一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，提供了一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法。
背景技术：
：近年来，我国环境污染日益严重，成为当前人类面临的一个重大问题。特别是工业及生活污水中的氨氮污染，可以引起水体富营养化和水体生态系统紊乱等一系列问题。生物硝化脱氮是目前水处理领域研究的热点，由硝化作用和反硝化作用共同完成，其中硝化作用分为两个阶段，首先由亚硝化细菌把氨氮氧化为亚硝酸盐氮，然后由硝化细菌把亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。但是目前已运行的生物硝化脱氮池达标率不高，解决问题的关键在于提高池内亚硝化细菌和硝化细菌的生物量及其活性，这就需要一个快速检测亚硝化细菌和硝化细菌的方法，用以指导生物硝化池的运行。通常所用的亚硝化细菌鉴定方法一般为16SrDNA扩增法，早在很久之前该方法就普遍用于细菌菌种的鉴定。该法以细菌16SrDNA区域通用引物作为扩增引物，PCR扩增结束后要把PCR产物测序、比对后才只能将菌种鉴定到属，这样用通用引物进行的PCR扩增结果特异性不高，而且还延长了菌种鉴定的周期，达不到快速检测的目的。因此找寻针对亚硝化细菌PCR鉴定方法的最佳PCR条件成为本领域技术人员难以解决的问题。技术实现要素：本发明针对上述技术存在的不足，提供了一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法，以亚硝化细菌的专属特征性基因-氨单加氧酶基因(amoA)为模板设计合成一对特异性引物，并以亚硝化细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过对PCR扩增条件优化，然后对PCR扩增产物进行琼脂糖水平电泳，根据电泳泳道中条带的有无及大小，判断该细菌菌株是否属于亚硝化细菌或者混合菌群中是否含有亚硝化细菌。本方法是以用氨单加氧酶基因为模板设计的特异引物为PCR扩增引物，实验结果特异性强，实验操作简单，结果可靠性高，并通过优化PCR扩增条件缩短了亚硝化细菌的鉴定周期，较常规PCR扩增时间缩短26％以上，为亚硝化细菌种群的鉴定提供了一个快速、有效的鉴定方法。现有技术中PCR扩增在PCR仪内完成，而扩增条件基本一致，这已成为了本领域的基本常规操作，但是发明人发现针对本发明的目的，常规的PCR扩增条件难以适应，存在准确率较低且扩增时间较长的缺陷，难以适应本发明的要求，故此发明人针对这一缺陷对PCR扩增条件进行了改进。本发明的具体技术方案如下：⑴引物的设计与合成：以亚硝化细菌的专属特征性基因氨单加氧酶基因(amoA)为模板，根据引物设计原则，利用primer5.0软件设计并合成一对特异性引物，引物具体序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌种基因组DNA的提取：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测菌种的基因组DNA；⑶PCR扩增体系：分别以步骤(1)中合成的特异引物为PCR扩增引物，以步骤(2)中提取的基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系(25ul)如下：试剂名称加样量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因组DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O补足25ul⑷PCR扩增反应条件：PCR扩增体系准备好后，以引物的退火温度为53℃设定PCR扩增的反应条件，具体反应条件如下：⑸琼脂糖水平电泳：观察是否含有大小为526bp目标条带，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有则判定为试样中含有亚硝化细菌。与现有技术相比，本发明的最大特点就是针对亚硝化细菌设计了特异性引物，更为主要的就是针对本发明的目的优化了常规的PCR扩增条件，利用本发明提供的这种方法，较之常规的检测方法具有灵敏度高，特异性强，操作简单快捷，检测时间短，准确性高等优点；与现有技术对比可知，本发明的PCR扩增条件中的温度较之常规扩增温度均有所降低，且循环数由常规的30个降低到25个，且各步骤时间都较之现有技术有明显的缩减，在这种情况下，其准确度依然高于采用16SrDNA法常规扩增条件(94℃3min，94℃30s、55℃30s、72℃50s(30个循环)，然后72℃10min)，可见这种扩增条件对于本发明的要求是最佳的选择方案，总体时间较之现有技术缩短了26％，且准确度大大提高。综上所述，本发明是以用氨单加氧酶基因为模板设计的特异引物为PCR扩增引物，实验结果特异性强，实验操作简单，结果可靠性高，并通过优化PCR扩增条件缩短了亚硝化细菌的鉴定周期，较常规PCR扩增时间缩短26％以上，为亚硝化细菌种群的鉴定提供了一个快速、有效的鉴定方法。附图说明图1为样品1PCR结果水平电泳图，左泳道为Maker2000，条带从上至下大小分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道为样品1扩增产物；图2为样品2PCR结果水平电泳图，左泳道为Maker2000，条带从上至下大小分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道为样品2扩增产物；图3为样品3PCR结果水平电泳图，左泳道为Maker2000，条带从上至下大小分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道为样品3扩增产物；图4为比较例中16srDNA常规鉴定法的鉴定结果水平电泳图，左泳道为Maker2000，条带从上至下大小分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道为样品3扩增产物；可见其扩增产物为一条大小为1424bp的目标条带，因此只能定性检测细菌的存在，无法确定所检测细菌的种类。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。实施例1一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法样品来源：石化常减压装置污水，经去酚脱硫处理后进入生化处理池，选用此处理池废水为样品1。样品检测：⑴引物的设计与合成：以亚硝化细菌的专属特征性基因氨单加氧酶基因(amoA)为模板，根据引物设计原则，利用primer5.0软件设计并合成一对特异性引物，引物具体序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌种基因组DNA的提取：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述样品1废水中的基因组DNA；⑶PCR扩增体系：分别以步骤(1)中合成的特异引物为PCR扩增引物，以步骤(2)中提取的基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系(25ul)如下：试剂名称加样量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因组DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O补足25ul⑷PCR扩增反应条件：PCR扩增体系准备好后，以引物的退火温度为53℃设定PCR扩增的反应条件，具体反应条件如下：⑸琼脂糖水平电泳：观察是否含有大小为526bp目标条带，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有则判定为试样中含有亚硝化细菌，结果如图1所示，可见样品1中含有亚硝化细菌。实施例2一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法样品来源：硫脲化工装置废水，经去残留硫脲处理后进入生化处理池，选用此处理池废水为样品2。样品检测：⑴引物的设计与合成：以亚硝化细菌的专属特征性基因氨单加氧酶基因(amoA)为模板，根据引物设计原则，利用primer5.0软件设计并合成一对特异性引物，引物具体序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌种基因组DNA的提取：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品2废水中的基因组DNA⑶PCR扩增体系：分别以步骤(1)中合成的特异引物为PCR扩增引物，以步骤(2)中提取的基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系(25ul)如下：试剂名称加样量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因组DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O补足25ul⑷PCR扩增反应条件：PCR扩增体系准备好后，以引物的退火温度为53℃设定PCR扩增的反应条件，具体反应条件如下：⑸琼脂糖水平电泳：观察是否含有大小为526bp目标条带，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有则判定为试样中含有亚硝化细菌；结果如图2所示，可见样品2中含有亚硝化细菌。实施例3一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法样品来源：农化醚酯装置废水，经去硫化物及大分子有机烃后进入生化处理池，选用此处理池废水为样品3。样品检测：⑴引物的设计与合成：以亚硝化细菌的专属特征性基因氨单加氧酶基因(amoA)为模板，根据引物设计原则，利用primer5.0软件设计并合成一对特异性引物，引物具体序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌种基因组DNA的提取：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品3废水中的基因组DNA⑶PCR扩增体系：分别以步骤(1)中合成的特异引物为PCR扩增引物，以步骤(2)中提取的基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系(25ul)如下：试剂名称加样量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因组DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O补足25ul⑷PCR扩增反应条件：PCR扩增体系准备好后，以引物的退火温度为53℃设定PCR扩增的反应条件，具体反应条件如下：⑸琼脂糖水平电泳：观察是否含有大小为526bp目标条带，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有则判定为试样中含有亚硝化细菌。结果如图3所示，可见样品3中含有亚硝化细菌。比较例以样品3为例，比较本专利发明的快速PCR鉴定法与16srDNA常规鉴定法的鉴定效率16srDNA常规鉴定法样品检测：⑴引物：在16srDNA法细菌鉴定的发展与使用过程中，专家学者在16srDNA保守区设计了多对引物并被证明可行，这些引物被用于细菌16s法鉴定的通用引物，本实验选择27F和1492R(本领域常规引物)作为扩增引物，序列如下：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTT。⑵菌种基因组DNA的提取：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品3废水中的基因组DNA⑶PCR扩增体系：分别以步骤(1)中的通用引物为PCR扩增引物，以步骤(2)中提取的基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系(25ul)如下：试剂名称加样量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因组DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O补足25ul⑷PCR扩增反应条件：PCR扩增体系准备好后，以引物的退火温度为53℃设定PCR扩增的反应条件，具体反应条件如下：⑸琼脂糖水平电泳：通过PCR扩增并进行水平电泳得到一条大小为1424bp的目标条带，电泳结果如图4所示。然后对该条带进行测序，其核苷酸序列SeqIDNo:4，并输入NCBI基因数据库进行比对，根据比对结果判断该试样中是否含有亚硝化细菌。两种方法扩增效率比较：扩增时间比较：本专利发明的快速PCR鉴定法扩增时间为72min14s；16srDNA常规鉴定法的扩增时间为98min48s。在扩增时间上本专利发明的快速PCR鉴定法较常规鉴定法节省时间26％以上；PCR产物测序：利用本专利发明的快速PCR鉴定法扩增产物测序结果序列如SeqIDNo:3所示；将其输入NCBI基因数据库进行比对，比对结果为Nitrosomonas：亚硝化细菌；将利用16srDNA常规PCR鉴定法扩增产物测序结果序列输入NCBI基因数据库进行比对，无结果。通过比较发现，本专利发明的快速PCR鉴定法成功鉴定出亚硝化细菌，而16srDNA常规PCR鉴定法的鉴定结果无法准确检测出所测细菌的种类，分析原因为样品中菌种不纯，再加上16srDNA通用引物特异性较差无法特异性检测亚硝化细菌导致，同时通过图1-3可见，本发明所提供的特异性引物针对性极强，在扩增时不会出现其他杂质条带，准确率较之现有技术明显提高，可见本发明所提供的鉴定方法特异性强，实验操作简单，结果可靠性高，并通过优化PCR扩增条件缩短了亚硝化细菌的鉴定周期，较常规PCR扩增时间缩短26％以上，为亚硝化细菌种群的鉴定提供了一个快速、有效的鉴定方法。<110>黄河三角洲京博化工研究院有限公司<120>一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法<160>4<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1ggggtttctactcctggt18<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cccctcgggaaagccttcttc21<210>3<211>526<212>DNA<213>人工序列<400>3tcccctctgctgcactctagtcttgtagtttcaaacgcaattcccaggttaagcccgggg60atttcacatctgacttgcaaaaccgcctgcgcaccctttacgcccagtaattccgattaa120cgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgctttttctgt180cggtaccgtcataaatcatgattatttgtcatgattttttctttccgactaaaagagctt240tacaacccgaaggccttcttcactcacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgt300ccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtgg360ttggtcgtcctctcagaccaactactgatcgttgccttggtgagcctttacctccccaac420tagctaatcagacatcggccgctcctttggcgcaaggtctttcgatcccctgctttcctc480cttagagatatgcggtattagcacatctttcgctgcgttattccca526<210>4<211>1424<212>DNA<213>人工序列<400>4atacatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtg60agtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaata120ccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttac180agatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgc240gtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctac300gggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgt360gagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttca420aatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcag480ccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcag540gcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaact600ggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtaga660gatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagc720gaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagt780gctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcc840tggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggt900ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctg960acaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtc1020gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctta1080gttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtg1140gggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggac1200agaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcg1260gatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcat1320gccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgt1380aacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccga1424当前第1页1 2 3