一种区别clade2.3.2.1和clade2.3.4H5AIV的PCR‑RFLP方法与流程

本发明涉及兽医传染病快速诊断技术领域，特别涉及一种区别clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5亚型禽流感病毒(AIV)的PCR-RFLP方法。

背景技术：

禽流感(Avian influneza，AI)是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病。高致病性H5亚型禽流感病毒(H5 subtype avian influenza virus,H5 AIV)引起的感染目前被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病，在我国被列为一类动物疫病。

关于流感的最早记录可追溯到1878年来自意大利的一次报道，随后世界各地陆续发生流感的暴发和流行。1996年，在我国分离到的第一株H5N1亚型HPAIV(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)，GS/GD/96)，紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感染人事件，这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。由于从祖源病毒GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一，为此WHO、FAO和OIE联合制定了H5N1 HPAIV统一分类准则将H5N1 HPAIV分为0～9共计10个不同clade，其中clade 2.3.4最早于2003～2006年间流行于中国、越南、泰国、老挝和马来西亚等地的病毒株，2006～2009年clade 2.3.4分支在我国很多地区是优势流行株，而2010年后逐渐被clade 2.3.2.1分支取代，但clade 2.3.4分支依然在我国很多地区流行,并存在两种病毒共存的现象。针对clade 2.3.4分支我国已选取A/duck/Anhui/1/2006毒株为HA和NA的供体，研制出Re-5株疫苗，并以2012年投入使用，同时以A/duck/Guangdong/S1322/2006为HA和NA基因供体研制Re-6株疫苗来控制clade 2.3.2.1分支病毒的流行，对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5 AIV相应疫苗的科学使用。

然而，clade 2.3.2.1和clade 2.3.4二者之间的基因序列核苷酸同源率大于94.3％(以经典毒株的同源率为例)，很难通过常规的分子生物学方法(如常规RT-PCR方法)进行鉴别。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)是近年来以基因位点差异而引起内切酶位点 不同的一种分子生物学标记技术，已广泛应用于真核细胞基因组种群内、种群间(基因差异往往很小)的分型研究工作中，应用RFLP技术可对DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。

目前，仅需要1组引物并结合clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5 AIV血凝素(HA)基因的核苷酸特征，利用DraⅠ酶进行RFLP酶切分析对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4H5 AIV进行鉴别诊断。本发明检测方法快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种区别clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法。该方法能有效区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5 AIV感染，为水禽业健康养殖提供技术保证。

一种区别clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5 AIV的PCR-RFLP方法，包括以下步骤：

1)从检测样品中分别提取H5亚型流感病毒clade 2.3.2.1和clade 2.3.4病毒的核酸RNA；

2)用引物P1和P2同时对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5 AIV核酸RNA进行RT-PCR扩增，得到相应的HA基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小为603bp；

3)取RT-PCR扩增产物，经DraⅠ酶切后进行RFLP分析。

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)的扩增引物的序列为：

上游引物P1：5’-ATGCAAACAACTCGACAG-3’，

下游引物P2：5’-ATCTCTGGTTTAGTGTTGATGT-3’。

优选地，上述技术方案中，所述步骤3)中，DraⅠ酶切位点位于clade 2.3.2.1分支的H5亚型流感病毒血凝素基因HA的扩增产物的131-136位，clade 2.3.2.1分支的H5亚型流感病毒血凝素基因HA的扩增产物可被切成2段，大小分别为133bp和470bp；而clade 2.3.4分支的H5亚型流感病毒血凝素基因HA的扩增片段中没有DraⅠ酶切位点，被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为603bp。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明鉴定方法简单，快捷和准确率高：本发明对147份临床采集的流感症状死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR检测，经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收后进行DraⅠ酶切，其中clade 2.3.2.1 H5 AIV分支8株，阳性率为5.44％(8/147)；clade 2.3.4 H5 AIV分支10株，阳性率为6.80％(10/147)；检测到clade 2.3.2.1和clade 2.3.4分支H5 AIV共感染1株，阳性率为0.68％(1/147)。

本发明在操作中，仅需上游引物P1和下游引物P2，并仅需常规限制性内切酶DraⅠ进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明在clade 2.3.2.1和clade 2.3.4分支H5 AIV快速鉴别诊断检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。当前，针对clade 2.3.4 H5 AIV的疫苗(Re-5株)和clade 2.3.2.1 H5 AIV的疫苗(Re-6株)已研制成功，对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫苗的科学使用。

附图说明

图1为根据本发明一种区别clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV的PCR-RFLP方法的上下游引物扩增区域对两种病毒血凝素HA基因的扩增区域存在核苷酸差异图。

图2为根据本发明一种区别clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV的PCR-RFLP方法的电泳图。

其中：泳道M-DNA分子量标准2000；1-clade 2.3.2.1 H5 AIV的RT-PCR产物；2-clade 2.3.4 H5 AIV的RT-PCR产物；3-clade 2.3.2.1 H5 AIV的RT-PCR产物的酶切图；4-clade 2.3.4 H5 AIV的RT-PCR产物的酶切图；5-clade 2.3.2.1和clade 2.3.4 H5 AIV共感染的RT-PCR产物的酶切图，6-阴性对照。

图3为根据本发明一种区别clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV的PCR-RFLP方法的阳性样品的RT-PCR产物克隆测序图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

1、提取病毒的核酸RNA；

(1)病毒来源：

H5亚型流感病毒clade 2.3.4分支(CX1株)和clade 2.3.2.1分支(DY1株)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

(2)提取病毒RNA：

用常规方法分别提取clade 2.3.4分支(CX1株)和clade 2.3.2.1分支(DY1株)H5 AIV的核酸RNA，以备RT-PCR扩增使用。

2、RT-PCR扩增

(1)扩增引物的设计和选择：

根据clade 2.3.4 H5 AIV和clade 2.3.2.1 H5 AIV的HA基因特征设计上游引物P1和下游引物P2，其中，引物的序列如下：

上游引物P1：5’-ATGCAAACAACTCGACAG-3’，

下游引物P2：5’-ATCTCTGGTTTAGTGTTGATGT-3’。

如图1所示：本发明设计的上下游引物扩增区域对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV血凝素HA基因的扩增区域存在核苷酸差异(H5亚型流感病毒clade 2.3.4血凝素基因HA核苷酸序列为TTTAAG，而H5亚型流感病毒clade 2.3.2.1血凝素HA基因HA核苷酸序列为TTTAAA(DraⅠ酶切位点)。

(2)RT-PCR扩增：

用上述设计的特异性引物P1和P2进行RT-PCR扩增，扩增反应体系如下：

采用Trans ScriptⅡOne-Step RT-PCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)推荐的RT-PCR扩增反应体系(40μL，见表1)。其中，提取的病毒RNA模板2μL、上游引物P1(10μM)1μL、下游引物P2(10μM)1μL、2×One-Step Reaction Mix 20μL、Trans ScriptⅡOne-Step Enzyme Mix1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL。

表1：RT-PCR反应体系

RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30min后进行PCR扩增。条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存备用。

(3)凝胶电泳检测：

扩增产物用常规的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像，结果如图2所示。

如图2所示：在上述条件下，clade 2.3.4 H5 AIV(泳道1)和clade 2.3.2.1 H5 AIV(泳道2)的样品均可以扩增出一条大小为603bp的片段。

3、RFLP分析

将RT-PCR产物经胶回收后，利用RFLP进行DraⅠ酶切分析。酶切体系如下：

采用QuickCut DraⅠ(购自宝生物工程(大连)有限公司)推荐的酶切反应体系(30μL，见表2)，其中RT-PCR胶回收产物20μL、10×QuickCut Buffer3μL、QuickCut DraⅠ酶1μL，补充灭菌去离子水6μL至终体积30μL。

反应条件：37℃水浴反应10min。

表2：酶切反应体系

反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV类型，结果如图2所示。

如图1所示：DraⅠ酶切位点位于clade 2.3.2.1病毒血凝素基因HA的扩增产物的131-136位(TTTAAA)；clade 2.3.4 H5 AIV血凝素基因HA的扩增片段中没有DraⅠ酶切位点，此处序列为TTTAAG。

如图2所示：clade 2.3.2.1 H5 AIV可被切成2段，大小分别为133bp和470bp(泳道3)；而clade 2.3.4 H5 AIV血凝素基因HA的扩增片段中没有DraⅠ酶切位点，被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为603bp(泳道4)。

4、临床应用

本发明对147份临床采集的流感症状死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR检测，经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收后进行DraⅠ酶切，其中clade 2.3.2.1 H5 AIV分支8株，阳性率为5.44％(8/147)；clade 2.3.4 H5 AIV分支10株，阳性率为6.80％(10/147)；检测到clade 2.3.2.1和clade 2.3.4分支H5 AIV共感染1株，阳性率为0.68％(1/147)。

随机选取检测为H5亚型流感病毒clade 2.3.4阳性1个样品(clade 2.3.4阳性1)、H5亚型流感病毒clade 2.3.2.1阳性1个样品(clade 2.3.2.1阳性1)以及检测为clade 2.3.4分支和clade 2.3.2.1分支H5AIV共感染1个样品(记为clade 2.3.4混合阳性1和clade 2.3.2.1混合阳性1)的RT-PCR产物进行克隆测序，结果符合预期。clade 2.3.4阳性1在此处核苷酸序列均为TTTAAG；clade 2.3.2.1阳性1在此处核苷酸序列均为TTTAAA；检测为clade 2.3.4分支和clade 2.3.2.1分支H5AIV共感染1个样品中记为clade 2.3.4混合阳性1在此处核苷酸序列均为TTTAAG且记为clade 2.3.2.1混合阳性1在此处核苷酸序列均为TTTAAA，均符合引物设计时的基因特征，结果如图3所示。

本发明的优点在于，其仅需上游引物P1和下游引物P2，并仅需限制性内切酶DraⅠ进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程。

本发明在H5亚型流感病毒clade 2.3.4分支和clade 2.3.2.1分支快速鉴别诊断检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。当前，针对clade 2.3.4 H5 AIV的疫苗(Re-5株)和clade 2.3.2.1 H5 AIV的疫苗(Re-6株)已研制成功，对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5 AIV相应疫苗的科学使用。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。