本发明涉及生物检测技术领域，是一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
养鹿业是中国特种动物养殖的支柱产业之一，鹿茸、鹿角盘、鹿胎等作为传统中药，在中医治疗和保健中被日益广泛应用。但目前鹿群中结核病(Tuberculosis，简称TB)的防控防治依然没有得到有效控制，这不仅关系到广大养殖场的经济产值，对人结核病的防控也有重要影响。作为一种人畜共患病，鹿结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌引起的慢性、消耗性传染病，该病主要由牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌所引起的，是OIE规定必须强制报告的B类动物疫病。鹿临床症状为极度消瘦、弓背、体表淋巴结肿大、呼吸困难、共济失调、个别瘫痪，尤其是死亡率高。因此，除了防疫部门应加强防控,及时了解和掌握结核病在鹿群中的传播状况以防止疫病扩散外，必须加强对该病的监测，从而有效控制其发生与流行，从本质上将其根除。
传统检测方法：如血清学方法、病原体分离法和核酸检测方法等各有其局限性，使得对传染病的早期监控和跟踪水平停滞不前。病原菌的细菌学检查由于操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器等优点已经成为目前结核病实验室诊断的金标准。但假阳性和病原体分离繁琐费时的缺点限制了此法的诊断价值。核酸法由于检测敏感、准确、快速而日益受关注，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、生物探针和基因芯片等，但都需要相应的检测设备且检测费用高未能广泛推广。因此，找到一种合适的快速诊断方法势在必行。
一种特异性等温扩增RNA的技术核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)在病原体已经有成功应用的报道，它是由一对特异性引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在41℃恒温下进行,借助AMV逆转录酶、RNaseH和T7RNA聚合酶的协同作用下可在2h内将模板RNA扩增约109-12倍，且无需PCR仪等特殊仪器，避免了PCR仪造成的PCR扩增结果重复性差的问题，也容易在检测部门普及应用。此外，NASBA技术的高灵敏度和高特异性优势也是疫情监控的理想武器。相对环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplifcation assay，LAMP)和常规PCR技术，在结核病中的检测其灵敏度更强。这种系列试剂盒的出现和推广将使我国的动物及人兽共患重大传染病的早期监控系统更完善，并大大减少误诊率。
NASBA技术已广泛应用于HIV-1型病毒、狂犬病病毒、禽流感病毒等病原体的快速检测，也曾用于人结核分枝杆菌的检测，该方法的灵敏度仅为100CFU/mL，但基于应用对象的差异，本发明根据鹿中结核分枝杆菌设计了特异性的引物和探针，将高效的NASBA恒温扩增和简便的酶联检测方法完美结合，研发出高效的NASBA鹿结核病原体分子筛查诊断系统也称分子诊断试剂盒(简称NASBA-MP)，在短时间内对鹿结核病原体进行高灵敏度筛查，其灵敏度达到1CFU/mL，明显高于NASBA技术对人结核分枝杆菌的检测，同时，此试剂盒也适用于牛型和人型结核病原体的多重检测。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，效果佳，应用价值高的鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒。并提供其检测方法。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的：
一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒，其特征是，它包括如下体系：
1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：
(a)TB基因的一对特异性引物
IS6110-F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGAACGGAAAGGTCTCTTCGG-3’，其中TGATGCAAGGTCGATATGAG与检测探针一致，
IS6110-R:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTCATCCCACACCGCTAAAGC-3’，其中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAG为T7启动子序列，
(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为40mmol/L,pH8.5，NTP为10mmol/L，dNTP为1mmol/L，MgC12为10mmol/L，KCl为120mmol/L，DTT为5mmol/L，DMSO为100g/L；
(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；
2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：
(a)TB基因的探针
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-AGTAACACGTGGGTGATCTGC-3’，
检测探针：5’-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG-3’；
(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0l25mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；
(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/L Tris-HCl、pH8.5，1﹪(W/V)BSA；
(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；
(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂
杂交洗液：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；
显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O,加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；
终止液：0.5mol Na2CO3溶液。
一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测方法，其特征是，它包含下述步骤：
(1)设计并人工合成引起鹿结核病的常见两种病原体的多重检测引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：
(a)TB基因的一对特异性引物
IS6110-F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGAACGGAAAGGTCTCTTCGG-3’，其中TGATGCAAGGTCGATATGAG与检测探针一致，
IS6110-R:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTCATCCCACACCGCTAAAGC-3’，其中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAG为T7启动子序列，
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-AGTAACACGTGGGTGATCTGC-3’，
检测探针：5’-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG-3’；
(2)NASBA扩增模板牛型结核分枝杆菌RNA的制备
将牛结核分枝杆菌菌株ATCC27289(BCG)，购自北京中原经贸公司ATCC菌种保存中心中国代理，转移至研磨管中,加入少许生理盐水，用磨棒磨成悬液后转移至改良罗氏培养基上，37℃培养3～5周；
5ml离心管中选取部分菌落悬浮于PBS、pH 7.4溶液中，使每毫升溶液细胞浓度达到1×109，然后分别取1ml培养液于1.5ml离心管中80灭活20min，12000r/min离心2min,弃上清液；
加入冰冷的1：3比例的甲醇氯仿混悬液500μL，涡旋振荡60S，立刻加入Trizol试剂2mL，再涡旋振荡10s，冰浴10min；
4℃，120000r/min，离心15min，轻取上层水相，加入等量的冰冷异丙醇轻轻混匀，－20℃静置1h；
4℃，10000r/min，离心10min，弃上清；
70％乙醇洗两次，6000r/min，离心3min，弃清液，自然干燥；
加50μLDEPC处理的TE溶液溶解；
(3)NASBA扩增反应体系及程序：
(a)NASBA扩增反应液制备：10μL扩增反应液包含1mmol/L dNTP，10mmol/L NTP，40mmol/L Tris-HC1、pH8.5，10mmol/L MgC12，120mmol/L KCl，5mmol/L DTT，100g/L DMSO，上、下游引物各0.2μmol/L；
(b)酶反应液制备：5μL酶反应液包含40U SupeScript II反转录酶，80U T7RNA聚合酶，0.2U核糖核酸酶H和20U RNA酶抑制剂；
(c)扩增反应体系及程序采用20μL体系：反应管中加入10μL扩增反应液，再加入0.5μL结核分枝杆菌总RNA，65℃加热2min以去除RNA的二级结构，41℃冷却2min,同时以无菌水做阴性对照；
立即加入5μL酶反应液，轻弹混匀，41℃反应90min，冰浴2min终止反应，置于-20℃贮存备用；
(4)酶标板的制备：
(a)酶标板包被液制备：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0l25mg/mL浓度；
(b)酶标板封闭液制备：0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；
(c)酶标板制备：96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板3～5次，4℃避光保存备用；
(5)NASBA扩增产物ELISA检测：
(a)杂交反应：每孔中各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用TBST洗板3～5次，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1：5000稀释，室温反应至少30min，TBST洗板3～5次；
(d)显色反应：每孔加入100μL pNPP进行显色，室温避光显色10min，立即加入100μL碳酸钠终止显色反应，酶标仪测定OD405数值，OD≥0.27为阳性，OD<0.27为阴性。
本发明的一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法，根据牛型和人型结核分枝杆菌的保守区序列16srRNA设计了一对特异性引物，可同时对两种结核分枝杆菌进行快速诊断。与现有核酸等技术相比，本发明的优势在于：
1.简单快速、易于推广，无需昂贵的核酸扩增反应装置，恒温水浴锅42℃反应1h左右即可，且操作方法容易掌握；
2.精确度高，特异性强，其避开了常规PCR的高温变性步骤，相对于RT-PCR和LAMP错配率较低；
3.灵敏度高，重复性好，效果佳，应用价值高，是RT-PCR灵敏度的10倍，相对NASBA对人结核分枝杆菌的检测，优化后引物和探针检测鹿结核分枝杆菌灵敏度显著提高且重复性更好。
附图说明
图1鹿中结核分枝杆菌RNA基因提取电泳图
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
本发明的一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒，包括如下体系：
1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：
(a)TB基因的一对特异性引物
IS6110-F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGAACGGAAAGGTCTCTTCGG-3’，其中TGATGCAAGGTCGATATGAG与检测探针一致，
IS6110-R:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTCATCCCACACCGCTAAAGC-3’，其中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAG为T7启动子序列；
(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为40mmol/L,pH8.5，NTP为10mmol/L，dNTP为1mmol/L，MgC12为10mmol/L，KCl为120mmol/L，DTT为5mmol/L，DMSO为100g/L；
(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；
2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：
(a)TB基因的探针
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-AGTAACACGTGGGTGATCTGC-3’，
检测探针，即通用探针：5’-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG-3’；
(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0l25mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；
(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/L Tris-HCl、pH8.5，1﹪(W/V)BSA；
(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；
(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂
杂交洗液：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；
显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O,加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；
终止液：0.5mol Na2CO3溶液。
本发明还提供了一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测方法，按如下的步骤进行：
实例1：结核分枝杆菌NASBA试剂盒特异性检测：
分别提取TB、HCV(丙型肝炎病毒)、HIV-1(人类免疫缺陷病毒-1)、HBV(乙肝病毒)的RNA，各取0.5μL RNA分别和10μL NASBA扩增反应液65℃加热2min，然后41℃冷却2min；立即加入5μL酶混合液轻弹混匀，ddH2O补足20μL反应体积，41℃反应90min,冰浴终止反应，用NASBA产物检测试剂进行ELISA检测。
结果只有TB的RNA检测结果为阳性，而其它病原体的检测结果均呈阴性，表明该试剂盒对TB的RNA的检测具有特异性。(见表1)
表1 TB-NASBA试剂盒特异性试验
Table1 The specific test of TB-NASBA Kit
实例2：结核分枝杆菌NASBA试剂盒灵敏性检测：
提取TB病毒总RNA，对初始浓度为1ng/μL TB的RNA进行10倍连续梯度稀释，每个梯度各取0.5μL模板RNA和10μL NASBA扩增反应液65℃加热2min，41℃冷却2min；立即加入5μL酶混合液混匀，ddH2O补足20μL体积，41℃反应90min,冰浴终止反应，ELISA检测NASBA产物。
结果表明TB的RNA稀释至l0-5时仍有阳性扩增产物，灵敏度为10fg,说明该试剂盒具有较高的敏感性。(见表2)。
表2 TB-NASBA试剂盒灵敏度试验
Table2 The sensitive test of TB-NASBA Kit
实例3：鹿结核分枝杆菌NASBA-ELISA试剂盒临床样本检测
(1)标本采集与保存：
取培养法检测为阳性的结核病鹿肺样28例，阴性的鹿肺样本30份(吉林省周边鹿场)。
(2)样品RNA的制备
(a)所有涉及RNA提取的塑料制品均用DEPC水结合灭菌处理，玻璃器皿经180℃烘烤6h，保证用品均无RNA酶，操作尽量在冰上进行。
(b)用1ml 4％NaOH研磨处理鹿肺样本，37℃孵育30min，期间分隔3分钟振荡一次,12000r/min离心5min,去上清，沉淀加1ml灭菌去离子水震荡混匀(重复3次)。
(c)4℃，13000r/min，离心8min，弃上清并尽量吸干液体，加入无菌的1ml生理盐水重悬洗涤沉淀。
(d)4℃，13000r/min，离心10min，期间根据溶解情况适当旋涡振荡，弃上清。
(e)加入冰冷的1：3比例的甲醇氯仿混悬液500μl(现用现配)，涡旋振荡60S，立刻加入Trizol试剂2ml，再涡旋振荡10s，冰浴10min。
(f)4℃，120000r/min，离心15min，此时将看到样品被分层。
(g)轻取上层水相于新的EP离心管中，加入等量的冰冷异丙醇轻轻混匀，－20℃静置1h。
(h)4℃，10000r/min，离心10min，弃上清。
(i)70％乙醇洗2次，4℃，6000r/min，离心3min，弃清液后自然干燥。
(j)加50μl DEPC处理的TE溶液溶解。
(3)NASBA扩增反应程序
PCR管中加入10μL扩增反应液，再加入0.5μL结核分枝杆菌总RNA，65℃加热2min以去除RNA的二级结构，41℃冷却2min，立即加入5μL酶反应液，轻弹混匀，41℃反应90min，冰浴2min终止反应。
(4)NASBA扩增产物的ELISA检测
96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板3～5次，4℃避光保存备用。
每孔各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用TBST洗板3～5次。
每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1：5000稀释)，室温反应至少30min，TBST洗板3～5次。
继续向每孔加入100μL pNPP进行显色，室温避光显色10min，立即加入100μL碳酸钠终止显色反应，酶标仪测定OD405数值。
(5)ELISA检测结果判定
采用结核分枝杆菌NASBA-ELISA试剂盒对培养法确诊为阳性的结核分枝杆菌鹿肺样本28例和阴性的结核分枝杆菌的正常鹿肺样本30份临床样本进行检测。确诊为阳性的样本检出25份，敏感性为89.28％；阴性样本未检出，特异性为100.00％，说明优化后的引物和探针对NASBA-ELISA试剂盒应用于鹿中结核分枝杆菌的检测具有较高灵敏度和特异性。
结论：本发明首次将NASBA联合ELISA方法应用于鹿中结核分枝杆菌的检测，虽然曾有将NASBA技术应用于人型结核分枝杆菌的报道，其检测灵敏度为85.7％；但本发明针对鹿中结核分枝杆菌的检测优化了引物和探针，开发的NASBA-ELISA试剂盒具有较高灵敏度和特异性，较常规PCR法更适合于检测鹿中结核分枝杆菌临床样品，且NASBA对设备要求更低，便捷性更高。该试剂盒因其高特异性、所需设备简单和操作快速的优点，可以广泛应用到病原体防控的一线部门，易于推广和使用；且结核分枝杆菌NASBA检测试剂盒能一次性检测两种相关结核分枝杆菌病原体，实现多重化筛查；提高检测效率、降低检测成本。