本发明涉及细胞领域，具体涉及通过基因工程手段，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别肿瘤表面相关抗原并表达趋化因子受体cxcr4，从而在特定部位富集并对细胞进行杀伤的特异性淋巴细胞的制备方法及其在恶性肿瘤治疗中的用途。
背景技术：
：免疫治疗被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。其中，免疫检查点抑制剂(如ctla-4、pd-1等)在多种肿瘤临床试验中显示出了明显优于现有疗法的效果，被批准用于非小细胞肺癌、膀胱癌等恶性肿瘤的治疗。不同于ctla-4和pd-1抗体等通过重新激活机体免疫反应发挥抗肿瘤作用，嵌合抗原受体修饰的免疫细胞疗法不依赖于机体免疫状态，通过基因工程技术，将嵌合抗原受体表达于免疫细胞表面，识别肿瘤抗原，激活免疫效应细胞从而产生直接抗肿瘤作用。目前，以cd19为靶点的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在治疗急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤临床试验中显示出良好的效果，有效率最高达90％，显示出这种疗法巨大的治疗潜力。目前，超出300项与嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞治疗相关的临床试验正在进行。尽管嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中有着诱人的前景，但仍然存在几个问题：1.肿瘤特异性抗原缺乏。目前发现的肿瘤特异性表面抗原很少，且多数肿瘤缺乏特异性抗原，大部分为肿瘤高表达但正常组织也表达的肿瘤相关抗原，从而限制了其作为嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞治疗靶点。如在靶向her2的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞临床研究中，由于人体正常肺组织同样表达her2，引起了非特异性细胞毒性杀伤反应，导致患者死亡。2.嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在肿瘤部位的富集。目前关于嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞治疗进展均发生在血液系统肿瘤中，实体瘤尚无报道，其中一个重要原因是体外扩增后的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞不能大量、有效进入实体瘤内，导致抗肿瘤作用不明显。3.肿瘤微环境对嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的抑制作用。相对于血液系统肿瘤，实体瘤内存在复杂的肿瘤免疫微环境，使嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞无法发挥功能，而且最新的文献提示，坏死的肿瘤细胞还可以通过释放k+使淋巴细胞衰竭。因此，仍需要加强本领域的研究，以期进一步提高嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的疗效。淋巴细胞向肿瘤聚集迁移是一个依赖趋化因子的复杂过程，涉及循环淋巴细胞与内皮细胞间的相互作用。研究显示，cxcl12/sdf-1α是重要的t细胞和髓源单核细胞的趋化调节因子，通过与其受体cxcr4结合，驱使细胞沿着浓度梯度达到相关部位。放射治疗后，照射部位cxcl12/sdf-1α表达升高，募集髓源单核细胞向照射部位迁移。在一些高表达cxcl12的胶质细胞肿瘤中也发现了这个现象。研究证实，hiv感染可导致t细胞cxcr4表达下调，而且随时间延长，下降更明显。我们发现，t细胞经慢病毒介导的基因修饰后，趋化因子受体cxcr4表达明显下降，趋化活性受限。基于以上现象，我们设想通过在嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞表达cxcr4，可以使其在cxcl12/sdf-1α高表达的脑胶质瘤或多发性骨髓瘤中聚集，增强抗肿瘤作用，也可以通过放疗等手段使肿瘤部位cxcl12/sdf-1α表达升高，诱导嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞产生归巢效应，从而产生更好的抗肿瘤作用。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是为恶性肿瘤的治疗提供一种新的有效手段。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种嵌合抗原受体，包括胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区。其中，上述嵌合抗原受体中，所述的胞外抗原结合区是与肿瘤抗原结合的单克隆抗体单链可变区，受体或配体。进一步的，所述的肿瘤抗原包括但不限于：(egfr)、上皮细胞粘附分子(epcam)、间皮素(mesothelin)、白介素13受体α2(il-13rα2)、表皮生长因子受体2(erbb2)、表皮生长因子受体3(erbb3)、表皮生长因子受体4(erbb4)、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、神经节苷脂抗原gd2(gd2)、叶酸受体1(folr1)、前列腺特异性膜抗原(psma)、黑色素前体蛋白(gp100)、粘蛋白1(muc1)、粘蛋白16(muc16)、碳酸酐酶9(ca9)、l1细胞黏附分子(cd171)、肿瘤抗原125(ca125)、肿瘤抗原15-3(ca15-3)、肿瘤抗原19-9(ca19-9)、ny-eso-1、mart-1、mage4、b细胞成熟抗原(bcma)、白细胞分化抗原19(cd19)、白细胞分化抗原20(cd20)、白细胞分化抗原22(cd22)、白细胞分化抗原30(cd30)、白细胞分化抗原33(cd33)、癌胚抗原(cea)、白细胞分化抗原38(cd38)、白细胞分化抗原133(cd133)、白细胞分化抗原138(cd138)、白细胞分化抗原123(cd123)、eph受体a2(epha2)、eph受体a3(epha3)。其中，上述嵌合抗原受体中，所述的跨膜区为白细胞分化抗原8(cd8)跨膜区或白细胞分化抗原28(cd28)跨膜区。其中，上述嵌合抗原受体中，所述的胞内信号区为白细胞分化抗原28(cd28)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf9/cd134/ox40)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9/cd137/4-1bb)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)、诱导性t细胞共刺激分子(icos)、cd40、cd27或dap10(dnax激活蛋白10)中一种或多种的胞内结构域。其中，上述嵌合抗原受体中，所述的单克隆抗体单链可变区为scfv单链抗体可变区。其中，上述嵌合抗原受体中，所述的scfv单链抗体可变区的氨基酸序列为seqidno.1所示。seqidno.1scfv单链抗体可变区的氨基酸序列mvllvtslllcelphpafllipdivltqspaslamslgeratiscrasesvsvigahlihwyqqkpgqppklliylasnletgvparfsgsgsgtdftltisrvqaedaaiysclqsrifprtfgqgtkleikgstsgsgkpgsgegstkgqiqlvqsgselkkpgesvkisckasgytftdysinwvkqapgqglkwmgwintetrepayaydfrgrfvfsldtsastaylqisslkaedtavyfcaldysyamdywgqgtlvtvss。其中，上述嵌合抗原受体中，所述的scfv单链抗体可变区的编码核苷酸序列为seqidno.2所示。seqidno.2scfv单链抗体可变区的编码核苷酸序列atggtgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgaactgccccaccctgccttcctgctgattcccgacatcgtgctgacccagagccctgccagcctggccatgtccctgggcgaaagggccaccatctcctgcagggccagcgagagcgtgagcgttattggagcccacttaattcactggtatcaacagaagcccggccagccccccaagctgttaatttatctggcctccaacctggagacaggcgtgcctgccagatttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccatctccagggtgcaggccgaagacgccgccatctacagctgcctgcagagccgtattttccctaggaccttcggccagggcaccaagctggaaattaagggctccacaagcggcagcggaaagcccggttctggcgagggaagcacaaagggacaaattcagctcgtgcagtccggctccgagctgaagaagcccggcgagtccgtgaaaattagctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactacagcattaattgggtgaagcaggctcctggccagggcctgaagtggatgggctggattaacaccgaaaccagggagcccgcctacgcctacgactttaggggcaggttcgtgttcagcctggacacctccgccagcaccgcctacctccaaattagctccctgaaggccgaggacaccgccgtgtacttctgcgccctggactacagctacgccatggactactggggacagggcacactggtcaccgtgagctcc。更具体的，上述嵌合抗原受体为通过氮端到碳端顺次联接信号肽、scfv单链抗体、cd8α跨膜区、cd28胞内段、4-1bb胞内段、cd3δ链得到的。所述的信号肽的氨基酸序列为seqidno.3所示。mvllvtslllcelphpafllip。seqidno.3所述信号肽的编码核苷酸序列为seqidno.4所示。atggtgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgaactgccccaccctgccttcctgctgattccc。seqidno.4其中，所述的cd8跨膜区氨基酸序列为seqidno.5所示。aaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn。seqidno.5所述的cd8跨膜区的编码核苷酸序列为seqidno.6所示。gcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaac。seqidno.6所述cd28胞内域的氨基酸序列为seqidno.7所示。rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs；seqidno.7。所述cd28胞内域的编码核苷酸序列为seqidno.8所示。aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc。seqidno.8。所述4-1bb胞内域的氨基酸序列为seqidno.9所示。krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel；seqidno.9。所述4-1bb胞内域的编码核苷酸序列为seqidno.10所示。aggttcagcgtcgtgaagagaggaaggaagaagctcctgtatatcttcaagcagcctttcatgaggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgctcctgtaggtttcccgaagaggaggagggaggatgcgagctg。seqidno.10。所述cd3δ域的氨基酸序列为seqidno.11所示。rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。seqidno.11。所述cd3δ域的编码核苷酸序列为seqidno.12所示。seqidno.12cd3δ域的编码核苷酸序列agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有seqidno.13所示的氨基酸序列的蛋白；或：(2)在seqidno.13所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与seqidno.13所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。seqidno.13嵌合抗原受体的氨基酸序列mvllvtslllcelphpafllipdivltqspaslamslgeratiscrasesvsvigahlihwyqqkpgqppklliylasnletgvparfsgsgsgtdftltisrvqaedaaiysclqsrifprtfgqgtkleikgstsgsgkpgsgegstkgqiqlvqsgselkkpgesvkisckasgytftdysinwvkqapgqglkwmgwintetrepayaydfrgrfvfsldtsastaylqisslkaedtavyfcaldysyamdywgqgtlvtvssaaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如seqidno.14所示的核苷酸序列或其简并序列；或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与seqidno.14的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。seqidno:14编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列atggtgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgaactgccccaccctgccttcctgctgattcccgacatcgtgctgacccagagccctgccagcctggccatgtccctgggcgaaagggccaccatctcctgcagggccagcgagagcgtgagcgttattggagcccacttaattcactggtatcaacagaagcccggccagccccccaagctgttaatttatctggcctccaacctggagacaggcgtgcctgccagatttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccatctccagggtgcaggccgaagacgccgccatctacagctgcctgcagagccgtattttccctaggaccttcggccagggcaccaagctggaaattaagggctccacaagcggcagcggaaagcccggttctggcgagggaagcacaaagggacaaattcagctcgtgcagtccggctccgagctgaagaagcccggcgagtccgtgaaaattagctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactacagcattaattgggtgaagcaggctcctggccagggcctgaagtggatgggctggattaacaccgaaaccagggagcccgcctacgcctacgactttaggggcaggttcgtgttcagcctggacacctccgccagcaccgcctacctccaaattagctccctgaaggccgaggacaccgccgtgtacttctgcgccctggactacagctacgccatggactactggggacagggcacactggtcaccgtgagctccgcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcccgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。特别的，上述嵌合抗原受体中，所述的配体为april配体。进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述april氨基酸序列为seqidno.15所示。svlhlvpinatskddsdvtevmwqpalrrgrglqaqgygvriqdagvyllysqvlfqdvtftmgqvvsregqgrqetlfrcirsmpshpdraynscysagvfhlhqgdilsviipraraklnlsphgtflgfvklsgggsdp。seqidno.15。所述april的编码核苷酸序列为seqidno.16所示。agcgtgctgcacctggtgcccatcaacgccaccagcaaggacgatagcgacgtgaccgaggtgatgtggcagcccgccctgaggagaggaagaggcctgcaggcccagggctacggagtgagaatccaggacgccggcgtgtacctgctgtacagccaggtgctgttccaggacgtgaccttcactatgggtcaggtggtgagcagagagggccagggcagacaggagaccctgttcaggtgcatcagaagcatgccctcccaccccgacagggcctacaacagctgctactccgccggcgtgtttcacctgcaccagggcgacatcctgagcgttattatccccagagccagggccaagctgaacctgtctcctcatggtaccttcctgggctttgtgaagctgagcggcggcggctccgaccc。seqidno.16。进一步的，上述嵌合抗原受体为通过氮端到碳端顺次联接信号肽、april、cd8α跨膜区、cd28胞内段、4-1bb胞内段、cd3δ链得到的。特别的，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有seqidno.17所示的氨基酸序列的蛋白；或：(2)在seqidno.17所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与seqidno.17所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。seqidno.17嵌合抗原受体的氨基酸序列metdtlllwvlllwvpgstgsvlhlvpinatskddsdvtevmwqpalrrgrglqaqgygvriqdagvyllysqvlfqdvtftmgqvvsregqgrqetlfrcirsmpshpdraynscysagvfhlhqgdilsviipraraklnlsphgtflgfvklsgggsdpaaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如seqidno.18所示的核苷酸序列或其简并序列；或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与seqidno.18的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。seqidno:18编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列atggagaccgacaccctgctgctctgggtgctgctgctgtgggtgcctggaagcaccggaagcgtgctgcacctggtgcccatcaacgccaccagcaaggacgatagcgacgtgaccgaggtgatgtggcagcccgccctgaggagaggaagaggcctgcaggcccagggctacggagtgagaatccaggacgccggcgtgtacctgctgtacagccaggtgctgttccaggacgtgaccttcactatgggtcaggtggtgagcagagagggccagggcagacaggagaccctgttcaggtgcatcagaagcatgccctcccaccccgacagggcctacaacagctgctactccgccggcgtgtttcacctgcaccagggcgacatcctgagcgttattatccccagagccagggccaagctgaacctgtctcctcatggtaccttcctgggctttgtgaagctgagcggcggcggctccgaccccgcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcccgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。seqidno.18。本发明还提供了一种上述嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，共表达趋化因子cxcr4。进一步的，所述的cxcr4受体为(1)具有seqidno.19所示的氨基酸序列的蛋白；或：(2)在seqidno.19所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与seqidno.19所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。seqidno.19cxcr4的氨基酸序列egisiytsdnyteemgsgdydsmkepcfreenanfnkiflptiysiifltgivgnglvilvmgyqkklrsmtdkyrlhlsvadllfvitlpfwavdavanwyfgnflckavhviytvnlyssvlilafisldrylaivhatnsqrprkllaekvvyvgvwipallltipdfifanvseaddryicdrfypndlwvvvfqfqhimvglilpgivilscyciiisklshskghqkrkalkttvililaffacwlpyyigisidsfilleiikqgcefentvhkwisitealaffhcclnpilyaflgakfktsaqhaltsvsrgsslkilskgkrgghssvstesesssfhss。进一步的，上述嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞中，所述cxcr4的编码基因核苷酸序列为(1)：如seqidno：20所示的核苷酸序列或其简并序列；或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与seqidno：20的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。seqidno：20编码cxcr4基因的核苷酸序列ggacccgagggcatttccatctacacctccgacaactataccgaggagatgggcagcggcgactacgattccatgaaggagccctgtttcagggaggagaacgccaacttcaacaaaatttttctccccaccatctacagcatcatcttcctgacaggcatcgtgggaaacggcctggtgatcctggtgatgggctaccagaagaagctgaggagcatgaccgacaagtacaggctccacctgagcgtggccgacctgctgtttgtcattacactgcccttctgggccgtggacgccgtggccaactggtatttcggcaactttctctgcaaggccgtccatgtgatctacaccgtgaacctctacagcagcgtgctgattctggccttcatcagcctggataggtacctggccatcgtccacgccaccaactcccagaggcctagaaagctgctggccgagaaggtggtgtatgtgggcgtctggattcctgccctgctcctgaccatccctgacttcatcttcgccaacgtgagcgaagccgatgacaggtacatctgcgacaggttctaccctaacgatctgtgggtggtggtgttccagttccagcacatcatggtgggcctcatcctgcccggcattgtcatcctgtcctgctactgcatcatcatctccaagctcagccacagcaagggccatcaaaagaggaaggccctgaagaccacagtgatcctgatcctggccttctttgcctgctggctgccttactacatcggcatcagcatcgacagcttcatcctcctggagatcatcaagcagggctgcgagtttgagaacacagtccacaagtggatctccattaccgaagccctcgccttcttccactgctgcctcaaccctatcctgtacgctttcctcggcgccaagttcaagacctccgctcagcatgctctcaccagcgtgtccagaggcagcagcctgaagatcctgagcaagggcaagagaggcggccacagcagcgtgagcacagagtccgagagctccagcttccactccagctga。其中，所述的cxcr4通过p2a与嵌合抗原受体共表达，所述的p2a的氨基酸序列为seqidno.21所示。seqidno.21p2a的氨基酸序列gsgatnfsllkqagdveenpgp。进一步的，所述的p2a的编码基因的核苷酸序列为seqidno.22所示。seqidno.22p2a的编码核苷酸序列ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacc。进一步的，所述的p2a可以有t2a替代，所述的t2a的氨基酸序列为seqidno.23所示。seqidno.23t2a的氨基酸序列rrkrsgsgegrgslltcgdveenpgp。进一步的，所述t2a的编码基因的核苷酸序列为seqidno.24所示。seqidno.24t2a的编码核苷酸序列ggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacct。在本发明中，p2a和t2a均可用于基因的共表达，其优势是剪切效率比较高。其中，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区，其中胞外抗原结合区是结合肿瘤表面特异性抗原或相关抗原的配体，跨膜区为cd8跨膜区或cd28跨膜区，胞内信号区为cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、lck、icos、cd40、cd27或dap10中的一种或几种的胞内结构域。其中，所述的肿瘤表面特异性抗原或相关抗原包括但不限于：egfr、epcam、mesothelin、il-13rα2、erbb2、erbb3、erbb4、vegfr1、vegfr2、gd2、fr、psma、gp100、muc1、muc16、ca9、cd171、cd125、cd15-3、cd19-9、ny-eso-1、mart-1、mage4、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cea、cd38、cd138、cd123、epha2。进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有seqidno.13所示的氨基酸序列的蛋白；或：(2)在seqidno.13所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与seqidno.13所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。其中，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如seqidno.14所示的核苷酸序列或其简并序列；或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与seqidno.14的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。或者，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有seqidno.17所示的氨基酸序列的蛋白；或：(2)在seqidno.17所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与seqidno.17所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。其中，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如seqidno.18所示的核苷酸序列或其简并序列；或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与seqidno.18的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。其中，上述的嵌合抗原受体和cxcr4，由一个载体共同表达。本发明还提供了一种表达载体。所述的表达载体为同时表达seqidno：13所述的嵌合抗原受体和seqidno：19所述的cxcr4的表达载体。或所述的表达载体为同时表达seqidno：17所述的嵌合抗原受体和seqidno：19所述的cxcr4的表达载体。进一步的，所述的表达载体为病毒载体。更进一步的，所述的表达载体为慢病毒载体。本发明还提供了一种病毒。该病毒包含上述的表达载体。本发明还提供了含有上述的表达载体或病毒的宿主细胞。进一步的，上述宿主细胞为淋巴细胞。更进一步的，所述淋巴细胞为t细胞或单核细胞，所述的t细胞为αβt细胞、nkt细胞或γδt细胞。本发明还提供了一种上述嵌合抗原受体，嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在单独或与放疗联合用于治疗恶性肿瘤的用途。主要用于制备治疗恶性肿瘤的药物或与放射治疗联合抑制肿瘤。所述的恶性肿瘤为肺癌。肝癌。淋巴瘤。结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤或前列腺癌。更具体的，本发明包括三个方面，分述如下：本发明的第一个方面涉及一种共表达cxcr4的嵌合抗原受体。其中嵌合抗原受体由能够结合肿瘤特异性或相关抗原的配体、跨膜区和胞内信号区组成，通过p2a序列或t2a序列与cxcr4表达基因相连。共同表达在同一个载体上。(例如如图1所示的结构)。本发明的第二个方面涉及获得一种表达cxcr4的嵌合型抗原受体修饰的淋巴细胞。利用本发明第一个方面提供的共表达cxcr4和嵌合型抗原受体的载体，转染人外周淋巴细胞，从而获得表达cxcr4的嵌合型抗原受体修饰的淋巴细胞。一般通过慢病毒包装体系，产生高滴度的慢病毒，转染人外周淋巴细胞，本发明的第三个方面涉及本发明第一方面任一所述的共表达cxcr4的嵌合抗原受体或第二方面所述的淋巴细胞单独或与放疗联合用于治疗恶性肿瘤的用途。在本发明中，类似于“在seqidno：14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”表述的基因序列一般是指编码具有seqidno：14所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与seqidno：14同源性低至约89％的简并序列也能编码出seqidno：14所述的序列。另外,“在seqidno：14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与seqidno：14核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与seqidno：14中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语“在seqidno：14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”还包括能编码具有与seqidno：14所编码蛋白功能相同的蛋白的seqidno：14中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，“在所述的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列”的表述包括但并不限于若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述蛋白的活性片段和活性衍生物。“在所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列”的表述还包括但并不限于有至多10个(即一个或几个)，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，即保守性变异多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1氨基酸替换表最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu本发明的有益效果为：本发明通过构建共表达嵌合抗原受体和趋化因子受体cxcr4的病毒表达载体，生产慢病毒，转导淋巴细胞，得到一种共表达cxcr4的嵌合抗原受体t淋巴细胞，能够逆转病毒修饰导致的t细胞cxcr4表达下降，增强嵌合抗原受体t细胞的趋化活性，促进该淋巴细胞向sdf-1(cxcl12)高浓度区域聚集，趋化性从3％提高至9％，有利于增强嵌合抗原受体t淋巴细胞的抗肿瘤效应。当其与放射治疗联合使用时，还能诱导嵌合抗原受体t淋巴细胞产生归巢效应，从而产生更好的抗肿瘤作用。附图说明图1所示为共表达cxcr4的嵌合抗原受体示意图；a表示胞外抗原结合区为scfv的嵌合抗原受体，b表示胞外抗原结合区为april的嵌合抗原受体，c表示胞外抗原结合区为受体的嵌合抗原受体；其中，sp为gm-cfsr信号肽，scfv表示抗原结合区，april表示配体结合区。cd8αhinge表示cd8α跨膜区，cd28和4-1bb表示共刺激信号域，cd3δ表示t细胞激活域，p2a为连接片段，cxcr4为趋化因子受体；图2所示为慢病毒感染后t细胞cxcr4表达；图3所示为慢病毒感染后t细胞的趋化活性；图4所示为共表达cxcr4后car-t细胞cxcr4表达；图5所示为共表达cxcr4后car-t细胞趋化活性；a表示rpmi-8226细胞培养上清诱导的car-t趋化活性，b表示sdf-1(即cxcl12)诱导的car-t趋化活性；图6所示为car-t和car/cxcr4-t细胞car表达；图7所示为car-t和car/cxcr4-t细胞杀伤活性。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本发明进行详细说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如sambrookj,russelld.w.,2001,molecularcloning:alaboratorymanual(3rded),springharborlaboratorypress中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1获得car、car/cxcr4全长基因，完成重组质粒载体的构建一、全长scfv-car和scfv-car/cxcr4基因的获得采用全基因合成的方法得到scfv-car，scfv-car-p2a-cxcr4基因片段。同时，设计如下引物扩增scfv-car片段：5’引物：5’aggtttaaactacggatggtgctgctggtgacctccc3’seqidno：253’引物：5’atgactagtcccgggttagcgagggggcagggcctgc3’seqidno：26反应条件如下：pcr反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应25个循环。然后72℃再延伸10分钟。设计如下引物扩增scfv-car/cxcr4片段：5’引物：5’aggtttaaactacggatggtgctgctggtgacctccc3’seqidno：273’引物：5’atgactagtcccgggtcagctggagtggaagctggag3’seqidno：28反应条件如下：pcr反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸2分钟。反应25个循环。然后72℃再延伸10分钟。二、全长april-car和april-car/cxcr4基因的获得采用全基因合成的方法得到april-car，april-car-p2a-cxcr4基因片段。同时，设计如下引物扩增april-car片段：5’引物：5’aggtttaaactacggatggagaccgacaccctgctgc3’seqidno：293’引物：5’atgactagtcccgggttagcgagggggcagggcctgc3’seqidno：30反应条件如下：pcr反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应25个循环。然后72℃再延伸10分钟。设计如下引物扩增april-car/cxcr4片段：5’引物：5’aggtttaaactacggatggagaccgacaccctgctgc3’seqidno：313’引物：5’atgactagtcccgggtcagctggagtggaagctggag3’seqidno：32反应条件如下：pcr反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸2分钟。反应25个循环。然后72℃再延伸10分钟。三、含全长car和car/cxcr4基因的慢病毒重组质粒的构建如上所述，在全基因合成片段中的没有酶切位点，我们采用同源重组的方法将片段直接插入真核表达载体pwpxld(购自美国addgene公司)的多克隆位点ecori/bamhi中，重组后酶切位点将会消失。其构建过程如下：1.重组慢病毒质粒pwpxld-car的构建通过限制性内切酶ecor1和bamh1将慢病毒载体pwpxld线性化，利用天根easygeno快速重组克隆试剂盒(天根生化科技有限公司、vi201)将全长car基因扩增片段插入pwpxld的ecori/bamhi位点，重组产物pwpxld-car转化大肠杆菌stbl3，随机挑选30个克隆进行测序鉴定。测序结果与设计的car全长序列一致。2.重组慢病毒质粒pwpxld-car/cxcr4的构建通过限制性内切酶ecor1和bamh1将慢病毒载体pwpxld线性化，利用天根easygeno快速重组克隆试剂盒(天根生化科技有限公司、vi201)将全长car/cxcr4基因扩增片段插入pwpxld的ecori/bamhi位点，重组产物pwpxld-car/cxcr4转化大肠杆菌stbl3，随机挑选30个克隆进行测序鉴定。测序结果与设计的car/cxcr4全长序列一致。构建的慢病毒重组载体结构示意图如图1所示，图1a、图1b和图1c分别表示嵌合抗原受体的胞外抗原结合区为scfv、配体和受体结合区时的重组载体结构。实施例2慢病毒包装及car-t细胞的生产1、慢病毒包装293t细胞采用dmem+10％胎牛血清(fbs)培养，待生长至70-90％密度时用于病毒包装，步骤如下：转染前2h更换新鲜预热的dmem培养基(含10％fbs)，在15ml离心管中配制转染体系：实验条件如表2和3所示。表2质粒体系表3转染体系:混匀后，将转染液均匀滴加至平皿中，37℃，5％co2培养箱中继续培养。12h后更换为dmem+2％fbs培养基。分别于48h和72h收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤病毒液，4℃，160000g，超速离心90min，pbs重悬，分装保存于-80°。2、t细胞感染采用ficoll-hypaque(sigma)分离人外周血单核细胞(pbmc)，步骤如下：将等体积的外周血缓慢加入ficoll-hypaque中，1000g，18°离心30分钟，吸取中间层白膜，红细胞裂解液作用2分钟，300g离心5分钟，1640培养基洗两次，计数，加入cd3/cd28dynabeads(lifetechnologies11131d)(cells:beads＝1：3)共培养。24h后，慢病毒感染激活的pbmc，步骤如下：离心细胞，用含病毒上清的培养基(感染复数moi＝1：10)重悬细胞，1×106/ml细胞，加入凝聚胺(polybrene)，终浓度为8mg/ml，混匀，32°条件下1000g离心90分钟，然后37℃5％co2培养箱中继续培养。实施例3t细胞cxcr4表达检测将实施例1构建的慢病毒感染或未感染的t细胞和外周血单核细胞，24h后换液，用x-vivo15(04-418q，lonza公司)完全培养基+10％人ab血清(h4522，sigma公司)继续培养5天，同时加入重组人白介素2(il-2)细胞因子100u/ml(c013，novaprotein公司)。然后收集细胞，pbs洗两次，apc标记的抗人cxcr4抗体(货号306510，biolegend公司)染色，流式细胞术检测细胞膜cxcr4表达，结果显示：感染了含car全长基因的慢病毒后，外周血单核细胞cxcr4表达明显下降，其荧光强度(对数值)由238下降至174(图4)，t细胞感染慢病毒后cxcr4表达下降更明显，其荧光强度(对数值)由239降至108，降低超过一半(如图2所示)。实施例4慢病毒感染的t细胞趋化活性检测在实施例3中感染的外周血单核细胞和t细胞观察到cxcr4表达下降后，为评估其影响，进一步对其介导的趋化活性进行检测。具体操作步骤如下：淋巴细胞趋化活性检测通过细胞迁移试验评估。采用5μm孔径的(货号3421；costar，cambridge，ma)transwell检测，transwell中聚碳酸酯膜在含20μg/mlbsa的pbs中4℃浸泡过夜，使用前置于24孔板中晾干。试验前，感染(car-t组)或未感染(对照组)慢病毒细胞t细胞和外周血单核细胞在rpmi1640完全培养基(含有1％bsa，10mmhepes缓冲液，ph6.9)中血清饥饿4小时。试验时，在24孔板中加入500ul含100ng/mlsdf-1的无血清rpmi1640完全培养基；晾干的transwell放入孔内，然后将200ulfarred标记的血清饥饿细胞(5×105)加入transwell上室。在37℃，5％co2条件下孵育4h，收集下室的迁细胞，离心沉淀，并重悬于300ul预冷的facs缓冲液(含10％小牛血清和0.2％叠氮钠)，每个样品中加入1×105数量的9微米的乳胶珠(bcr167，sigma公司)和25微升浓度为50ug/ml的propidiumiodide/碘化丙啶工作液(st511，碧云天生物技术有限公司)，流式细胞仪检测样品。因各组中乳胶珠数量相同，以其作为参照。统计pi染色阴性细胞，可以计算出迁移的farred标记的t细胞数量＝迁移率(％)＝分析发现：感染慢病毒后，在sdf-1趋化作用下，外周单核细胞的迁移率由16.7％下降至9.2％，t细胞迁移率由19.3％降至4.1％(图3)，结果表明随着cxcr4表达的降低，t细胞和外周单核细胞的趋化活性也明显下降。实施例5表达cxcr4增强嵌合抗原受体修饰t细胞趋化活性为逆转t细胞的趋化活性，我们在t细胞中过表达cxcr4以增强慢病毒感染的car-t细胞趋化活性。首先，在car-t细胞中共表达cxcr4。含全长car(car-t组)或car/cxcr4(car/cxcr4-t组)的慢病毒感染t细胞，48h后收集细胞，pbs洗两次，apc标记的抗人cxcr4抗体(货号306510，biolegend公司)染色，流式细胞术检测细胞膜cxcr4表达，结果显示：与car-t组相比，car/cxcr4组t细胞cxcr4表达明显升高，平均荧光强度(对数值)由108升高至229(如图4所示)。其次，趋化活性检测，试验方法同实施例4：采用5μm孔径的(货号3421；costar，cambridge，ma)transwell检测，transwell中聚碳酸酯膜在含20μg/mlbsa的pbs中4℃浸泡过夜，使用前置于24孔板中晾干。试验前，表达(car/cxcr4-t组)或不表达(car-t组)cxcr4的t细胞在rpmi1640完全培养基(含有1％bsa，10mmhepes缓冲液，ph6.9)中血清饥饿4小时。试验时，在24孔板中加入500ul含100ng/mlsdf-1的无血清rpmi1640完全培养基或rpmi-8226细胞培养上清；晾干的transwell放入孔内，然后将200ulfarred标记的血清饥饿细胞(5×105)加入transwell上室。在37℃，5％co2条件下孵育4h，收集下室的迁细胞，离心沉淀，并重悬于300ul预冷的facs缓冲液(含10％小牛血清和0.2％叠氮钠)，每个样品中加入1×105数量的9微米的乳胶珠(bcr167，sigma公司)和25微升浓度为50ug/ml的propidiumiodide/碘化丙啶工作液(st511，碧云天生物技术有限公司)，流式细胞仪检测样品。因各组中乳胶珠数量相同，以其作为参照。统计pi染色阴性细胞，可以计算出迁移的farred标记的t细胞数量＝迁移率(％)＝结果显示：rpmi-8226细胞(高表达并分泌sdf-1)培养上清可促进car/cxcr4-t细胞迁移，从不足2.9％增加到4.15％(图5a)；在趋化因子sdf-1(cxcl12)浓度为100ng/ml时，可明显增加共表达cxcr4的car-t细胞趋化效率，由car-t组的3％左右升高到9％，提升了三倍(图5b)；充分说明共表达cxcr4可以增强car-t细胞向sdf-1高浓度部位迁移的趋化活性。实施例6car表达和活性检测含全长car或car/cxcr4的慢病毒感染t细胞，培养5天后，收集细胞，采用fitc标记的重组人bcma蛋白(novaprotein公司)染色，检测t细胞car表达。结果显示，相对于对照组(小于5％)，car组和car/cxcr4组中car表达明显升高(达40％)，荧光峰值发生偏移(图6)。不同浓度的上述t细胞、car-t细胞或car/cxcr4-t细胞(即效应细胞)分别与csfe标记的人骨髓瘤细胞系rpmi-8226细胞(靶细胞，bcma高表达)共培养，24h后，每组中加入数量为1×105的farred标记k562细胞，pbs洗2次，流式细胞仪fitc和apc通道检测荧光细胞比例。因各组中farred标记的k562细胞数量相同，因此，以k562细胞为参照，可以计算出fitc标记的靶细胞(rpmi-8226)数量杀伤效率(百分比％)＝其中阴性组未加t细胞)。结果显示：在效应细胞数量/靶细胞数量(e/t)＝1:1时，对照组细胞对rpmi-8226细胞的杀伤效率为23.7％，而car-t细胞和car/cxcr4-t细胞分别达45.3％和51％；在效应细胞数量/靶细胞数量(e/t)＝5:1时，对照组细胞对rpmi-8226细胞的杀伤效率约为44.7％，而car-t细胞和car/cxcr4-t细胞分别达75.1％和82.3％(图7)，结果表明，嵌合抗原受体(car)可以增强t细胞对rpmi-8226的杀伤活性，而共表达cxcr4可以增强car-t细胞的杀伤活性。综上所述，由上述试验可知，本发明通过构建共表达嵌合抗原受体和cxcr4慢病毒表达载体，并导入t细胞中，能够消除t细胞表达car-t时存在的趋化性降低的缺陷，提供一种杀伤活性和趋化活性都提高的淋巴细胞，有利于增强嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的抗肿瘤效应。序列表<110>四川大学<120>表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途<130>a171561k<141>2017-12-28<150>201611253681.8<151>2016-12-30<160>32<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>268<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metvalleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro151015alapheleuleuileproaspilevalleuthrglnserproalaser202530leualametserleuglygluargalathrilesercysargalaser354045gluservalservalileglyalahisleuilehistrptyrglngln505560lysproglyglnproprolysleuleuiletyrleualaserasnleu65707580gluthrglyvalproalaargpheserglyserglyserglythrasp859095phethrleuthrileserargvalglnalagluaspalaalailetyr100105110sercysleuglnserargilepheproargthrpheglyglnglythr115120125lysleugluilelysglyserthrserglyserglylysproglyser130135140glygluglyserthrlysglyglnileglnleuvalglnserglyser145150155160gluleulyslysproglygluservallysilesercyslysalaser165170175glytyrthrphethrasptyrserileasntrpvallysglnalapro180185190glyglnglyleulystrpmetglytrpileasnthrgluthrargglu195200205proalatyralatyrasppheargglyargphevalpheserleuasp210215220thrseralaserthralatyrleuglnileserserleulysalaglu225230235240aspthralavaltyrphecysalaleuasptyrsertyralametasp245250255tyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser260265<210>2<211>804<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atggtgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgaactgccccaccctgccttcctgctg60attcccgacatcgtgctgacccagagccctgccagcctggccatgtccctgggcgaaagg120gccaccatctcctgcagggccagcgagagcgtgagcgttattggagcccacttaattcac180tggtatcaacagaagcccggccagccccccaagctgttaatttatctggcctccaacctg240gagacaggcgtgcctgccagatttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgacc300atctccagggtgcaggccgaagacgccgccatctacagctgcctgcagagccgtattttc360cctaggaccttcggccagggcaccaagctggaaattaagggctccacaagcggcagcgga420aagcccggttctggcgagggaagcacaaagggacaaattcagctcgtgcagtccggctcc480gagctgaagaagcccggcgagtccgtgaaaattagctgcaaggcctccggctacaccttc540accgactacagcattaattgggtgaagcaggctcctggccagggcctgaagtggatgggc600tggattaacaccgaaaccagggagcccgcctacgcctacgactttaggggcaggttcgtg660ttcagcctggacacctccgccagcaccgcctacctccaaattagctccctgaaggccgag720gacaccgccgtgtacttctgcgccctggactacagctacgccatggactactggggacag780ggcacactggtcaccgtgagctcc804<210>3<211>22<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metvalleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro151015alapheleuleuilepro20<210>4<211>66<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atggtgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgaactgccccaccctgccttcctgctg60attccc66<210>5<211>86<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5alaalaalaphevalprovalpheleuproalalysprothrthrthr151015proalaproargproprothrproalaprothrilealaserglnpro202530leuserleuargproglualacysargproalaalaglyglyalaval354045histhrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrpalapro505560leualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleu65707580tyrcysasnhisargasn85<210>6<211>258<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcga60ccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgc120cggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctac180atctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctt240tactgcaaccacaggaac258<210>7<211>41<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7argserlysargserargleu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