一种检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及动物病原分子诊断
技术领域：
，特别涉及一种检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可以引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称“蓝耳病”。该病是一种高度接触性传染病，在世界各国引发了空前的“流产风暴”，给世界养猪业造成巨大的经济损失，现已成为规模化猪场繁殖障碍和呼吸道疾病的主要疫病之一。PRRSV主要导致生产母猪出现繁殖障碍、仔猪出现呼吸系统疾病、公猪精液品质下降，其中感染仔猪会导致极大的病死率，感染育肥猪后会导致长期持续感染带毒，引起猪群周期性反复暴发PRRS，很难彻底净化。同时PRRSV造成猪群的免疫抑制，引起免疫失败和继发感染，临床症状变得复杂难辨。PRRSV属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为单股正链呈卵圆形或球形的RNA病毒。2006年夏季以来，我国安徽等省暴发以猪体温升高、皮肤发红和呼吸急促等为主要临床症状的猪传染病，经多个实验室研究表明，引起本病的最主要病原为变异的PRRSV(高致病性PRRSV变异株)。经过对分离的PRRSV株全序列测序表明：病原的基因序列变化主要是在NsP2基因上非连续缺失了约30个氨基酸残基(90个碱基)。当前实验室常用的诊断猪繁殖与呼吸综合征的方法包括免疫学诊断方法和病原检测方法。免疫学诊断方法可用于抗体检测与病原的间接检测，主要包括以下方法：(1)血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)。由于PRRSV具有凝集血细胞的特性，因此可用HA-HI试验来检测其血凝效价和抗体水平。虽然该方法可进行批量的快速检测，但其敏感性低且特异强不强，只能进行种辅助诊断。(2)血清中和试验(HI)。可用于猪感染PRRSV后的抗体检测，但由于其操作较为复杂，因此限制了其在生产上的应用。(3)乳胶凝集试验(LAT)。较之HA、HI，LAT更经济、快捷，具有良好的应用前景。该方法的不足之处在于只能用于疾病的定性诊断，不能对血清中的抗体滴度或病原含量作出定量评估。(4)酶联免疫吸附试验(ELISA)。ELISA方法常用于检测PRRSV血清抗体，具有简便、快速、准确等优点，因而广泛用于猪场的常规检测。(5)胶体金标记技术(SECGA)。胶体金标记技术是三大免疫标记(荧光素、放射性同位素和酶)的又一大补充。该方法具有敏感性高和特异性强、且使用方便、便于基层使用等优点，而缺点在于诊断结果受主观因素的影响比较严重，一般用于初期筛查。(6)免疫荧光技术(IFA)。免疫荧光技术主要分为直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术，而针对PRRSV的检测多选用后者。免疫荧光技术具有快速、特异、敏感等优点，但在临床应用过程中常受到试验条件的限制。(7)免疫组织化学法(immunohistoehemistry，IHC)。可以在石蜡切片、冰冻组织和细胞制品上检测病原，亦可用于对动物体内病原的动态分布、半定量等的研究。病原检测方法主要包括以下方法：(1)病毒分离鉴定。PRRSV分离的首选材料是猪脾脏、淋巴结、扁桃体和猪肺泡巨噬细胞。PRRSV分离培养需选用猪肺泡巨噬细胞(PAM)，PAM来自6-8周龄的猪，这种原代细胞不是所有实验室都易获取。Marc-145传代细胞系可替代PAM，但不支持所有分离株的生长。PRRSV分离最大的缺点是耗时长，需要7-14天才能完成。(2)核酸探针技术。核酸探针技术是一种分子水平的检测技术，特别适用于疾病的早期诊断，应用最广泛的核酸探针技术是基因芯片，通过核酸探针与模板进行杂交，在有限的载体上可对高通量的样本或目的基因进行检测。目前来说，该技术需要大型检测仪器支持，因此仅适合在实验室或大型检测机构应用。(3)聚合酶链式反应检测技术(PCR)。20世纪生物学领域最伟大的发明，整个分子生物学发展的基础之一，应用领域最为广泛，技术最为成熟。赵志权等参照GeneBank已发表的PRRSV的Nsp2基因，设计了1对引物，建立了一种RT-PCR检测方法。该方法可以区分高致病性PRRSV毒株与经典PRRSV弱毒疫苗株。刘忠华等根据高致病性PRRSVNsp2基因的缺失信息，设计了3条特异性引物，以含高致病性PRRSV的Nsp2基因的质粒及普通PRRSVVR2332株RNA为模板，建立了快速诊断高致病性PRRSV的RT-PCR方法。郝晓芳等在高致病性PRRSVNsp2基因缺失区两端的保守区设计并合成了一对引物，建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段，扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段，根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。但是现有的检测方法存在以下不足：①检测时间较长。基于病毒粒子的检测方法，如病毒分离培养、电镜观察等技术需要进行前期准备、细胞培养、病毒分离纯化、制样等，需要长时间乃至数月之久才能获得最终结果，难于做到快速诊断；基于普通PCR的检测方法，需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。②操作复杂，技术要求高。操作过程相对繁琐，且对操作人员技能要求较高，一般需要专业专职人员负责。③结果相对不可靠。免疫荧光与ELISA技术依赖抗体抗原反应，可能出现不可避免的交叉反应。在检测方法中检测步骤越多，过程越繁琐，出现差错的几率增加，且环境中存在的交叉污染造成结果的不准确。同时很多技术主要针对实验室检测，临床应用较少，缺少相应的质量控制及标准化。④需要复杂的仪器设备。为保证检测结果可被观察，现有技术每个步骤均得依赖于仪器设备，某些仪器设备如电镜等，过于庞大和贵重，一般检测机构难于承受，难于在基层推广。⑤检测成本高。繁琐又长时间的检测及设备的维护，一方面需要投入人力、物力较多，另一方面结果的不确定亦造成检测的重复，成倍的增加成本。目前的检测多是在规模化猪场出现疑似PRRS的疫情后，送检患病猪的病料(包括流产或死产胎儿的脑、肺、肝、肾和母猪胎盘)，利用常规RT-PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。一方面由于这种“事后”检测导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性，无法做到未雨绸缪。另一方面，常规RT-PCR方法操作时间较长，操作过程中容易发生污染。实时荧光定量RT-PCR方法建立在常规RT-PCR方法之上，是同化学染料或荧光标记核酸探针的有机结合，敏感度更高、特异性更强、重复性更好，并且通过可视化设备监测扩增反应，无需电泳，省时省力、快速准确。对于初期感染PRRSV且感染猪群体内的病毒含量较低时，此种方法能做出准确判断，对于防治和治疗PRRSV的爆发可以发挥重要的作用。猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PRRSV可经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化，引起繁殖障碍相关症状，且鉴于猪的多病毒混合感染非常严重，因此采用从仔猪脐带血中检测PRRSV来评价及预警猪蓝耳病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。技术实现要素：本发明的目的在于提出一种检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪PRRSV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群PRRSV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。基于上述目的，本发明提供了一种检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物vPRRSV-f：5’-GTGGGTCGGCYCCARTTC-3’，其为SEQIDNO:1序列，其中R为碱基A或G，Y为碱基T或C；下游扩增引物vPRRSV-r：5’-AAAGCCTCATATTCMGTYTG-3’，其为SEQIDNO:2序列，其中M为碱基A或C，Y为碱基T或C；特异性荧光探针vPRRSV-p：VIC-5’-CTGTRACAACAACGCTGACG-3’-BHQ1，其为SEQIDNO:3序列，其中R为碱基A或G，VIC为荧光报告基团，BHQ1为非荧光淬灭基团。合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光RT-PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。高致病性PRRSV变异株以基因组非结构蛋白nsp2编码区不连续30个氨基酸缺失为特征，高致病性PRRSV变异株的非结构蛋白nsp2编码区、编码结构蛋白GP5和GP3的ORF5、ORF3是基因组的易变区域，特别是nsp2编码区、ORF5基因的变异反映出高致病性PRRSV毒株的多样性。高致病性PRRSV变异株的易变异性、遗传多样性和致病性差异给该病的防控增加了难度。广泛的变异性和毒株的多样性是高致病性PRRSV变异株显著的特征之一，成为控制猪繁殖与呼吸综合征所面临的难题。本发明对GenBank中公布的TJ、JXA1、Hun等高致病性PRRSV变异株流行毒株基因序列进行对比分析，在高致病性PRRSV变异株基因组高变基因nsp2的非连续缺失区前后筛选出一段高度保守的基因片段，该基因片段大小为109bp，作为本发明设计引物的靶片段。发明人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本发明的引物和探针。该引物为只针对高致病性PRRSV变异株的通用上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区109bp片段间设计了高致病性PRRSV变异株高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与高致病性PRRSV变异株核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增高致病性PRRSV变异株核酸，同PRRSV经典株及其它常见感染猪的病毒无交叉。高致病性PRRSV变异株具有易变异性、遗传多样性和致病性差异，所以设计检测范围更广泛、特异性更强的引物和探针难度很大。发明人考虑到扩增的高致病性PRRSV变异株的范围更宽，设计兼并碱基，即本发明的引物和探针含有兼并碱基，因此该引物和探针的广泛性和特异性强，灵敏性好。在本发明中，优选的，所述上游扩增引物vPRRSV-f、所述下游扩增引物vPRRSV-r和所述特异性荧光探针vPRRSV-p的摩尔比为2:2:1。在本发明中，优选的，所述上游扩增引物vPRRSV-f、所述下游扩增引物vPRRSV-r和所述特异性荧光探针vPRRSV-p在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.4μM。在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。在RT-PCR反应体系中加入荧光RT-PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本发明的荧光RT-PCR反应液中还含有dNTPs、反转录酶、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl2、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。在本发明中，优选的，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株nsp2基因序列的克隆质粒pEASY-Vnsp2，克隆质粒pEASY-Vnsp2的终浓度为1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL。在本发明中，优选的，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株nsp2基因109bp目的片段的核苷酸序列如下所示：GTGGGTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTAACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTT，其为SEQIDNO:4序列。在本发明中，优选的，所述克隆质粒pEASY-Vnsp2采用以下方法制备得到：提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株RNA，利用引物vPRRSV-f和vPRRSV-r一步法扩增得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株nsp2基因序列，通过TA克隆将该高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株nsp2基因序列连接至pEASY-T1载体，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-Vnsp2。进一步的，本发明还提供了一种所述的检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)使用所述的实时荧光RT-PCR试剂盒进行扩增时，反应体系以20μL计为：荧光RT-PCR反应液(含酶)：16μL；10μMSEQIDNO:1所示的上游扩增引物vPRRSV-f：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游扩增引物vPRRSV-r：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特异性荧光探针vPRRSV-p：0.2～0.4μL；RNA模板：2μL；ddH2O：补足至20μL；(2)实时荧光RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应；(3)结果分析：质量控制：阴性对照VIC通道检测无Ct值；阳性对照VIC通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；结果判定：VIC通道检测Ct值≤40，则判定样品为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染阳性；VIC通道检测无Ct值，则判定样品为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染阴性。在本发明中，优选的，所述RNA模板采用以下方法制备得到：(1)取50-200mL猪脐带血置1.5mLEP管中，加入1mL裂解液充分匀浆，室温静置5min；所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS0.1-0.2％；③吐温201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；(2)加入0.6mL异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；(4)加入0.5mL异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；(6)加入1mL质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；(7)晾干，加入适量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速电泳检测RNA完整性。本发明在核酸提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温20，NP40，异丙醇和质量百分比为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。在本发明中，为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值，对待检脐带血中提取的RNA模板浓度、引物浓度和特异性荧光探针的浓度进行了优化，尤其是探针的浓度。引物浓度过低会影响扩增效率，引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且增加引物之间形成二聚体的机会，同样特异性荧光探针浓度过低会引起特异性的荧光信号变弱，而浓度过高则会引起探针与模板发生非特异性结合，产生非特异性荧光信号从而干扰特异性荧光信号，待检脐带血中提取的RNA模板浓度会影响PCR扩增的效率，应根据目的基因的大小选择合适的RNA模板浓度。本发明经过一系列优化试验，最终确定本发明的荧光RT-PCR反应体系和反应条件，采用本发明的实时荧光RT-PCR方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的扩增效率接近100％，并可获得最小的Ct值。进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株试剂中的用途。本发明针对高致病性PRRSV变异株nsp2基因设计通用引物和特异性探针，通过对待检脐带血中提取的RNA模板浓度、引物浓度以及特异性探针浓度等进行优化，建立了检测仔猪脐带血中高致病性PRRSV变异株的实时荧光RT-PCR方法。灵敏度试验结果表明，该方法的检测范围为108-101copies/μL，可以从高致病性PRRSV变异株感染脐带血中检测到最低10copies的病毒含量的样品，灵敏度是常规RT-PCR方法的300倍。特异性试验结果表明，该方法对PCV、PRV、PPV、CSFV、PRRSV经典株、PEDV与TGEV的细胞培养物及正常细胞均无非特异性反应，说明该方法特异性和可靠性强。准确性试验结果表明，对于阳性对照与阴性对照的检测，该方法与常规RT-PCR方法检测结果100％符合；对于临床样品的检测，该方法检测高致病性PRRSV变异株阳性19/125，常规RT-PCR方法检测高致病性PRRSV变异株阳性12/125，且后者检测的12份样品使用实时荧光RT-PCR方法检测均为阳性，说明该方法不仅准确性高，而且更敏感。重复性试验结果表明，该方法对107copies/μL、106copies/μL和105copies/μL浓度的阳性对照pEASY-Vnsp2克隆质粒检测变异系数(CV)均小于3％，具有较好的重复性。鉴于以上原因，本发明是利用实时荧光RT-PCR方法代替常规RT-PCR方法，并制备成试剂盒，主要通过检测猪脐带血中是否含有目前较为流行和危害更严重的高致病性PRRSV变异株核酸，评估及预警猪群PRRSV变异株的感染状况，及时制定防控计划。同时，本发明的方法亦可用于对发病猪病料组织的检测，检测更准确、快速。综上所述，本发明建立的检测仔猪脐带血高致病性PRRSV变异株的实时荧光RT-PCR方法和基于该方法建立的试剂盒具有准确度高，灵敏度高，特异性强和重复性优的特点，可以用于高致病性PRRSV变异株感染的病原学研究、早期诊断，对高致病性PRRSV变异株的快速诊断、综合防控、病原净化和早期治疗具有重要意义。本发明试剂盒检测快速、准确、敏感，更适用于脐带血中微量的高致病性PRRSV变异株检测。本发明应用实时荧光RT-PCR检测仔猪脐带血中高致病性PRRSV变异株的工作原理：猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。高致病性PRRSV变异株可经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化，引起繁殖障碍相关症状，且鉴于猪的多病毒混合感染非常严重，因此采用从仔猪脐带血中检测高致病性PRRSV变异株来评价及预警猪蓝耳病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。基于脐带血的检测步骤为：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)实时荧光RT-PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行；(5)判定结果。本发明还提供了一种脐带血的采集方法，具体步骤如下：(1)取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；(2)当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可；若母猪分娩出现木乃伊、死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；(3)脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；(4)将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。本发明脐带血的采集方法克服现有常规采血技术的耗时长、采血困难、对猪只应激大等问题，脐带血采集简单、方便、快捷和无应激。与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：(1)本发明的检测方法克服了常规检测技术耗时长、敏感度低、安全系数低、抗污染能力差和不能准确定量等问题，检测快速高效，不会造成样品交叉污染。(2)本发明的检测方法准确度高，灵敏度高，特异性强，重复性优，可以实现较大通量样品的检测。(3)本发明的检测方法不仅适用于检测脐带血检测，还适用于待检猪的脾脏、淋巴结、血清及血浆等样品，可用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。(4)在日常高致病性PRRSV变异株脐带血虽然含毒量相对于组织而言要低，在实际应用中也对组织及对应脐带血进行了相互印证，确保本发明检测方法的特异性及敏感性。(5)本发明运用一步法实时荧光RT-PCR技术，通过一个PCR反应，就可以从脐带血、血液与组织样品中检测出是否有高致病性PRRSV变异株存在，操作简单操作时间短，做一次病原检测仅需要2-3小时，快捷迅速、节约成本；而且需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广。附图说明图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；图2为本发明敏感性检测结果图；图3为本发明特异性检测结果图。图4为本发明重复性检测结果图；具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。实施例1检测仔猪脐带血高致病性PRRSV变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒的组成(1)荧光RT-PCR反应液(含酶)：该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等；(2)上下游引物组vPRRSV-f和vPRRSV-r：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成浓度为10μM。上游扩增引物vPRRSV-f：5’-GTGGGTCGGCYCCARTTC-3’，其为SEQIDNO:1序列，R为碱基A或G，Y为碱基T或C；下游扩增引物vPRRSV-r：5’-AAAGCCTCATATTCMGTYTG-3’，其为SEQIDNO:2序列，M为碱基A或C，Y为碱基T或C；(3)特异性荧光探针vPRRSV-p：由华大基因公司合成，用DEPC水配制成浓度为10μM。特异性荧光探针vPRRSV-p：VIC-5’-CTGTRACAACAACGCTGACG-3’-BHQ1，其为SEQIDNO:3序列，R为碱基A或G，其中VIC为荧光报告基团，BHQ1为非荧光淬灭基团；本发明对GenBank中公布的TJ、JXA1、Hun等PRRSV高致病性变异株流行毒株基因序列进行对比分析，在高致病性PRRSV变异株基因组高变基因nsp2的非连续缺失区前后设计了上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区109bp片段间设计了高致病性PRRSV变异株高保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与高致病性PRRSV变异株核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增高致病性PRRSV变异株核酸，同PRRSV经典株及其它常见感染猪的病毒无交叉。(4)阳性对照为克隆有高致病性PRRSV变异株nsp2基因片段的重组质粒pEASY-Vnsp2，由本实验室构建，质粒在紫外分光光度计OD260nm测定质量浓度，按公式6.02×1023×(Xng/μL×10-9)/DNAlength×660换算为拷贝数，配制浓度为1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL；其中，克隆质粒pEASY-Vnsp2的构建方法如下：①按照商业试剂盒操作说明书提取PRRSV变异株核酸；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作为特异性引物一步法扩增nsp2基因109bp目的片段，反应条件为：42℃逆转录60min；95℃预变性5min；95℃变性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；②PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit胶回收试剂盒回收，通过TA克隆将PRRSV变异株nsp2基因中109bp目的片段克隆至pEASY-T1载体，然后转化Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-Vnsp2。在本发明中，所述高致病性PRRSV变异株nsp2基因109bp目的片段的核苷酸序列如下所示：GTGGGTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTAACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTT(SEQIDNO:4)。(5)阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH2O；(6)使用说明书。实施例2检测仔猪脐带血高致病性PRRSV变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒的使用方法本发明试剂盒使用方法具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)实时荧光RT-PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测；(5)判定结果。1.样品采集(1)脐带血样品采集a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。(2)病料样品(扁桃体、肾脏、肺脏和淋巴结等)A、剖解取内脏：将患病猪剖解，取出完整的上述内脏，放置在同一个干净塑料袋内。B、记录：将装有内脏的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。2.样品RNA提取(1)取50-200mL猪脐带血置1.5mLEP管中，加入1ml裂解液充分匀浆，室温静置5min；所述病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％；(2)加入0.6mL异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；(4)加入0.5mL异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；(6)加入1mL质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；(7)晾干，加入适量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速电泳检测RNA完整性。为监测提取过程中的污染，建议在提取样本的同时提取一管水作为阴性对照。本发明在核酸提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温20，NP40，异丙醇和质量百分比浓度为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。依据上述方法提取6份随机脐带血样品总RNA，经核酸蛋白检测仪检测，浓度均能达到0.207μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之间，表明RNA纯度高、完整性好，具体数据见表1。表1RNA质量检测结果样品编号体积(μl)浓度(μg/μl)总量(μg)A260/A280质量评价001300.37011.11.93合格002300.2076.211.91合格003300.2326.961.92合格004300.2517.531.95合格005300.2768.281.99合格006300.2958.851.93合格3.荧光RT-PCR反应对实时荧光RT-PCR反应体系和反应条件进行优化，优化原则为：通过优化使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。经过优化，实时荧光RT-PCR反应体系和反应条件如下所示：(1)实时荧光RT-PCR反应体系以20μL计为：10μMSEQIDNO:1所示的上游扩增引物vPRRSV-f：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游扩增引物vPRRSV-r：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特异性荧光探针vPRRSV-p：0.2～0.4μL；荧光RT-PCR反应液(含酶)：16μL；RNA模板：2μL；ddH2O：补足至20μL。同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒pEASY-Vnsp2：2μL，其余组分相同；阴性对照无RNA酶与DNA酶的ddH2O：2μL，其余组分相同。(2)荧光RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。(3)结果分析：质量控制：阴性对照VIC通道检测无Ct值；阳性对照VIC通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；结果判定：VIC通道检测Ct值≤40，则判定样品为高致病性PRRSV变异株感染阳性；VIC通道检测无Ct值，则判定样品为高致病性PRRSV变异株感染阴性。实施例3检测仔猪脐带血高致病性PRRSV变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒的验证1.试剂盒扩增效率验证将阳性对照克隆质粒pEASY-Vnsp2进行10倍梯度稀释，使其拷贝数为：108-101copies/μL，每个梯度重复三次进行高致病性PRRSV变异株实时荧光RT-PCR检测，根据扩增结果制作标准曲线。图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度扩增标准曲线(VIC通道)，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.35，截距：41.06，相关系数：1.00，扩增效率：0.99。综上，说明该试剂盒检测高致病性PRRSV变异株核酸的扩增效率均达到近100％。2.灵敏度试验以10倍梯度稀释的阳性对照克隆质粒pEASY-Vnsp2作为模板，进行本发明试剂盒的灵敏度检测，检测范围为108-101copies/μL。结果表明，该方法的检测范围为108-101copies/μL，在此范围的病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到最低10个拷贝数的高致病性PRRSV变异株核酸含量的样品，检测结果见图2。3.特异性试验为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测检测猪圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、PRRSV经典株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的提取核酸。检测结果表明：本发明的试剂盒仅对高致病性PRRSV变异株进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增高致病性PRRSV变异株，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，检测结果见图3。4.重复性检测选用阳性对照pEASY-Vnsp2克隆质粒107、106、105copies/μL，对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测变异系数(CV)均小于3％，具有较好的重复性。检测结果见表2和图4。表1实时荧光RT-PCR检测高致病性PRRSV变异株的重复性试验5.准确性临床验证使用本发明的试剂盒同普通RT-PCR方法对累计125份脐带血样品以及5份健康的脐带血样品进行了高致病性PRRSV变异株检测，结果表明，对于临床样品的检测，该试剂盒方法检测高致病性PRRSV变异株19/125，常规RT-PCR方法检测高致病性PRRSV变异株阳性12/125，且后者检测的12份样品使用该试剂盒方法检测均为阳性，说明该试剂盒方法更敏感，检出率及准确性更高；对于高致病性PRRSV变异株阴性临床样品的检测，该试剂盒方法检测结果同常规RT-PCR方法一致。表3采用本发明试剂盒以及普通RT-PCR对临床样品进行检测结果的比较综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条特异性荧光探针以及构成的实时荧光RT-PCR试剂盒可以快速检测仔猪脐带血中的高致病性PRRSV变异株，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>湖南新南方养殖服务有限公司<120>一种检测仔猪脐带血高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途<130>FI160699-ND<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gtgggtcggcyccarttc18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2aaagcctcatattcmgtytg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgtracaacaacgctgacg20<210>4<211>109<212>RNA<213>高致病性PRRSV变异株nsp2基因序列<400>4gtgggtcggcaccagttcctgcaccgcgtagaactgtaacaacaacgctgacgcaccagg60atgagcctctggatttgtctgcgtcctcacagacggaatatgaggcttt109当前第1页1 2 3