拍打使之混匀。186个小分子化合物索引及其浓度见表1，大部分小分子浓度以μm为单位，个别小分子的浓度以其他单位表示的单独再表格中表示出。图2为186个单独小分子化合物与人造血干祖细胞体外培养7天后，获得的人造血干祖细胞的actb和cd34相对表达量的散点图。
表1186个小分子化合物及其浓度
实施例3
通过实施例2中的初筛，找到186个小分子化合物作用后的人造血干祖细胞actb和cd34表达量较高的3个小分子化合物c(chir99021)，f(forskolin)，o(oac1)。一步法q-pcr检测培养后人造血干祖细胞相关基因表达量步骤如下：小分子化合物作用的人造血干祖细胞体外培养7天后，显微镜下吸弃上清，加入10μlpcrmix(体系及pcr步骤如下)，并转移至八连管中，迅速置于-80℃，10min后短暂离心30s，进行pcr得到预扩增cdna用于后续基因检测，基因检测时，针对每个特定基因设计一对检测用的引物。逆转录-预扩增一步法q-pcr中，模板为细胞冻融裂解后释放的序列，体积忽略不计；引物池为加入所有引物的库，最终每对引物浓度均为0.1μm。
pcr反应体系：
pcr步骤：50℃60min；95℃3min；95℃15s，60℃15min，10个循环；10℃保温。
q-pcr反应体系：
q-pcr步骤：95℃10min；95℃15s，60℃60s，35个循环。
人造血干祖细胞在小分子化合物cfo(c：10μm、f：20μm、o：5μm)处理后的细胞形态及细胞数目如图3和图4所示。cd34的相对表达量结果如图5和图6所示，3个小分子化合物组合的cd34的表达量高于2个小分子化合物组合和单个小分子化合物的作用，是对照细胞cd34表达量的5.44倍。另外我们挑取了小分子化合物cfo处理后的96个单人造血干祖细胞，利用上述的一步法pcr检测了相关的造血基因，得到的表达热图如图10所示。
实施例4
人造血干祖细胞克隆形成实验(cfu)是体外检测人造血干祖细胞多能性分化的功能实验。具体实验步骤如下：充分混匀cfu培养基(methoculttmh4034optimum，购自stemcelltechnologies公司，货号#h4034)，将200μl1000个培养后的人造血干祖细胞种植于2ml的cfu培养基中，加入1％青霉素/链霉素(p/s)，充分混匀，将培养基种植于6孔板或者35mmdish中，摇晃板子，铺平培养基，并加入一孔无菌水保持湿度，标记好后，置于37℃，5％co2培养箱中培养14天，后续通过检测单核系、粒系、红系及混合克隆形成的数目及比例来衡量人造血干祖细胞的造血能力。结果如图7所示，3个小分子化合物组合所形成的克隆数高于2个小分子化合物组合和单个小分子化合物的作用，是对照细胞克隆数的8.56倍。
实施例5
流式分析检测小分子化合物与人造血干祖细胞处理后表面蛋白的变化。具体实验步骤如下：收集培养后的人造血干祖细胞，调整细胞密度为106cells/test，加入相应抗体，4℃避光孵育30min，然后加入3mlpbs，300g离心5min，吸弃上清，加入500μlpbs，混匀，过滤，流式分析。结果如图8和图9所示，3个小分子化合物组合作用后表面蛋白cd34的表达量高于2个小分子化合物组合和单个小分子化合物的作用，是对照细胞表面蛋白cd34表达量的8.1倍。
实施例6
小鼠移植实验是目前体内鉴定人造血干祖细胞功能的金标准。具体实验步骤如下：提前2天，小鼠的饮用水中加入复方磺胺甲恶唑进行清肠处理，并食用高蛋白饲料。100μl1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，将小分子化合物或人造血生长因子(scf+tpo)处理后的人造血干祖细胞通过胫骨注射的方式移植入nsg小鼠体内，4周和8周后分别收集小鼠外周及骨髓样本进行流式分析检测。结果如图11和图12所示，对照组没有实现人血细胞的重构，而小分子化合物组合cfo处理的人造血干祖细胞在小鼠体内实现了5％左右的重构比例；与单独造血生长因子处理组相比，小分子化合物cfo与造血生长因子共同处理后的人造血干祖细胞在小鼠体内实现了多达50％左右的重构比例。
实施例7
人造血干祖细胞存在很大的异质性，以往的基于表面蛋白的流式分析已不能有效鉴定细胞亚群的变化。目前日益发展的单细胞转录组序列分析正成为一个强大的工具来探索细胞的异质性及重构人造血干祖细胞的等级分布。microwell-seq单细胞测序实验步骤如下：利用微米级微孔板矩阵进行高通量单细胞捕获，利用具备单细胞索引和单分子索引的磁珠大规模标记单细胞，再进行大量单细胞转录组的混合建库，最后利用10×或者novaseq平台进行高通量测序。利用这一平台对原代未培养的人造血干祖细胞，体外小分子化合物组合及造血生长因子处理培养所得的人造血干祖细胞进行高通量的单细胞转录组分析。绘制人造血干祖细胞在不同条件下再生与分化的图谱，比较亚群变化，以及细胞状态。结果如图13所示，未培养的人造血干祖细胞中包含了11个亚群细胞，对照组和小分子化合物组合cfo处理后的人造血干祖细胞分别含有3个和4个亚群，造血生长因子处理及小分子化合物与造血生长因子组合处理的人造血干祖细胞中各自都含有8个亚群。随后在这34个细胞亚群中随机抽取100个细胞3次进行相关造血基因表达分析如图14，发现小分子化合物组合cfo处理后的人造血干祖细胞展现了更强造血干性相关基因的转录水平，如kit，gata2和hoxa9等。另外小分子化合物组合cfo处理后的人造血干祖细胞上调了akt和creb1的表达，激活了akt-camp信号通路以在体外维持人造血干祖细胞的干性。