一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法与流程

本发明涉及一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法。

背景技术：

海参是我国北方沿海地区海水养殖中产值最大的一个品种。近年来，随着养殖规模的迅速扩张及生产过程中的不规范操作，养殖海参疾病发生严重，造成巨大的经济损失。其中“化皮病”是目前流行最严重的疾病，该病主要由细菌感染所致，黄海希瓦氏菌是引起北方地区海参化皮病的重要病原菌。

目前，海洋微生物检测方法一般为生化检测法，但该方法存在培养周期长，操作繁琐，特异性差等缺点。同时，由于自然环境中仅有小于1％左右的微生物为可培养，而基因芯片不需要活的细菌，只需有DNA即可。细菌检测基因芯片的涉及多采用细菌学上较保守的基因，比如被称为细菌进化的“活化石”16S rRNA基因，而16S rRNA基因由于信息位点较少，因此构建的系统稳定性较差，用于鉴定亲缘关系较接近的细菌，容易产生偏差，引起假阳性，影响检测结果的准确性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可快速、高效、准确的海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法。

本发明的技术解决方案是：

一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法，其具体步骤如下：

(1)基因芯片的制作

用于检测的两组探针SM1和SM2，探针序列如下：

SM1(5’-3’)：CTTCTCGGATGTCGAGTTCCACTTCGA；

SM2(5’-3’)：TCTGAAAAGCTACAGTTAACCATTCGTCGT；

将SM1和SM2在5’端加上15个T的间隔臂，并在探针5’端进行氨基修饰；用双蒸水将经氨基修饰的探针稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；使用点样仪在醛基化基片上进行非接触式点样，然后将点样后的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测海参致病菌黄海希瓦氏菌的基因芯片；

(2)待测样品DNA提取

将环境中的水样、泥样或生物样品进行取样，然后提取待测样品的DAN，备用；

(3)样品PCR扩增

用于黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)引物是：

SM1和SM2探针使用的引物基因序列如下：

上游引物：TGCACGCGGGTGGTAAGT；

下游引物：TGAGGTAATCAACAAAGGCAC；

将步骤(2)提取的样品的DNA作为扩增模板，以探针对应的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(4)PCR扩增产物与芯片杂交

将PCR扩增产物进行荧光标记，将基因芯片进行预杂交，然后，将经荧光标记后的PCR扩增产物与经预杂交的基因芯片进行杂交，离心干燥后，放于微阵列芯片扫描仪上检测，收集检测结果。

进一步的，步骤(3)进行PCR扩增时，首先在95℃预变性5min；然后95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

进一步的，预杂交时，使用鲑精DNA用预杂交缓冲液稀释后进行预杂交。

进一步的，预杂交缓冲液与鲑精DNA的体积比为10:1。

本发明的有益效果：

通过使用DNAgyrase subunit B为靶基因设计的检测黄海希瓦氏菌的特异性探针，能快速高效检测海参致病菌黄海希瓦氏菌，并且具有更加特异性和敏感性的特点，提高了鉴定海参养殖区环境及生物体致病菌黄海希瓦氏菌的能力，极大地缩短了检测时间，有效预防“化皮病”的发生和蔓延。

附图说明

图1为黄海希瓦氏菌SM1特异性探针基因芯片验证结果图；

图2为黄海希瓦氏菌SM2特异性探针基因芯片验证结果图；

图3为黄海希瓦氏菌SM1和SM2特异性探针基因芯片的检测结果；

图4为副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用SM1和SM2特异性探针基因芯片的检测结果。

具体实施方式

实施例1探针的设计及合成

1、目标检测菌种及靶基因

本发明选择海参养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌黄海希瓦氏菌作为检测对象，使用DNAgyrase subunit B为靶基因；

2、探针设计

本发明采用18-30bp的寡核苷酸探针。探针参数基本要求是特异性和高效性的杂交，应满足以下条件：①探针Tm值保持相近，在上下10℃范围内浮动；②形成二聚体和发夹结构的连续互补碱基数少于4个；③探针与非目标基因序列的连续匹配碱基数少于7个碱基；④探针与目标基因的错配碱基数少于4个碱基。

本发明针对海参致病菌黄海希瓦氏菌共设计2条探针，如表1所示：

表1探针信息表

3、探针合成

将表1的探针在5’端加上15个T的间隔臂，以减少DNA杂交时的空间位阻，提高杂交效率。同时在探针5’端进行氨基修饰，以备下一步与玻璃片上的醛基交联，将探针固定在玻片上。如表2所示：

表2

实施例2基因芯片的制作

利用实施例1设计的探针制备用于海参养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌黄海希瓦氏菌，具体步骤如下：

1、探针母液的配制

用双蒸水将合成的探针(表2)稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；

2、点样前的准备

取100μL移至96孔板的A1、B1、C1孔，在D1孔加入100μL点样缓冲液；

3、点样

用美国Bio-Dot公司的AD1500基因芯片点样仪按照预先设定好的程序在醛基化基片上进行非接触式点样；每点点样量为0.5μL，点直径为200μm，点心间距为1.5mm，点样时环境相对湿度55-65％，温度23℃；

4、基因芯片的制备

将表2中经合成的检测探针以点阵形式分布在醛基基片上，每条探针重复3次；

5、点样后的处理

将点完样的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测海参致病菌黄海希瓦氏菌的基因芯片。

实施例3

用于检测海参养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌黄海希瓦氏菌基因芯片(实施例2制备的)的使用方法，具体步骤如下：

1、待测样品采集及处理

将获得的水样用8μm无菌滤膜除去杂质，之后用0.22μm的滤膜过滤并收集滤膜，用无菌铝箔包裹，-20℃下保存；

泥样取自养殖环境底部2-5cm处底泥100g，采集样品于冰盒中运送至实验室；

动物样品用无菌剪刀剪取，无菌水冲洗3次，装入冻存管，放入液氮保存。

2、模板DNA制备

水样和泥样DNA分别用OMEGA水样DNA提取试剂盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，动物样品致病菌DNA用天根细菌基因组试剂盒提取。

3、引物和探针的设计

从黄海希瓦氏菌相应基因序列以及部分相邻菌种的上述基因的序列，进行多基因序列比对，对每种致病菌引物进行设计，从而建立了由2条寡核苷酸探针和1对引物组成的检测海参养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌黄海希瓦氏菌基因芯片。

表3强壮弧菌的靶基因的扩增引物

所述的样品PCR扩增步骤中扩增体系为：PCR Mix12.5μL；上游引物(20μmol/L)0.2μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模板DNA 1μL；ddH₂O 10.3μL；扩增程序为：①95℃5min；②95℃30s；③61℃30s；④72℃45s，返回到②35个循环；⑤72℃10min；⑥4℃保存。

4、PCR扩增

(1)PCR反应体系

将表4中所示试剂分别加入PCR管中，震荡混匀，瞬时离心。

表4 PCR反应体系

(2)PCR反应条件

将以上提取的DNA作为PCR扩增模板，分别以对应的引物和PCR扩增条件进行反应，用1％琼脂糖凝胶电泳检测、观察PCR扩增效果。

表5 PCR反应条件

5、荧光标记PCR产物

(1)取各模板PCR合并后的产物8μL于无菌的0.2mL离心管中，作为模板；

(2)向每个样品管中加入杂交缓冲液8μL和1μL阳控，震荡混匀，瞬时离心；

(3)将离心后的样品管放入PCR仪，99℃变性3min，立即冰浴3min，瞬时离心，然后，进行下一步芯片杂交。

6、杂交

(1)芯片预杂交

①将预杂交缓冲液在50℃预热；

②预杂交缓冲液与鲑精DNA按照体积比10:1的比例混合，置于PCR仪上99℃变性5min，立即冰浴3min，然后用移液器加到芯片的点样区，用适当大小的原位杂交专用盖玻片覆盖点样区；

③将芯片放入湿盒，置于水浴锅，65℃，1h；预杂交结束后，用ddH2O冲洗，后离心干燥。

(2)样品与芯片杂交

①将芯片正面朝上，平放于桌面，将芯片围栏贴于各点样区之间，放上芯片盖片(有凸台的一面朝向芯片)，上端先接触芯片，再缓缓盖下；

②用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入16μL荧光标记后的样品，样品会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凹台和芯片表面之间形成一道液膜；(注意：不要震动盖片或芯片，以免破坏液膜。)

③将芯片放入湿盒，置于水浴锅，65℃，2h，避光；

④杂交完毕的芯片依次用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)、洗液B(0.2×SSC)、洗液C(0.1×SSC)在振荡培养箱中150r/min各洗15min。

7、扫描芯片

芯片洗涤完毕后，离心干燥，放于微阵列芯片扫描仪上检测，电脑收集数据。

8、结果判定

一个有效的杂交结果要符合二点要求：(1)空白点的信号平均值，即背景平均值要小于10；(2)质控点信号的平均值要高于背景平均值10倍以上。阳性杂交信号还要符合：(1)阳性点的信号平均值要高于背景平均值10倍以上；(2)阳性点与质控点的平均值比值要在0.4以上。非特异性信号的判定标准为：(1)阳性点与质控点的平均值比值要小于0.35；(2)非特异性点的信号平均值要小于8倍的背景平均信号值。

实施例4

将实施例2制备得到的用于检测海参致病菌黄海希瓦氏菌的基因芯片的特异性效果验证将SM1、SM2探针以点阵形式分布在醛基基片上，每条探针重复3次，做成基因芯片。

将海参致病菌黄海希瓦氏菌实验菌株靶基因的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后再进行杂交显色，用于基因芯片特异性验证。验证结果如图1所示。这2条探针都能特异性结合海参致病菌黄海希瓦氏菌的靶基因，无非特异性杂交信号。因此，所有自主设计的探针具有高度的特异性。

实施例5

将实施例2制备得到的用于检测海参养殖区环境及生物体中重要的致病菌黄海希瓦氏菌的基因芯片的具体应用效果检测

采用模式菌株：黄海希瓦氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌；用SM1、SM2探针制作的基因芯片利用发明方法进行检测；

其中，黄海希瓦氏菌的检测结果如图3所示，在相应SM1、SM2探针的点样位置，有特异性信号；而以副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用本发明的探针进行检测，均没有特异性信号，其检测结果如图4所示。

从海参养殖池的随机选取海参样品用无菌剪刀剪取，无菌水冲洗3次，然后用天根细菌基因组试剂盒提取海参致病菌DNA，用SM1、SM2探针制作的基因芯片利用本发明方法进行检测，在基因芯片的相应SM1、SM2探针点样位置，具有特异性信号(其检测结果与图3相同)，该样品海参致病菌黄海希瓦氏菌呈阳性。将本发明的基因芯片对海参致病菌黄海希瓦氏菌进行灵敏度评价，将海参致病菌黄海希瓦氏菌进行梯度稀释，基因芯片检测下限为650拷贝的基因组DNA，检测灵敏度和PCR相当。

从预养殖海参的养殖池内将获得的水样用8μm无菌滤膜除去杂质，之后用0.22μm的滤膜过滤并收集滤膜，用无菌铝箔包裹，-20℃下保存；泥样取自养殖环境底部2-5cm处底泥100g，采集样品于冰盒中运送至实验室；水样和泥样DNA分别用OMEGA水样DNA提取试剂盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，将水样和泥样中提取的DNA用SM1、SM2探针制作的基因芯片利用本发明方法进行检测，在基因芯片的相应SM1、SM2探针点样位置，具有特异性信号(其检测结果与图3相同)，该样品养殖区海参致病菌黄海希瓦氏菌呈阳性。

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连海洋大学

<120> 一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法

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<170> PatentIn version 3.5

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