一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法与流程

文档序号:12413148阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法,其特征是:

具体步骤如下:

(1)基因芯片的制作

用于检测的两组探针SM1和SM2,探针序列如下:

SM1(5’-3’):CTTCTCGGATGTCGAGTTCCACTTCGA;

SM2(5’-3’):TCTGAAAAGCTACAGTTAACCATTCGTCGT;

将SM1和SM2在5’端加上15个T的间隔臂,并在探针5’端进行氨基修饰;用双蒸水将经氨基修饰的探针稀释成100μmol/L的母液,再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L;使用点样仪在醛基化基片上进行非接触式点样,然后将点样后的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内,密闭后静置于30℃烘箱过夜,得到用于检测海参致病菌黄海希瓦氏菌的基因芯片;

(2)待测样品DNA提取

将环境中的水样、泥样或生物样品进行取样,然后提取待测样品的DAN,备用;

(3)样品PCR扩增

用于黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)引物是:

SM1和SM2探针使用的引物基因序列如下:

上游引物:TGCACGCGGGTGGTAAGT;

下游引物:TGAGGTAATCAACAAAGGCAC;

将步骤(2)提取的样品的DNA作为扩增模板,以探针对应的引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;

(4)PCR扩增产物与芯片杂交

将PCR扩增产物进行荧光标记,将基因芯片进行预杂交,然后,将经荧光标记后的PCR扩增产物与经预杂交的基因芯片进行杂交,离心干燥后,放于微阵列芯片扫描仪上检测,收集检测结果。

2.根据权利要求1所述的海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法,其特征是:步骤(3)进行PCR扩增时,首先在95℃预变性5min;然后95℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环;最后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法,其特征是:预杂交时,使用鲑精DNA用预杂交缓冲液稀释后进行预杂交。

4.根据权利要求1所述的海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法,其特征是:预杂交缓冲液与鲑精DNA的体积比为10:1。

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