一种腺病毒检测、测序的引物组合及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及医学检验领域，具体而言，涉及一种腺病毒检测、测序的引物组合及应用。

背景技术：

人腺病毒(human adenovirus，HAdV)是一类无包膜的双链DNA病毒，分为A-G 7个血清学组，其中B组腺病毒感染目前己成为急性呼吸系统疾病的重要因素。B组又可分为B1和B2亚组，B1主要包括3、7、16、21、51型；B2包括14、34、35及55型。

对我国爆发的腺病毒毒株进行基因组测序，有助于了解该病毒的进化特点和流行趋势，有助于对55型腺病毒的预防和控制。

目前，还没有比较有效的针对人腺病毒(human adenovirus，HAdV)的快速检测和测序的手段。或者是覆盖不全面，检测不准确，容易导致误检和误判。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种腺病毒的检测引物，该引物能特异的检测出腺病毒。

本发明的第二目的在于提供上述的腺病毒的检测引物在检测腺病毒中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述的腺病毒的检测引物在制备检测腺病毒试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种腺病毒的检测试剂盒；试剂盒能快速、特异的检测出腺病毒。

本发明的第五目的在于提供一种腺病毒的测序引物。

本发明的第六目的在于提供上述的腺病毒的测序引物在腺病毒基因组DNA测序中的应用。

本发明的第七目的在于提供上述的腺病毒的测序引物在制备腺病毒测序试剂盒中的应用。

本发明的第八目的在于提供一种腺病毒的测序试剂盒。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种腺病毒的检测引物，检测引物包括第一引物组合，第一引物组合为第1-12引物对中的一种或多种，第1-12引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-24所示。

上述的腺病毒的检测引物在检测腺病毒中的应用。

上述的腺病毒的检测引物在制备检测腺病毒试剂盒中的应用。

一种腺病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测引物，以及PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中至少一种。

一种腺病毒的测序引物，测序引物包括第二引物组合和如上述的第一引物组合，第二引物组合包括第13-24引物对，第13-24引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.25-48所示。

上述的腺病毒的测序引物在腺病毒基因组DNA测序中的应用。

上述的腺病毒的测序引物在制备腺病毒测序试剂盒中的应用。

一种腺病毒的测序试剂盒，测序试剂盒包括如权利要求2所述的引物对；以及PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、ddNTPs、dNTPs和Mg²⁺中的至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供腺病毒的检测引物能特异的检测出腺病毒，腺病毒的检测引物在制备试剂盒中的应用，更方便对腺病毒的检测，且使用方法的简便和快捷；本发明还提供应用腺病毒的测序引物，该测序引物能全覆盖的将腺病毒基因组测序，该测序引物在制备腺病毒测序中的应用，更方便对腺病毒的快速测序，能帮助准确判断腺病毒的类型，效果明显。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的检测引物电泳结果图；

图2为本发明测序的结果与已知序列比对结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

Invitrogen PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物和PCR用高保真DNA聚合酶I5-MIX购自成都擎科梓熙生物技术有限公司；生化试剂购自上海生工生物工程有限公司，其余试剂均购自国药生化试剂公司。

下面对本发明实施例的一种腺病毒检测、测序引物组合及应用进行具体说明。

一种腺病毒的检测引物，检测引物包括第一引物组合，第一引物组合为第1-12引物对中的一种或多种，第1-12引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-24所示。

检测引物针对腺病毒的序列设计，针对性强，特异性好，灵敏度高，检测结果可靠准确。

上述的腺病毒的检测引物在检测腺病毒中的应用。

应用上述检测引物，近年来，HAdV-B55在成人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行；应用生物化学的方法，能快速有效的检测出腺病毒，为后续的针对性的治疗等提供准确可靠的检测结果。

进一步地，以腺病毒DNA为模板进行PCR反应；

PCR反应体系为：Mix反应液，25μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；DNA模板，2μL；ddH2O，21μL；PCR反应程序为：98℃，3min；98℃，10s；57-69℃，10s；72℃，45s；30个循环；72℃，5min。

选择57-69℃退火温度，能扩增出较好的目的条带，避免扩增出非特异的条带干扰实验结果，30个循环能扩增出大量片段，将微量的模板放大，利于检测，而且30个循环反应时间相对较缩短，利于快速反应，快速拿到检测结果。

上述的腺病毒的检测引物在制备检测腺病毒试剂盒中的应用。

应用上述检测引物，使检测结果更准确可靠。

一种腺病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测引物，以及PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中的至少一种。

将检测引物应用到检测试剂盒中，方便检测应用，配套使用，能快速检测腺病毒，方便且经济。

一种腺病毒的测序引物，测序引物包括第二引物组合和上述的第一引物组合，第二引物包括第13-24引物对，第13-24引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.25-48所示。

该测序引物的设计，退火温度适中，无引物二聚体，无错配现象的发生。产物长度适中而且各个片段的长度也接近，也有利于测序反应的进行，反应快速，结果准确。

上述的腺病毒的测序引物在腺病毒基因组DNA测序中的应用。

上述的腺病毒的测序引物的应用，能帮助快速分析所测序的腺病毒的类型，结果更为可信和可靠，证据更为充分。

进一步地，以腺病毒DNA为模板，进行PCR反应；

测序引物对在测序的时候，每一对测序引物对设置有第一反应管、第二反应管、第三反应管和第四反应管，共四个反应管；每个反应管中加入模板DNA、引物对、PCR反应缓冲液、高保真Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+引物对；第一反应管还加入ddATP，第二反应管还加入ddGTP，第三反应管还加入ddCTP，第四反应管还加入ddTTP；PCR反应程序为：98℃，3min；98℃，10s；58-67℃,10s；72℃，150s；40个循环；72℃，5min。

由于腺病毒的基因组DNA碱基数量不多，采用第一代测序技术对腺病毒基因组进行测序；能快速准确的获得所需要的数据，且结果也更可靠和直观，可以直接使用读取的结果；避免二代测序技术，避免对读取的数据的后期加工，简单可靠。

测序引物对在测序使用的时候，分为四个反应管，每个反应管中加入模板DNA、引物对、PCR反应缓冲液、高保真Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺引物对；第一反应管还加入ddATP，第二反应管还加入ddGTP，第三反应管还加入ddCTP，第四反应管还加入ddTTP；选用高保真Taq DNA聚合酶，可以保证在反应的过程中，能较好的保证扩增的序列与模板序列一致，避免扩增的序列出现失真的现象；而Mg²⁺能激活高保真Taq DNA聚合酶的活性，使酶保持较高的活性；第一反应管中加还加入ddATP，当反应进行过程中，ddATP连接到反应链上的时候，由于还ddATP无法形成3-5磷酸二酯键，反应即终止，由于ddATP是随机的加入到反应的，所以扩增的片段上有腺嘌呤A的位置都会有终止；加入ddGTP、ddCTP和ddTTP的反应管也是同样的；每一个反应管通过电泳就能读出整个扩增的片段的碱基序列。

当然，在ddNTPs上还需要进行标记，通常采用放射性标记或者荧光标记；从安全的角度考虑，优选荧光标记。

荧光标记的ddNTPs，四种不同的ddNTPs分别标记不同的荧光，反应结束后，通过毛细管电泳，不同分子量大小的扩增片段会以从小到达的顺序通过电泳，而通过识别不同的荧光读出序列的碱基。

上述的腺病毒的测序引物在制备腺病毒测序试剂盒中的应用。

一种腺病毒的测序试剂盒，测序试剂盒包括上述的测序引物对；以及PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、ddNTPs、dNTPs和Mg²⁺中的至少一种。

测序试剂盒能帮助快速的建立测序反应体系，快速的读出腺病毒的基因组碱基序列。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种腺病毒的检测引物，检测引物包括第一引物组合，第一引物组合为第1-12引物对，第1-12引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-24所示。

上述腺病毒检测引物的使用，具体方法如下：

样本的获取

样本：55型腺病毒样本采集自2016年西藏拉萨地区某呼吸道感染病例。

在生物安全2级(BSL2)实验室采用腺病毒敏感细胞系Hep-2细胞对咽拭子样本进行病毒分离。

实验方法：

1.1 将Hep-2细胞接种于24孔板内，接种密度1.5×10⁵个/孔，培养24h；

1.2 使用PBS洗细胞3次，每孔加入500μl的2％的DMEM培养基，每孔加入确诊患者的咽拭子标本30μl；

1.3 37℃孵箱内持续培养并逐日观察细胞病变(CPE)情况，当75％的细胞出现典型CPE时，收集细胞上清；

1.4 采用PCR方法进行核酸检测并对PCR产物测序鉴定，将阳性分离物分装保存于-80℃冰箱内。

腺病毒DNA的提取方法如下：

2.1 病毒上清液500μL，12000rpm离心5min，用移液器件将20μL蛋白酶K加入样本中，65℃消化10-20min；

2.2 管中加入500μL的结合液，充分混匀；

2.3 在向管中加入400的无水乙醇，成分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，将溶液和絮状沉淀加入吸附柱，静置2min；

2.4 12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管；

2.5 向吸附柱中加入700μL的漂洗液，12000rpm转速离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

2.6 向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm转速离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

2.7 12000rpm转速离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置3-5min，晾干；

2.8 件吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜上悬空滴加50-100μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm转速离心1min；

2.9 离心所得洗脱液再放入吸附柱，室温放置2min，12000rpm转速离心2min，得到腺病毒基因组DNA。

PCR反应检测：

以提取的腺病毒DNA为模板，就行PCR扩增反应，上述第1-12引物对分别同时进行反应；

PCR反应体系如下：I5-MIX 25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 21μL，模板DNA 2μL；

PCR反应程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环，72℃5min。

实验结果如图1所示(图中：1-12分别代表第1-12对引物对，M为DNA Marker(DL2000))，第1-12引物对均能鉴定扩增出目的条带，且条带清晰，说明本实施例提供的第1-12引物对能很好的检测出腺病毒，且具有较好的特异性；在微量的模板的情况下通过PCR反应也能快速的检测出腺病毒。

实施例2

本实施例提供一种腺病毒的检测试剂盒，试剂盒包括实施例1中提供的第1引物对，第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺中的至少一种。

检测试剂盒的使用，参考实施例1的方法。

实施例3

本实施例提供一种腺病毒的测序引物，测序引物包括第二引物组合和实施例1提供的第一引物组合，第二引物组合包括第13-24引物对，第13-24引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.25-48所示。

本实施例提供的测序引物的使用，具体如下：

第一部分，测序样本的模板制备

样本的模板制备参考实施例1提供的样本的提取和腺病毒DNA的提取方法。

第二部分腺病毒DNA的测序，方法如下：

1.1 第1-24对引物，每对引物分别设置4个反应管，分别命名为A反应管、T反应管、C反应管和G反应管；

1.2 每个反应管中加入模板腺病毒DNA1μL、高保真Taq DNA聚合酶1μL，10×buffer缓冲液5μL、dNTPs(10mM each)2μL、MgSO₄2μL以及ddH₂O 35μL，上下游的引物各0.75μL；

1.3 在命名为A的反应管中另外加入双脱氧的ddATP 2.5μL，在命名为T的反应管中另外加入双脱氧的ddTTP 2.5μL，在命名为C的反应管中另外加入双脱氧的ddCTP 2.5μL，在命名为G的反应管中另外加入双脱氧的ddGTP 2.5μL；双脱氧的ddATP、双脱氧的ddTTP、双脱氧的ddCTP和双脱氧的ddGTP均用³²P标记；

1.4 进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性2Min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸120s，40个循环，68℃延伸5min；

1.5 每一个引物对的4的反应管单独进行琼脂糖糖凝胶电泳，然后放射自显影读取序列，不同引物对的序列拼接，获得腺病毒的基因组序列。

测序结果与已知腺病毒基因组序列通过应用软件DNAMAN进行序列比对，比对结果如图2所示，实验测序的结果通过比较与现有腺病毒的碱基序列一致，说明本实施例提供的测序引物对能准确的测序腺病毒的基因组，且特异性较高，反应温和，交底浓度的模板也可以进行测序。

实施例4

本实施例提供一种腺病毒的测序引物，测序引物包括实施例1提供的第一引物组合的第1-12引物对和第二引物组合，第二引物包括第13-24引物对，第13-24引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.25-48所示。

使用方法参考实施例3，区别在于：

本实施例中加入的双脱氧的ddATP用绿色荧光标记，双脱氧的ddTTP用红色荧光标记，双脱氧的ddCTP用黄色荧光标记，双脱氧的ddGTP用蓝色荧光标记。

PCR扩增反应结束后，反应产物通过毛细管电泳，在毛细管电泳上有荧光信号识别的仪，通过所识别的荧光信号仪器自动转换成对应的不同的碱基序列，最后不同的引物对测序的序列拼接成腺病毒的基因组序列。

测序结果与已知腺病毒基因组序列通过应用DNAMAN软件进行序列比对，序列比对结果如图2所示，实验测序的结果通过比较与现有腺病毒基因组的碱基序列一致，说明本实施例提供的测序引物对能准确的测序腺病毒的基因组，且特异性较高，反应温和，即使较低浓度的模板也可以进行测序。

实施例5

本实施例提供一种腺病毒的测序试剂盒，测序试剂盒包括实施例4提供的引物对；以及PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、ddNTPs、dNTPs和Mg²⁺中的一种或多种；ddNTPs包括用绿色荧光标记的双脱氧ddATP，红色荧光标记的双脱氧ddTTP，用黄色荧光标记的双脱氧ddCTP，用蓝色荧光标记的双脱氧ddGTP。

腺病毒的测序试剂盒的使用方法参考实施例4提供的方法。

综上所述，本发明实施例的提供的腺病毒检测引物能特异的识别腺病毒的基因组序列，快速高效的检测出腺病毒，多个引物同时使用，达到交叉验证的目的，使结果更准确可靠，应用该引物并制备检测腺病毒的试剂盒，能更方便快捷的检测腺病毒，具有较好的应用前景；提供的测序引物，能全面的覆盖腺病毒的基因组，扩增的片段长度合理，退火温度等参数较为适中，反应条件温和；能快速的得到并读取测序结果，使检测更为准确、方便和高效，有利于在实际中的应用，该测序引物制备的试剂盒能更方便的测序，使成本更低廉，结果也更可靠。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 刘媛

<120> 一种腺病毒检测、测序的引物组合及应用

<130> PA16031461SC

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 1

tttgggggtg gagtgttttt gc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 2

agtgcgggca ataaccaaat gat 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 3

atttgcggtg cttccgatga g 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 4

ggaccccagg tcacgtgaaa tac 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 5

catcaccacc tgagcgaggt t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 6

rtctgggcga tgtcagcgaa at 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 7

catcaccacc tgagcgaggt t 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 8

atcagtctca acgcactcaa aaagt 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 9

cagatgaggc cggactggta tac 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 10

gtgacatctg aggtggtgag caat 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 11

cgatgtatct ggaggaacgg ac 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 12

aagtaactca gcgtcgacgc ac 22

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 13

tgcttttaat taaatatgga gtagc 25

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 14

aggaacatgc agcagaaaag t 21

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 15

ttctaacacc tgctaccttt ttgat 25

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 16

acagcggggt atgcaaagtg t 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 17

cttggaagag gttccaaaaa tct 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 18

tggatacctc tgcctctgat tac 23

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 19

tacttttgga acagtcagct cttac 25

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 20

tttctaaggt gttctggtgg agta 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 21

caacttctag actggatcct tgtg 24

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 22

tcttccctct cctctcctgc t 21

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 23

aaccttgtca taatggagtt gcttc 25

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 24

gttgcaagtt aagcggatgt gac 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 25

aaaaggagca gtttatgcag act 23

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 26

ttaaagccaa ctcagatcta gcat 24

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 27

ccaacgtctg ggtgaacttt ct 22

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 28

ttcgaccagc aggatgagtc t 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 29

tctaaggcca tttgccattc tc 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 30

gtctcaggac tctggacagc tc 22

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 31

ggtgatgaaa ttaaagtagg cagt 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 32

ggaacgtatg gagtcttgta gatc 24

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 33

tgcatgatgg tctttagctg ac 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 34

acttcgctgc tacgtacact gt 22

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 35

ctcctactgc gcctacatct ac 22

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 36

agccaaggat gaaaaattga t 21

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 37

aaaccagata ctaaaatgaa accat 25

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 38

tgaagtcttt gtaattgacc tcat 24

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 39

ttgcaggtct gcctacccat 20

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 40

atgttgacag caatggctga gt 22

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 41

ttaacaattt tcgctctttc atc 23

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 42

gtcgcgtgaa ggatatgttt c 21

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 43

tgaattaaga ctctcctacg gact 24

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 44

tagtgtgcag tttgagccta tagt 24

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 45

tacaccctgc tgaagaccct at 22

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 46

cagatatgag ttttggctgg agt 23

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 47

caagagcagg acacgctaca gt 22

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> human adenovirus

<400> 48

acaaaaaaca gccaatatag cct 23