区分clade2．3．2．1和clade2．3．4．4H5AIV的实时荧光定量PCR引物的制作方法

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一组区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物。

背景技术：

禽流感（Avian influneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病。高致病性H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus, H5 AIV）引起的感染目前被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，在我国被列为一类动物疫病。

关于流感的最早记录可追溯到1878年来自意大利的一次报道，随后世界各地陆续发生流感的暴发和流行。1996年，在我国分离到的第一株H5N1亚型HPAIV（A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96），紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感染人事件，这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。由于从祖源病毒GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一，为此WHO、FAO和OIE联合制定了H5N1 HPAIV统一分类准则将H5N1 HPAIV分为0~9共计10个不同clade。其中clade 2.3.4最早于2003~2006年间流行于中国、越南、泰国、老挝和马来西亚等地的病毒株，2006~2009年clade 2.3.4分支在我国很多地区是优势流行株；而2010年后逐渐被clade 2.3.2.1分支取代，以A/duck/Guangdong/S1322/2006为HA和NA基因供体研制Re-6株疫苗来控制clade 2.3.2.1分支病毒的流行。近年来，出现了clade 2.3.4.4分支病毒，针对该类病毒研制了Re-8株疫苗。对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5 AIV相应疫苗的科学使用。

然而，clade 2.3.2.1和clade 2.3.4二者之间的基因序列核苷酸同源率大于94.3%（以经典毒株的同源率为例），很难通过常规的分子生物学方法（如常规RT-PCR方法）进行鉴别。本发明的一组区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行有效区分。该引物根据clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差异来设计；利用实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线的Tm值和其GC含量正相关的特点，通过观察clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV经该组引物进行实时荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线Tm值差异，即可精确对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情况进行准确鉴别诊断，相关研究尚未见国内外文献报道，本发明可填补相关领域空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一组区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物及其应用，该引物能有效区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染（或共感染），为科学防控 H5 AIV提供技术保证。

本发明根据clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）存在特征性的核苷酸序列差异来设计一组实时荧光定量PCR引物。利用该扩增区域clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）存在的核苷酸GC含量差异，通过建立基于Eva Green实时荧光定量PCR方法对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）差异，根据熔解曲线Tm值差异可直接对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情况进行鉴别诊断。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物，其核苷酸序列为：

上游引物F1：5’- ATTGACAAAATGAACACTC -3’；

下游引物R1：5’- CCAGACATCTAGGAATCCGT -3’。

通过所述引物建立基于Eva Green的实时荧光定量PCR方法，根据利用该引物扩增的clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的核苷酸特征性差异——GC含量差异，可导致实时荧光定量PCR反应扩增反应后的生成的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）的特点，可直接对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染进行鉴别。

具体包括以下步骤：

（1）设计并合成上述特异性引物对F1/R1；

（2）病毒RNA提取：从检测样品中分别提取clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的病毒RNA；

（3）RT-PCR扩增：设计并合成H5 AIV血凝素基因HA特异性引物对H5-HAF/H5-HAR对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增，获得其HA基因序列；将RT-PCR扩增的目的片段进行胶回收并纯化后，克隆到T载体上，获得含有clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的血凝素基因HA的阳性重组质粒（T-clade 2.3.2.1-1和T-clade 2.3.4.4 -1），测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。

所用H5 AIV血凝素基因HA特异性引物对H5-HAF/H5-HAR的核苷酸序列为：

H5-HAF: 5’- TGGTTACCATGCAAACAAC -3’；

H5-HAR: 5’- TTACACTTTCCATACATTCATTATC -3’。

（4）实时荧光定量PCR：用所述实时荧光定量引物对F1/R1对阳性重组质粒（T-clade 2.3.2.1-1和T-clade 2.3.4.4-1）进行Eva Green实时荧光定量PCR扩增，反应完成后获得相应的扩增曲线，并生成Eva Green实时荧光定量PCR扩增的熔解曲线。

（5）病毒感染情况判断：实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察扩增曲线判断是否存在clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染；通过观察熔解曲线其Tm值差异可对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行鉴别。

其中，本发明所设计的实时荧光定量PCR引物对F1/R1满足如下要求：

（1）特异性强：该实时荧光定量PCR引物在针对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因HA核苷酸序列进行分析后保守的区域设计，对二者均具有高特异性，达到仅需一组引物便能对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行扩增的目的，即观察实时荧光定量PCR反应后的扩增曲线即可判断是否感染clade 2.3.2.1或clade 2.3.4.4 H5 AIV感染进行判断（但无法区分是clade2.3.4 H5 AIV还是clade 2.3.2.1 H5 AIV）。

（2）两种病毒的扩增区域GC含量不同：该组引物扩增的血凝素基因HA在clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV中存在核苷酸序列GC含量差异。基于实时荧光定量PCR反应生成的熔解曲线的Tm值差异（该差异和核苷酸序列的GC含量差异正相关），即可通过观察实时荧光定量PCR反应后的熔解曲线对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染进行判断（可有效区分是clade2.3.4 H5 AIV还是clade 2.3.2.1 H5 AIV）。

其中，所述的步骤（5）的病毒感染情况判断方法如下：

若在Tm=（80.06±0.09）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade 2.3.2.1 H5 AIV阳性；

若在Tm=（79.18±0.08）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade 2.3.4.4 H5 AIV阳性；

若在Tm=（80.06±0.09）℃以及Tm=（79.18±0.08）℃出现双峰，则判断为clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV双重感染；

其他情况均判为阴性。

本发明所设计的实时荧光定量PCR引物对F1/R1可用于制备区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染的试剂盒。

本发明的有益效果：鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期分离的2株clade 2.3.2.1 H5 AIV和2株clade 2.3.4.4 H5 AIV进行实时荧光定量PCR检测，均和预期相符。且仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行有效区分。

附图说明

图1 为clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因HA引物设计区及核苷酸序列特征性差异图。

图2 引物对F1/R1对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应的扩增曲线：F1/R1对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV病毒感染结果的判断须在扩增成功的前提下做出，若扩增失败，则不可依据熔解曲线做出感染类型判断；若拷贝数相同，则clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV扩增曲线一致。

图3 引物对F1/R1对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应的熔解曲线。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

H5亚型流感病毒clade 2.3.2.1分支（DY1株）和clade 2.3.4.4分支（DK10株）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

2、引物设计与合成

根据clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的血凝素基因HA核苷酸特征性差异区设计实时荧光定量PCR反应的引物F1和R1，其中F1和R1引物序列为：

上游引物F1：5’- ATTGACAAAATGAACACTC -3’，

下游引物R1：5’- CCAGACATCTAGGAATCCGT -3’。

3、病毒RNA提取以及RT-PCR扩增：

以常规方法提取H5亚型流感病毒clade 2.3.2.1分支（DY1株）和clade 2.3.4.4分支（DK10株）的病毒RNA。利用针对H5 AIV血凝素基因HA基因,设计特异性引物（ H5-HAF: 5’- TGGTTACCATGCAAACAAC -3’和H5-HAR: 5’- TTACACTTTCCATACATTCATTATC -3’）对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增，获得其HA基因序列；将RT-PCR扩增的目的片段进行胶回收并纯化后，克隆到T载体上，获得含有clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的血凝素基因HA的阳性重组质粒（T- clade 2.3.2.1-1和T- clade 2.3.4.4-1），测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。

4、实时荧光定量PCR反应：

优化出的20 μL 最佳反应体系为体系：Eva Green 10 μL，浓度为10 μmol/L的F1、R1各0.2 μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃，2 min预变性；95℃ 10 s，59℃ 15 s，共40个循环，循环结束后，根据条件做出对应的熔解曲线。

5、病毒感染情况判断：

实时荧光定量PCR反应结束后，观察扩增曲线，判断建立的方法有无特异性扩增（没有扩增曲线，熔解曲线的检测结果没有意义）。实时荧光定量PCR反应结束后做出的熔解曲线，直接在和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑上，利用实时荧光定量PCR对应的软件进行分析（可直接肉眼观察），对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情况进行判断，判断方法为：

若在Tm=（80.06±0.09）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade 2.3.2.1 H5 AIV阳性；

若在Tm=（79.18±0.08）℃出现单一的特异性Tm峰判为clade 2.3.4.4 H5 AIV阳性；

若在Tm=（80.06±0.09）℃以及Tm=（79.18±0.08）℃出现双峰，则判断为clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV双重感染；

其他情况均判为阴性。

从图3可以看出，引物对F1/R1对两株病毒血凝集素基因（HA）片段扩增特异性强，且二者的Tm值存在差异，可有效区分两株病毒。试验结果表明，使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期分离的2株clade 2.3.2.1 H5 AIV和2株clade 2.3.4.4 H5 AIV进行实时荧光定量PCR检测，均和预期相符。且仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行有效区分。

实施例2

对临床送检的85份死亡鸭病料经处理后进行实时荧光定量PCR检测后发现，clade 2.3.2.1 H5 AIV感染阳性有3株，阳性率为3.52%（3/85）；clade 2.3.4.4 H5 H5 AIV感染阳性有5株，阳性率为5.88%（5/85）；，未检测到临床送检的85份死亡鸭存在 clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV共感染现象。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> F1

<400> 1

attgacaaaa tgaacactc 19

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<211> 20

<212> DNA

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ccagacatct aggaatccgt 20

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<211> 19

<212> DNA

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<400> 3

tggttaccat gcaaacaac 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> H5-HAR

<400> 4

ttacactttc catacattca ttatc 25